리간드 도핑된 구리 Oxo-hydroxide 나노 입자는 효과적인 항균제입니다.

방법

달리 명시되지 않는 한, 모든 실험은 실온(20 ± 2 °C)에서 초고순도(UHP) 물(역삼투압 정제, 18.2ΩM/cm)을 사용하여 수행되었으며 모든 시약은 Sigma Aldrich에서 구입했습니다.

구리 제형 및 CHAT 나노입자

CuCl₂을 용해하여 염화구리 스톡(40mM 구리)을 준비했습니다. ·2H₂ 물에 오. 산화구리 나노입자(CuO NPs, Sigma 544868) 스톡은 불순물이 없고 1차 입자 크기가 34nm(범위 10-50nm)인 상업용 분말로 제조되었으며 이전에 항균제로 테스트되었습니다[24, 25,26]. 이러한 스톡은 격렬하게 교반하면서 분말을 물에 분산시켜 1.3g/L 구리로 제조했습니다. CHAT 나노입자의 콜로이드 현탁액은 공침법을 사용하여 합성되었다[27]. 간단히 말해서, 염화구리, 타르타르산 및 아디프산을 물에 용해시켜 최종 현탁액에서 구리/주석산/아디프산의 몰비 2:1:1 및 구리 농도 2.5g/L을 달성했습니다. 혼합물의 초기 pH는 항상 2.5 미만이었고 구리는 완전히 용해되었습니다. 그런 다음 pH 8.2 ± 0.2가 될 때까지 계속 교반하면서 NaOH(5 M)의 농축 용액을 적가하여 pH를 천천히 증가시켰습니다.

CHAT 중단의 구리 함량 및 단계적 배포

콜로이드 현탁액의 구리 함량은 유도 결합 플라즈마-광학 방출 분광법(ICP-OES, Jobin Yvon 2000, Horiba)에 의해 결정되었습니다. 모든 샘플은 5% HNO₃에서 100mg/L 미만의 농도로 희석되었습니다. (v /v ) 구리의 완전한 용해도를 보장하기 위해 분석하기 최소 24시간 전에 보정 표준(0.1~100mg/L 구리)은 5% HNO₃에서 매트릭스 일치되었습니다. , 구리 정량은 324.754nm에서 수행되었습니다. 덩어리, 나노미립자 및 가용성 구리의 백분율로 구리의 분획화는 CHAT 스톡의 여과 및 한외여과에 의해 달성되었습니다. 현탁액을 여과하고(200nm 컷오프), 잔류물을 응집된 분획으로 간주했습니다. 가용성 구리를 분리하고 나노미립자 구리와 구별하기 위해 콜로이드 현탁액을 3-KDa 필터(Sartorius Vivaspin 500 VS0192; 16,000×g , 5분) 이는 1nm 미만의 컷오프에 해당하기 때문입니다(Zetasizer Software 7.11, Malvern Instruments Ltd). 모든 분획(총, 200nm 여액, 3KDa 한외여과액)의 구리 함량은 ICP-OES에 의해 결정되었으며 총 구리 함량에 대한 백분율로 표시되는 분획은 다음과 같습니다.

드라이 CHAT 나노입자에서 구리 함량 및 구리 대 리간드 비율 측정

CHAT 나노입자는 결합되지 않은 구성요소의 회수 및 제거를 가능하게 하기 위해 응집되고 침전되었다. 이를 가능하게 하기 위해 2:1 에탄올/현탁액(v /v ), 생성된 CHAT 응집체를 원심분리(4500×g × 15분(미스트랄 6000). 결합되지 않은 리간드 종을 포함하는 용액상은 폐기되었습니다. 고체상 CHAT의 구리 함량 측정은 다음과 같습니다. 에탄올 침전물 펠릿을 45°C에서 일정한 중량으로 오븐 건조하여 분말을 생성했습니다. 그런 다음 이를 밀링하여 35.2 ± 0.3mg(n =2) 11 ± 1 g의 70% HNO₃에서 소화되었습니다. , 정확한 무게가 기록되어 있습니다. 완전히 소화되면 이 용액을 물에 20배 희석하고 구리 농도를 ICP-OES로 측정했습니다. 리간드 대 구리 비율은 건조되고 에탄올로 침전된 CHAT 응집체에서 직접 결정되었습니다. 응집체는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석을 위한 요구 사항인 더 적은 양의 HCl로 용해를 촉진하기 위해 먼저 원래 부피로 물에 재현탁되었습니다. 분취량은 5% HNO₃에 용해되었습니다. 구리의 ICP-OES 분석(위에 설명된 대로) 또는 리간드(타르타르산 및 아디프산)의 HPLC 분석을 위해 80mM HCl에서. 리간드 분석은 표준 역상 크로마토그래피 시스템(2998 PDA 검출기가 장착된 Waters Alliance 2690/5의 C18 컬럼, 자세한 내용은 추가 파일 1에 나와 있음)에서 수행되었습니다.

CHAT 현탁액의 물리화학적 특성

유체역학적 입자 크기 분포는 동적 광산란(DLS; Zetasizer NanoZS, Malvern Instruments Ltd)에 의해 결정되었습니다. CHAT 콜로이드 현탁액의 분취량(2.5g/L 구리)을 1mL 일회용 큐벳으로 옮기고 측정값(n =3) 25 ± 2 °C에서 수행되었습니다. 다시 정확한 설정은 추가 파일 2에 나와 있습니다. CHAT 현탁액의 제타 전위는 일회용 접힌 모세관 세포(DTS1070)를 사용하고 유전 상수가 78.5라고 가정하고 레이저 도플러 미세 전기영동(Zetasizer NanoZS, Malvern Instruments Ltd)으로 측정했습니다 0.89cP의 점도 투과 전자 현미경(TEM) 특성화는 CHAT 현탁액 액적을 구멍이 있는 탄소 천공 그리드에 적용하고 50°C에서 밤새 건조하여 수행했습니다. 그런 다음 명시야 모드에서 120kV의 TEM(FEI-Philips CM100)에서 그리드를 이미지화했습니다.

구리 제제의 항균 활성

분석은 0.4% 글루코스 및 0.1% 카제인 산 가수분해물로 보충되고 pH가 7.2 ± 0.2로 조정된 금속 이온 상용성 매체(추가 파일 3)인 중금속 MOPS(HMM) 배지에서 수행되었습니다. [28] . 구리 화합물을 첨가하기 전에 Escherichia coli (NCTC11100) 및 황색 포도상구균 RN4220[29]은 Infors HT Minitron 인큐베이터에서 80rpm으로 일정하게 진탕하면서 30°C에서 밤새 성장했습니다. 그 후, 박테리아 현탁액을 광학 밀도 0.05–0.1(ca. 10 ⁶ 세포/mL) 595nm에서 E. 대장균( Multiskan RC 351 Labsystem) 또는 S의 경우 600nm 구균 (멀티스칸 플레이트 판독기, ThermoFisher Scientific). 다음으로, 염화구리 및 콜로이드성 CHAT 스톡을 HMM에 희석하고 박테리아 현탁액에 첨가하여 0.4~100mg/L의 최종 구리 농도를 얻었습니다. 그런 다음 6~9시간 동안 배양을 수행하고 박테리아 바이오매스의 척도로 광학 밀도를 모니터링하여 박테리아 성장을 결정했습니다.

박테리아 성장 배지에서 시간 경과에 따른 구리 용해도는 HMM의 염화구리 및 콜로이드성 CHAT 스톡을 12.5, 25, 50mg/L 구리로 희석하고 한외여과를 통해 0, 2, 4, 8시간에서 가용성 구리의 분율을 측정하여 결정했습니다. (3 KDa) 및 ICP-OES 분석, 위에서 설명한 대로.

구리 제제의 세포내 생체이용률

재조합 생물발광 Cu 감지 박테리아, E. 대장균 생체발광을 증가시켜 무독성량의 생체이용 가능한 구리에 반응하는 MC1061(pSLcueR/pDNPcopAlux)을 사용하여 구리 화합물의 생체이용률을 정량화했습니다[30]. 항균 활성 분석에 대해 설명한 대로 박테리아 현탁액을 준비하고 4시간 동안 96웰 마이크로플레이트에서 염화구리 및 CHAT(0~50mg/L 구리)의 일련의 희석액과 함께 인큐베이션했습니다. 생물발광은 Orion II Plate Luminometer(Berthold Detection Systems)로 측정되었으며 생물발광 유도는 다음과 같이 계산되었습니다.

구리 제제로 인한 세포내 스트레스

세포내 슈퍼옥사이드 음이온 및 단일 가닥 DNA 절단을 유도하는 구리 화합물의 능력은 재조합 생물발광 박테리아, E로 평가되었습니다. 대장균 K12::soxRSsodAlux 및 E. 대장균 MC1061(pDEWrecAlux), 각각 [17]. 항균 분석에 대해 설명한 대로 박테리아 배양을 준비하고 박테리아를 4시간에 걸쳐 흰색 96웰 마이크로플레이트에서 일련의 염화구리 및 CHAT 희석액(0~50mg/L 구리)에 노출시켰습니다. 바이오센서의 성능은 E에 대한 양성 대조군으로 박테리아를 슈퍼옥사이드 음이온 유도 화학 메나디온(0.04–30μg/L) 또는 과산화수소(0.1–150mg/L)에 노출시켜 제어했습니다. 대장균 K12::soxRSsodAlux 또는 E. 대장균 각각 MC1061(pDEWrecAlux). 다시, 박테리아를 백색 96-웰 마이크로플레이트에서 배양하고 Orion II Plate Luminometer로 생물발광을 측정하고 생물발광 유도를 Eq. 5.

하이드록시에틸 셀룰로스 겔에 구리 제제의 통합

염화구리, CHAT 및 상업적인 수정되지 않은 산화구리 나노입자(CuO NP)의 스톡을 UHP 물에서 250mg/L 구리로 희석했습니다. 생성된 CHAT 및 CuO NPs 현탁액은 거의 중성 pH에 있었고 겔에 직접 통합될 수 있었지만, 염화구리 용액은 희석 후에도 여전히 산성이었고 따라서 pH 7.0 ± 0.2로 조정되었습니다. 그런 다음 하이드록시에틸셀룰로오스(HEC)를 직접 용해했습니다(2% w /v ) 균질한 젤이 형성될 때까지 롤러 믹서(Denley Spiramix 5)를 사용하여 다양한 희석된 스톡에 넣습니다. 10g의 각 겔을 팔콘 튜브로 옮기고 밤새 침전시켰다. 다음으로 새로 준비된 50mM 중탄산나트륨 완충액 10mL(NaHCO₃에서 용해됨) 겔-액체 계면(비표면적 7.1cm ² )에서 방해를 최소화하기 위해 주의하여 각 튜브에 분말을 7.0 ± 0.2로 조정했습니다. ). 그런 다음 부분 표본을 수집하고 ICP-OES로 분석하여 시간 경과에 따른 구리 방출을 결정했습니다.

결과

"방법" 섹션에 설명된 대로 CHAT는 철 유사체 IHAT[21, 22]와 유사한 방식으로 구리 옥소하이드록사이드(2.5g/L 구리)에 타르타르산 및 아디프산을 도핑하여 합성되었습니다. 이것은 모든 구리가 200nm 필터를 통과했지만 3KDa 필터를 거의 통과하지 않은(5%) 안정적인 콜로이드 현탁액을 생성했습니다. 이는 대부분의 구리가 IHAT 유사체[21, 22]와 같이 "유리" 구리가 거의 없고 감지할 수 있는 큰 덩어리가 없는 나노미립자(95%, 그림 1a)임을 나타냅니다. 에탄올에 침전될 때 결합되지 않은 리간드 종을 제거한 다음 건조하면 CHAT는 31 ± 1% 구리(w /와 ) ICP-OES 분석에 의해. 구리 대 리간드 몰비는 HPLC에 의해 결정되며 구리 대 타르트레이트의 경우 2:1이고 구리 대 아디페이트의 경우 2:0.3이었습니다. CHAT 입자는 TEM 이미징에 의해 직경이 2-3nm인 거의 단분산으로 나타났습니다(그림 1b). 이러한 발견은 UHP 물의 부피 기준 중앙 직경이 3.4nm(그림 1c)이고 크기 분포가 좁기 때문에(부피의 80%에 대해 2.4-5.6nm) CHAT와 수화 껍질에 대한 유체 역학 크기 조정 데이터와 일치했습니다. 동적 광산란으로 평가됩니다. 평균 제타 전위는 - 39mV(그림 1d)로 안정적인 수성 분산액을 형성하는 나노 입자와 일치하며[27], 실제로 CHAT 스톡 현탁액은 몇 년 동안 안정적인 것으로 나타났습니다(추가 파일 4).

CHAT 스톡 솔루션의 특성. 아 2.5g/L CHAT에서 구리 상 분포:가용성(<3KDa) 및 나노미립자 비율. ㄴ TEM에 의한 나노 입자 분산 이미징. ㄷ 동적 광산란에 의해 결정된, 새로 준비된 입자의 유체역학적 입자 크기 분포. d 제타 전위 분포(n =3; 오차 막대는 표준 편차를 나타냄)

다음으로, 스톡 현탁액을 박테리아 성장 배지에서 구리 염의 항균 활성과 관련된 농도로 희석했을 때 CHAT의 항균 활성을 고려했습니다. CHAT 및 염화구리의 경우 성장 억제 곡선은 E 둘 다에 대해 매우 유사했습니다. 대장균 및 S. 구균 12.5~50mg/L 범위의 총 구리 농도에서 대부분의 활성이 발생했습니다(그림 2). 완료 E. 대장균 18.8(CuCl₂)과 함께 배양 시 성장 억제가 관찰되었습니다. ) 및 25(CHAT) mg/L 구리, 반면 S. 구균 , 완전한 성장 억제는 75에서 얻어졌다(CuCl₂ ) 및 100(CHAT) mg/L 구리(그림 2, 성장 억제 대 구리 농도는 추가 파일 5에 제공됨).

대장균 (상단) 및 황색 포도상구균 (하단) 성장 곡선(여기에서 광학 밀도로 표시됨)은 보충된 HMM에서 다양한 농도의 염화구리(왼쪽) 또는 CHAT(오른쪽)에 노출될 때의 성장 곡선입니다.

실제로, 이러한 항균 농도에서 CHAT의 최소 94%가 한외여과 및 ICP-OES 분석으로 판단할 때 빠르게 용해되었습니다(15분 이내)(그림 3a). 따라서 우리는 CHAT의 항균 효과가 이러한 화학적 불안정성과 연결되어 나노 입자가 빠르게 용해되어 박테리아가 구리 이온을 획득할 수 있다고 예상했습니다. 이를 테스트하기 위해 Cu-sensing E에 도전했습니다. 대장균 , MC1061(pSLcueR/pDNPcopAlux), 세포내 구리 이온의 아독성 농도에 반응하여 생물발광이 증가하고[30] CHAT 또는 염화구리로서 0~50mg/L 구리를 사용합니다. 두 구리 공급원의 배양 배지 농도 증가는 E에서 생물발광을 증가시켰습니다. 대장균 세포 내 구리의 증가와 일치하는 구리 센서 변형(그림 3b). 용량-반응 곡선의 기울기는 두 구리 공급원에 대해 최대 6.25mg/L로 동일하여 CHAT의 생체이용 가능한 구리가 완전히 용해된 공급원과 유사함을 확인했습니다. 그 후 최대 50mg/L 구리 농도에서 두 구리 화합물의 독성으로 인해 발광이 증가하지 않았습니다(그림 3b).

아 12.5, 25, 50mg/L 구리에서 보충된 HMM에서 CHAT의 용해 프로필. 재조합 발광 박테리아의 생물 발광 유도의 용량 반응:b 세포내 구리 이온 반응 E. 대장균 MC1061 pSLcueR/pDNPcopAlux 박테리아, c DNA 손상 반응 E. 대장균 MC1061(pDEWrecAlux) 및 d 슈퍼옥사이드 음이온 반응 E. 대장균 K12::soxRSsodAlux 보충된 HMM에서 염화구리, CHAT(mgCu/L의 농도) 및 각 대조군(c의 메나디온)에 4시간 노출 시 및 H₂ O₂ d 후 )

E에서 세포내 구리를 연구하는 것과 병행합니다. 대장균 CHAT 또는 염화구리로 준비된 용액에 노출되었을 때, 우리는 또한 세포내 슈퍼옥사이드 음이온을 유발하거나 다른 E에서 박테리아 DNA 손상을 일으키는 이러한 용액의 능력을 테스트했습니다. 대장균 -기반 바이오센서. 두 경우 모두 관련 양성 대조군, 즉 각각 과산화수소 및 메나디온에 반응하는 센서에도 불구하고 유의하게 관찰 가능한 효과가 없었습니다(그림 3c, d). 종합하면, 서로 다른 화학적 형태의 구리로 제조된 용액에 대한 세 가지 박테리아 바이오센서의 동등한 반응은 두 경우 모두에서 하나의 제형이 나노미립자로 시작했음에도 불구하고 박테리아가 동일한 가용성 구리에 노출되었다는 개념을 강력하게 뒷받침합니다.

마지막으로, 위에서 언급한 바와 같이, 용해성 구리염에 대한 CHAT의 이점은 농축된 제형이 전자가 후자와 달리 화학적 불안정성을 유지하도록 허용하는 경우에만 명백할 것입니다. 국소 제형을 위한 일반적인 수성 염기인 하이드록시에틸 셀룰로스(HEC)를 사용하여[31,32,33], 250mg/L 구리를 염화구리, CHAT 또는 상업용 CuO NP로 통합했습니다. 10mL의 50mM NaHCO₃일 때 단순화된 상처 삼출물인 완충액을 구리가 포함된 각 HEC 겔(즉, 2.5mg 구리)에 10g 첨가했을 때 CHAT 함유 제제로부터 구리가 60mg/L 이상으로 지속적으로 방출되었습니다. 24시간(그림 4). 또한, 방출은 2~4시간 이내에 항균 활성 농도에 도달하여 비교적 신속했습니다. 대조적으로, pH 중화된 염화구리는 구리 방출을 위한 열악한 기질이었으며, 가수분해 및 구리 옥소-하이드록사이드의 덩어리를 형성하는 경향으로 인해 예상대로 24시간까지 용액에서 10 ± 7 mg/L 구리만 달성되었습니다. (그림 4). 상업용 CuO NP는 식별 가능한 구리 방출을 전혀 나타내지 않았습니다(그림 4).

CHAT, 염화구리 또는 산화구리 나노입자(CuO NP)를 포함하는 HEC 매트릭스의 구리 방출, 모두 250mg/L 구리