양극 TaO x 나노튜브 어레이의 향상된 생체적합성

초록

이 연구는 먼저 자기 조직화된 TaO_{x의 생체 적합성을 조사합니다.} 전기화학적 양극산화에 의해 제조된 다양한 나노튜브 직경을 갖는 나노튜브 어레이. 양극 산화 처리된 모든 TaO_x 나노튜브는 비정질 상으로 확인되었다. TaO_{x를 사용한 표면 습윤성의 전환} 나노튜브 직경은 기하학적 거칠기 측면에서 Wenzel의 모델을 기반으로 설명할 수 있습니다. 시험관 내 생체 적합성 평가는 섬유아세포가 TaO_{x에 대한 명백한 습윤성 의존적 거동을 나타낸다는 것을 추가로 나타냅니다.} 나노튜브. 35nm 직경 TaO_x 나노튜브 어레이는 모든 샘플 중에서 가장 높은 생체 적합성을 나타냅니다. 이 향상은 TaO_{x가 제공하는 고밀도 초점에 기인할 수 있습니다.} 더 높은 표면 친수성 때문에 나노튜브. 이 연구는 TaO_{x를 형성함으로써 Ta의 생체적합성이 향상될 수 있음을 보여줍니다.} 적절한 나노튜브 직경과 기하학적 거칠기를 가진 표면에 나노튜브 어레이.

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배경

탄탈륨(Ta)은 희귀하고 단단하며 내부식성이 높은 생체 비활성 금속입니다[1,2,3]. 탄탈륨 재료의 산화는 표면에 매우 얇고 침투할 수 없는 산화막을 형성하여 생체 적합성에 기여합니다. 탄탈륨의 높은 유연성과 생체 적합성은 치과 임플란트, 정형 외과 임플란트 및 뼈 재건과 같은 임상 응용 프로그램을 제공합니다 [4,5,6]. 최근 탄탈륨은 티타늄보다 더 풍부한 세포외 기질 형성, 우수한 세포 부착 및 성장, 표면의 훨씬 높은 살아있는 세포 밀도와 같이 생체 적합성이 더 우수한 것으로 밝혀졌습니다[7,8,9]. 한편, 나노구조 표면 기하학의 독특한 물리화학적 특성이 세포 거동에 영향을 미치는 주요 요인이라는 것이 여러 연구에서 입증되었다[10,11,12]. 이상적인 생체 재료 표면은 세포 성장을 위한 최적의 환경을 제공할 수 있어야 합니다. Ruckh et al. 양극 처리된 Ta 나노튜브는 평평한 표면과 비교할 때 향상된 골유착을 위한 기질을 제공한다는 것을 입증했습니다[13]. 최근 개발된 다공성 탄탈륨 재료는 뼈의 특성을 모방하여 부드러운 조직과 뼈의 내부 성장을 가능하게 하여 우수한 생물학적 고정을 제공합니다[14,15,16,17]. 다공성 탄탈륨의 높은 안정성과 치유 가능성은 재건 수술 중 뼈 구조 사이의 간격을 융합하는 데 도움이 됩니다. 따라서 다공성 탄탈륨은 기증자 이환율이 없고, 높은 안정성, 우수한 골유착 특성 및 잠재적인 감염성 질병의 전파 위험 예방과 같은 다른 이식편에 비해 여러 장점으로 인해 생체 재료 분야에서 많은 관심을 회복했습니다[18,19,20 ,21]. 최근 임상 검토에 따르면 다공성 탄탈륨 비구 컵을 받은 환자는 수산화인회석으로 코팅된 티타늄(Ti) 컵을 받은 환자에 비해 임플란트 고정 정도가 더 높았습니다[22,23,24,25].

최근에는 자체 조직화된 TiO₂를 개발했습니다. 전기화학적 양극산화 방법을 이용하여 직경이 다른 나노튜브를 제조한다[26, 27]. 우리는 인간 섬유아세포가 초임계 CO₂에서 직경에 따른 더 분명한 행동을 보인다는 것을 발견했습니다. (ScCO₂ ) 처리된 나노튜브는 양극산화 처리된 나노튜브보다 더 우수합니다[27]. 우리는 Ag로 장식된 TiO₂를 추가로 제작했습니다. 전자빔 증발법으로 나노튜브를 분석한 결과 가장 작은 직경(25nm 직경)의 Ag로 장식된 나노튜브가 인간 섬유아세포와 인간 비강 상피 세포의 부착 및 증식 촉진에 있어 가장 명백한 생물학적 활성을 나타냈다[26]. 이 연구에서 우리는 TaO_{x를 제작했습니다.} 유사한 전기화학적 양극산화 방법에 의해 직경이 다른 나노튜브. TaO_{x 직경에 따른 세포 부착 및 증식을 포함한 세포 거동} 나노튜브를 조사했다. 이 연구의 목적은 자기 조직화된 TaO_{x의 생체 적합성을 연구하는 것입니다.} 전기화학적 양극산화에 의해 제작된 다양한 나노튜브 직경을 갖는 나노튜브 어레이.

방법

TaO의 준비_x 나노튜브

Ta 시트는 ECHO Chemical(두께 0.127mm, 순도 99.7%, CAS 번호 7440-25-7)에서 구입했습니다. 양극 산화 공정 전에 Ta 시트를 아세톤, 이소프로판올, 에탄올 및 물에서 초음파로 세척했습니다. 모든 양극 산화 실험은 시약 등급 화학 물질과 탈이온수로 제조된 4.9wt% HF를 포함하는 황산 용액에서 20°C에서 수행되었습니다. Ta를 양극으로, Pt를 상대 전극으로 하는 2전극 전기화학 전지를 사용했습니다. 전압은 10V에서 40V로 조정되어 TaO_{x가 되었습니다.} 20~90nm 범위의 나노튜브 직경. 저강도 UV 광선 조사(약 2mW/cm² ) TaO_{x에 형광등 검은색 전구 사용} 생체 적합성 테스트 전에 8시간 동안 나노튜브 샘플을 수행했습니다.

재료 특성화

TaO_{x의 표면 형태, 내경 및 외경, 벽 두께 및 길이} 나노튜브는 주사전자현미경(SEM)으로 특징지어졌다. 에너지 분산 분광계(EDS)가 장착된 X-선 회절(XRD) 및 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 TaO_{x의 결정 구조를 조사했습니다.} 나노튜브 어레이. TaO_{x의 표면 습윤성을 평가하기 위해 접촉각 측정을 수행했습니다.} 각도기 접안렌즈가 있는 수평 현미경을 사용하여 확장 방법으로 나노튜브 샘플을 채취합니다. 측정을 위한 시험액은 물과 배양액을 사용하였다.

인간 섬유아세포 배양

MRC-5 인간 섬유아세포(BRCC, Bioresource Collection and Research Center, Hsinchu, Taiwan, BCRC No. 60023)를 10cm 조직 배양 플레이트에 플레이팅하고 10% 소태아혈청(FBS)을 포함하는 Eagle's minimum essential medium(Gibco)으로 배양했습니다. ), 2mM l-글루타민, 1.5g/L 중탄산나트륨, 0.1mM 비필수 아미노산, 1.0mM 피루브산나트륨 및 5% CO₂ 37°C에서 그런 다음 세포를 고압 멸균 TaO_{x에 접종했습니다.} 추가 연구를 위해 12웰 배양 플레이트(Falcon)의 바닥에 시트를 놓습니다.

세포 접착 분석

세포는 각 TaO_{x에 시드되었습니다.} 2.5 × 10³ 밀도의 시트 셀/cm² 5% CO₂에서 배양 37°C에서 3일 동안 PBS로 두 번 헹구었습니다. 기질의 부착 세포를 실온에서 4% 파라포름알데히드에서 1시간 동안 고정한 다음, 인산완충식염수(PBS)로 2회 세척하고 15분 동안 PBS에서 0.1% Triton X-100(Sigma-Aldrich) 투과화 4°C PBS로 세척한 후 로다민 팔로이딘(Life Technologies)과 함께 실온에서 15분 동안 배양하여 액틴 필라멘트를 표지했습니다. 그런 다음 디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)(Thermo FisherScientific)과 함께 5분 동안 배양하여 세포 핵을 염색했습니다. 세포 부착 형태 및 세포 골격 배열을 조사하기 위해 형광 현미경(AX80, Olympus)으로 세포를 분석하였다. SEM 관찰을 위해 세포를 실온에서 1시간 동안 2.5% 글루타르알데히드 용액(Merck)으로 고정한 다음 PBS 용액으로 두 번 헹구고 일련의 에탄올(40, 50, 60, 70, 80, 90, 100)에서 탈수했습니다. %) 및 임계점 건조기(CPD 030, Leica)로 임계점 건조. SEM 관찰 전 샘플에 얇은 백금막을 코팅하였다.

세포 증식 분석

세포는 각 TO_{x에 시드되었습니다.} 1 × 10⁴ 밀도의 기판 셀/cm² 1주일 동안 배양합니다. 1주 후 샘플을 PBS로 2회 헹구고 WST-1 시약 키트(Roche, Penzberg, Germany)를 사용하여 세포 증식을 추정했습니다. 10% WST-1 세포 증식 시약을 포함하는 배지를 각 표본에 첨가하고 5% CO₂의 습한 분위기에서 배양했습니다. 2시간 동안 37°C에서 각 웰의 용액을 96웰 플레이트로 옮겼습니다. 용액의 흡광도는 분광광도계(Spectral Max250)를 사용하여 450nm에서 측정되었습니다.

통계 분석

모든 실험은 3중으로 진행되었으며 최소한 3번의 독립적인 실험을 수행하였다. 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시되었으며 SPSS 12.0 소프트웨어(SPSS Inc.)를 사용하여 분산 분석(ANOVA)에 의해 분석되었습니다. p <0.05의 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

결과 및 토론

그림 1a–e는 평평한 Ta 호일과 양극 산화 처리된 TaO_{x의 SEM 이미지를 보여줍니다.} 평균 나노튜브 직경이 각각 20, 35, 65, 90nm인 나노튜브 어레이. 양극 산화 처리된 모든 TaO_x 나노튜브는 잘 정의된 나노튜브 구조를 나타내며 나노튜브 직경은 인가된 전압에 거의 비례합니다. 이들 샘플 중 20nm 직경의 나노튜브는 그림 1b의 확대된 영역에서 볼 수 있듯이 상대적으로 불분명한 나노튜브 표면을 보인다. 이 관찰은 양극 산화 공정의 저전압 작동에서 약한 전계 강도에 기인할 수 있습니다. 그림 2는 모든 TaO_{x의 교차 세션을 추가로 보여줍니다.} 나노튜브 및 해당 나노튜브 길이. XRD 및 TEM 분석을 사용하여 TaO_{x를 추가로 식별했습니다.} 나노튜브 결정도. 그림 3a의 XRD 스펙트럼에서 볼 수 있듯이 Ta 호일과 관련된 피크만 관찰되며(JCPDS 카드 번호 04–0788), 양극 산화 처리된 TaO_x 나노튜브는 아마도 비정질 상일 수 있습니다. 그림 3b는 90nm 직경 TaO_{x에서 가져온 대표적인 TEM 이미지를 보여줍니다.} 양극 처리된 샘플에서 나노튜브가 벗겨져 잘 정의된 나노튜브 구조가 드러났습니다. 삽입된 부분의 흠집 없는 회절 패턴은 TaO_x 나노튜브는 비결정질입니다.

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a를 보여주는 SEM 이미지 Ta 포일 표면 및 자체 조직 TaO_x 직경이 b인 나노튜브 20, ㄷ 35, d 65 및 e 각각 90nm

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TaO_{x의 단면을 보여주는 SEM 이미지} a 직경의 나노튜브 20, b 35, ㄷ 65 및 d 각각 90nm

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아 양극 산화 처리된 TaO_{x의 XRD 스펙트럼} 다양한 직경의 나노튜브 및 b 양극 처리된 TaO_{x에서 가져온 TEM 이미지} 직경이 90nm인 나노튜브입니다. 삽입도 해당 회절 패턴을 보여줍니다

이전 연구에서는 소수성 표면에 비해 친수성 표면에서 세포 부착, 확산 및 세포골격 조직이 훨씬 더 우수하다고 보고했습니다[28]. Das et al. 또한 낮은 접촉각은 높은 표면 에너지를 의미하며, 이는 더 나은 세포 부착에 기여하는 중요한 요소이기도 합니다[29]. 따라서 TaO_{x의 영향을 이해하는 것이 필수적입니다.} 표면 습윤성의 나노튜브 지형. 그림 4와 같이 양극 산화 처리된 모든 TaO_x 나노튜브는 접촉각이 90°보다 훨씬 작기 때문에 매우 친수성입니다. 또한 접촉각은 나노튜브 직경이 35nm로 감소함에 따라 단조롭게 감소한 다음 직경이 20nm로 감소함에 따라 역으로 증가하는 것으로 밝혀졌습니다. 우리는 또한 TaO_x 나노튜브 샘플은 물 또는 배양 배지를 시험 액체로 사용할 때 유사한 경향을 보여줍니다. 우리는 친수성 물질에 대한 작은 접촉각을 설명하는 Wenzel의 법칙에 따라 관찰된 습윤성 거동을 설명하려고 합니다[30]. Wenzel의 모델에서 친수성 물질의 표면 거칠기가 증가하면 접촉각이 더 작아지고 물이 액적 아래의 홈을 채울 것입니다. 여기서 우리는 TaO_{x의 기하학적 거칠기를 평가하기 위해 거칠기 계수, 즉 단위 투영 면적당 나노튜브의 물리적 표면적을 사용합니다.} 나노튜브 샘플 [31]. 그림 5와 같이 내경 D , 벽 두께 W , 및 나노튜브 길이 L , 순수한 기하학적 거칠기 계수 G [4πL로 계산할 수 있습니다. {디 + W }/ {√3(디 + 2 W) ² }] + 1. 이 계산은 나노튜브의 모든 표면이 완벽하게 매끄럽다고 가정합니다. 모든 나노튜브 샘플에 대해 계산된 거칠기 계수는 그림 5의 표에 요약되어 있습니다. 직경 20nm 샘플을 제외하고 직경이 작은 나노튜브는 기하학적 거칠기가 더 크므로 Wenzel의 모델에 따라 더 나은 친수성을 나타내는 것으로 생각됩니다. 이 추론은 나노튜브 직경이 35nm로 감소함에 따라 접촉각이 감소한다는 우리의 결과와 일치합니다. 또한 상대적으로 불분명한 나노튜브 표면을 나타내는 20nm 직경의 나노튜브가 다른 나노튜브보다 기하학적 거칠기가 작고 친수성이 낮다는 것을 잘 설명합니다.

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아 –j a의 물과 배양액 방울을 보여주는 광학 이미지 ,f Ta 포일 표면 및 자체 조직 TaO_x 직경이 b인 나노튜브 ,지 20, ㄷ ,h 35, d,i 65 및 e ,j 각각 90 nm. 접촉각은 이미지에 표시되어 있습니다.

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내경이 D인 이상적인 나노튜브 구조의 개략도 , 벽 두께 W , 및 나노튜브 길이 L . 이 연구에서 모든 나노튜브 샘플에 대해 계산된 거칠기 계수가 표에 요약되어 있습니다.

편평한 Ta 포일 및 TaO_{x에 대한 인간 섬유아세포의 행동} 나노튜브 어레이가 더 연구되었다. TaO_{x의 섬유아세포 부착을 평가하려면} 나노튜브에서 세포골격 액틴을 로다민 팔로이딘으로 염색하여 적색 형광을 발현하고 핵을 DAPI로 염색하여 청색 형광을 발현시켰다. 액틴 면역염색은 평평한 Ta 호일과 TaO_{x에 대해 구별 가능한 세포-물질 접촉 형태를 보여줍니다.} 다양한 직경의 나노튜브(그림 6 참조). 세포가 먼저 물질 표면에 부착된 다음 추가 세포 분열을 위해 퍼진다는 것은 잘 알려져 있습니다. 더 나은 세포 접착은 액틴 세포 골격에 결합된 인테그린을 통해 세포 내 신호 전달 캐스케이드의 더 많은 활성화를 유발할 수 있습니다[32,33,34]. FE-SEM은 세포 접착의 상세한 관찰을 위해 사용되었습니다(그림 7 참조). 35nm 직경의 섬유아세포는 길고 평평한 형태로 우수한 세포 접착력을 나타냅니다. 한편, Ta 포일 위의 섬유아세포와 90nm 직경의 TaO_x 나노튜브는 부착된 세포가 적고 세포 확산이 어느 정도 부족함을 보여줍니다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 나노튜브에 있는 세포의 적용 범위를 추가로 추정하고 이러한 SEM 이미지에 기록했습니다. 접촉각의 경향과 유사하게, 커버리지 면적은 나노튜브 직경이 35nm로 감소함에 따라 단조롭게 감소한 다음 직경이 20nm로 감소함에 따라 역으로 증가하는 것으로 나타났습니다. 35nm 직경 TaO_x 나노튜브는 실제로 가장 큰 세포 커버리지 영역을 보여줍니다. 세포는 접착에 적합한 부위가 감지되었을 때 표면의 특징을 인식하는 것으로 알려져 있습니다. 세포가 TaO_{x에 대한 접촉을 안정시킬 수 있다고 가정합니다.} 국소 접착 및 성숙한 액틴 섬유를 형성한 후 튜불린 미세소관을 모집함으로써 나노튜브를 생성합니다. 액틴 세포골격은 유착 내에 위치한 인테그린과 연결되어 있습니다. 우리의 발견은 35nm 직경 나노튜브의 세포골격이 평평한 Ta 포일 또는 다른 TaOx보다 더 잘 형성될 수 있음을 시사합니다. 나노튜브 어레이.

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a에 부착된 섬유아세포의 형광 현미경 이미지 Ta 포일 및 자체 조직 TaO_x 직경이 b인 나노튜브 20, ㄷ 35, d 65 및 e 각각 90nm입니다. 빨간색 형광은 세포골격 단백질 액틴 필라멘트를 나타내고 파란색 형광은 핵을 나타냅니다.

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아 –이 a에서 인간 섬유아세포의 세포 부착 및 증식을 보여주는 SEM 이미지 Ta 포일 표면 및 자체 조직 TaO_x 직경이 b인 나노튜브 20, ㄷ 35, d 65 및 e 각각 90 nm. ImageJ 소프트웨어에 의해 추정된 샘플에서 세포의 커버리지 영역은 이미지에 표시됩니다.

WST-1 분석은 TaO_{x에서 섬유아세포 증식을 추가로 평가하기 위해 사용되었습니다.} 직경이 다른 나노튜브. 그림 8은 WST-1 분석 결과에서 측정한 광학 밀도의 비교를 보여줍니다. 우리는 세포 증식이 35nm 직경의 TaO_{x에서 가장 높다는 것을 발견했습니다.} 나노튜브 샘플. 그러나 Ta 그룹과 TaO_{x 사이에는 큰 차이가 없습니다.} 나노튜브 어레이. 또한, 세포 증식 및 표면 습윤성은 TaO_{x와 거의 유사한 경향을 나타냅니다.} 나노튜브 직경. 이러한 관찰은 나노튜브의 직경뿐만 아니라 표면 습윤성이 세포 접착 및 후속 퍼짐에 강한 영향을 미친다는 것을 시사한다. 즉, 직경 35nm 나노튜브에 비해 직경 20nm 나노튜브는 섬유아세포에 더 많은 초점을 제공할 수 있지만 친수성이 낮으면 일부 효과적인 초점 접촉을 제거하여 세포 부착을 방해합니다. 결국 35nm 직경의 TaO_x 나노튜브는 모든 샘플 중에서 가장 높은 생체적합성을 나타냅니다.

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Ta 포일 및 자가 조직 TaOx에서 인간 섬유아세포 배양 후 측정된 광학 밀도(QD) 다양한 직경의 나노튜브. 표준 편차가 있는 OD 값은 첨부된 표로 나열됩니다.

결론

결론적으로, 본 연구는 양극산화된 TaOx의 생체적합성을 연구한다. 나노튜브 직경이 다른 나노튜브. 모든 양극 산화 TaO_x 나노튜브는 주로 비정질상인 것으로 확인되었다. 우리는 TaO_{x를 사용하여 표면 습윤성의 전환에 대해 논의합니다.} Wenzel의 모델을 기반으로 한 나노튜브 직경. 시험관 내 생체 적합성 평가는 섬유아세포가 TaO_{x에 대한 명백한 습윤성 의존적 거동을 나타낸다는 것을 추가로 나타냅니다.} 나노튜브 어레이. 35nm 직경 TaO_x 나노튜브 어레이는 모든 나노튜브 샘플 중에서 최고의 생체적합성을 나타냅니다. 이 향상은 TaO_{x가 제공하는 고밀도 초점에 기인할 수 있습니다.} 더 높은 표면 친수성 때문에 나노튜브. 이 연구는 TaO_{x를 형성함으로써 Ta의 생체적합성이 향상될 수 있음을 보여줍니다.} 적절한 나노튜브 직경과 기하학적 거칠기가 있는 나노튜브 어레이.