담관암 세포 억제를 위한 반응성 산소종 민감 나노섬유 매트를 사용한 Piperlongumine 용출 위장 스텐트

자료 및 방법

자료

PL은 LKT Labs에서 구입했습니다. Co., (미국 미네소타). Poly(L-lactide)(PLA, PLA-0005, M.W. =5000 g/mol, 제조사 데이터)는 Wako Pure Chem에서 구입했습니다. Co. Ltd.(일본 오사카). 메톡시 폴리(에틸렌 라이콜)-숙신이미딜글루타레이트(MePEG-NHS, M.W. =5000 g/mol)는 Sunbio Co. Ltd.(Seoul, Korea)에서 구입했습니다. 담도용 규소막으로 덮인 스텐트는 M.I. 기술 (한국 평택). 폴리(ε-카프로락톤)(PCL, 수평균 MW =80,000 g/mol), N-히드록시숙신이미드(NHS), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 염산염(EDAC), 테트라히드로푸란(THF), 클로로포름 , 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 3-(4,5-다이메틸티아졸-2-일)-2,5-다이페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 및 셀레노시스타민 다이하이드로클로라이드는 Sigma-Aldrich Chemical Co.(St. Louis, MO)에서 구입했습니다. , 미국). 투석막 또는 투석 장치(MWCO) 1000 g/mol 및 8000 g/mol)은 Spectrum/Por Lab., Inc.(CA, USA)에서 구입했습니다. 모든 유기 용제 및 기타 화학 물질은 초순도 등급으로 사용되었습니다. RPMI1640 배지 및 태아 소 혈청(FBS)과 같은 세포 배양 용품은 Life Tech에서 구입했습니다. Inc.(미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드). 사용된 모든 시약 및 유기 용매는 HPLC 등급이었습니다.

LEse 블록 공중합체의 합성

MePEG-셀레노시스타민 접합체

MePEG-NHS(500 mg)를 20 mL DMSO에 용해시켰다. 5 당량 이상의 셀레노시스타민을 15 mL 탈이온수에 별도로 용해하고 5 mL DMSO와 혼합했습니다. 그 후, 셀레노시스타민 용액을 MePEG-NHS 용액에 천천히 적하한 후 24시간 동안 자기 교반하였다. 이후 반응물을 투석관(MWCO 1000 g/mol)에 넣고 2 일 동안 다량의 물에 대해 투석하였다. 투석된 용액을 2 일 동안 동결건조시켰다. 동결건조된 고체를 사용하여 블록 공중합체를 합성했습니다.

블록 공중합체 합성

PLA(500 mg)를 20 mL DMSO에 동일한 양의 EDAC 및 NHS와 함께 용해시켰다. 이 용액을 12시간 동안 자기 교반하였다. 이 용액에 mPEG-셀레노시스타민 고체(530 mg)를 첨가하고 2 일 동안 더 교반하였다. 이후 반응물을 투석관(MWCO:8000 g/mol)에 넣고 2 일 동안 다량의 물에 대해 투석하였다. 투석된 용액을 2 일 동안 동결건조시켰다. 미반응 mPEG-셀레노시스타민을 한 번 더 제거하기 위해 동결건조된 생성물을 메탄올에 침전시켰다. 최종 수율은 94% 이상이었다. 수율 =[(동결건조된 고체의 중량)/(PLA의 중량 + mPEG-셀레노시스타민의 중량)] × 100.

고분자 특성

폴리머 합성을 모니터링하려면 ¹ H-핵자기 공명(NMR) 분광법이 사용되었습니다. 폴리머를 DMSO-d 형태로 용해하고 ¹ 로 측정했습니다. H-NMR 분광법(500 MHz Superconducting FT-NMR Spectrometer, UnityInova 500, Varian Inc. Agilent Tech., CA, USA).

고분자의 분자량은 겔투과크로마토그래피(GPC, Waters GPC system, MA 01757, USA)로 측정하였다:Waters 1515 HPLC 용매 펌프, Waters 2414 굴절률 검출기 및 3개의 Waters Styragel High Resolution 컬럼(HR4, HR2, HR1) ). 중합체를 용리액으로 0.1 N LiBr을 함유하는 초순도 THF에 용해시켰다(유속 1.0 mL/분). 폴리스티렌을 사용하여 검량선을 만들었습니다.

GI 스텐트에 코팅된 PL 장착 나노섬유 매트

PL이 장착된 나노섬유 매트

보리노스타트(100 mg)를 10 mL 아세톤 용액에 용해시켰다. 이 용액에 LEse(100~400 mg)와 PCL(600~900 mg)을 첨가하고 2 시간 동안 자기 교반하였다. 이 용액은 전기방사기(EBS ES-Biocoater; Nano NC, Seoul, South Korea)를 사용하여 나노섬유 매트를 제작하고 실리콘 멤브레인으로 덮인 스텐트에 코팅하는 데 사용되었습니다. 전기방사기는 고전압 전원 공급 장치, 주사기 펌프, X-Y 로봇 시스템 및 드럼 롤 수집기로 구성됩니다. 주사기(NanoNC, 24G)의 고분자/약물 용액을 실리콘 멤브레인으로 덮인 금속 스텐트(직경 1 cm, 길이 10 cm, 롤링 속도 500 rpm, 분무 속도 100 μL/분, 전압 15 kV)에 분사했습니다. 롤링 컬렉터에 배치됩니다. PL이 장착된 나노섬유 멤브레인을 스텐트에 코팅했습니다. 남아 있는 용매를 제거하기 위해 PL이 장착된 나노섬유 코팅 스텐트를 진공 건조 오븐에서 24시간 동안 건조했습니다. PL이 장착된 나노섬유 코팅 스텐트는 다음 연구까지 4 °C에서 보관되었습니다.

PL이 장착된 나노섬유 매트는 약물 방출 및 동물 연구를 위해 스텐트에서 조심스럽게 분리되었습니다. 유사한 절차로 PL이 없는 상태에서 빈 나노섬유 멤브레인을 준비했습니다.

약물 함량은 다음과 같이 측정되었습니다. 5 mg의 PL이 포함된 나노섬유 매트를 DMSO에 2 시간 동안 용해했습니다. UV-spectrophotometer(UV-1601, Shimadzu Co. Ltd. Osaka, Japan)를 사용하여 325 nm에서 약물 농도를 측정하였다. 빈 나노섬유 매트도 DMSO에 녹여 블랭크 테스트에 사용했습니다.

약물 방출 연구는 시험관 내에서 인산완충식염수(PBS, 0.01 M, pH 7.4)로 수행되었습니다. 나노섬유 매트를 디스크로 절단하고 10 mg의 디스크를 50 mL 원뿔형 튜브의 40 mL PBS(0.01 M, pH .4)에 담궜습니다. 이것을 100 rpm(37 °C)에서 진탕 배양기에 넣었습니다. 특정 시간 간격으로 나노섬유 매트에서 방출된 PL의 농도를 측정하기 위해 전체 배지를 취했습니다. 매질의 PL 농도는 UV-spectrophotometer(325 nm)로 측정하였다. 빈 나노섬유 매트도 블랭크 테스트로 사용했습니다. 방출 연구에서 약물 방출 속도에 대한 ROS 효과를 조사하기 위해 방출 매체에 과산화수소를 첨가했습니다.

형태학

나노섬유 매트의 형태는 25 kV에서 전계 방출 주사 전자 현미경(S-4800; Hitachi, Tokyo, Japan)으로 관찰되었습니다.

세포 배양

SNU478, SNU245 및 SNU 1196 CCA 세포주와 같은 인간 CCA 세포주는 한국 세포주 은행(서울, 한국)에서 입수했습니다. HuCC-T1 인간 CCA 세포주는 Health Science Research Resources Bank(일본 오사카)에서 입수했습니다. 모든 세포는 10% 열 불활성화 FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI1640에서 37°C, 5% CO2에서 배양되었습니다. 인큐베이터.

항암 활성 연구

다양한 CCA 세포(1 × 10 ⁴ ) 96-well plate에 시드된 PL 자체, PL이 포함된 나노섬유 매트 또는 나노섬유 매트에서 방출된 PL의 항암 활성을 평가하는 데 사용되었습니다. 세포를 5% CO₂에서 밤새 유지했습니다. 37 °C에서 인큐베이터. PL 처리를 위해 DMSO(10 mg PL/mL DMSO)에 용해된 PL을 RPMI1640 배지로 희석했습니다. DMSO의 최종 농도는 0.5% 미만이었습니다. 나노섬유 매트에서 방출된 PL의 처리를 위해 PL이 포함된 나노섬유 매트를 50 mL 원추형 튜브의 40 mL PBS에 담그었습니다. 5일차와 15일차에 PL 농도를 상기와 같이 UV-spectrophotometer로 측정하여 세포 처리에 사용하였다. 빈 나노섬유도 비교를 위해 방출 실험에 적용되었습니다. 세포는 2 일 동안 PL 자체 또는 나노섬유 매트에서 방출된 PL에 노출되었습니다. CCA 세포의 생존력은 MTT 증식 분석으로 평가되었습니다. 30 마이크로리터 MTT 용액(5 mg/mL PBS, pH 7.4)을 웰에 첨가한 다음, 세포를 5% CO2에서 4시간 동안 인큐베이션했습니다. 37 °C에서 인큐베이터. 배지를 버리고 100 μl DMSO를 첨가하였다. 세포 생존율은 570 nm에서 마이크로플레이트 리더(Infinite M200 Pro 마이크로플레이트 리더, Tecan, Mannedorf, Switzerland)로 분석되었습니다. 세포 생존율은 8개 웰의 평균 ± 표준 편차로 표시되었습니다.

ROS 측정

CCA 세포에서 ROS 생성은 DCFH-DA 방법으로 분석되었습니다. CCA 세포(1 × 10 ⁴ 96웰 플레이트에 접종된 세포)를 DCFH-DA(최종 농도 20 μM)가 포함된 페놀 레드 프리 RPMI 배지에서 나노섬유 매트에서 방출된 PL 또는 다양한 농도의 PL로 처리했습니다. 6시간 또는 12시간 후, 세포를 PBS로 두 번 세척하고 100μL의 신선한 페놀 레드가 없는 RPMI 배지로 교체했습니다. 세포의 ROS 함량은 Infinite M200 pro 마이크로플레이트 리더(여기 파장 485 nm, 방출 파장 535 nm)를 사용하여 형광 강도 변화로 분석되었습니다.

서양 얼룩

CCA 세포의 웨스턴 블로팅은 이전에 설명한 대로 수행되었습니다[31]. 세포는 24시간 동안 PL 자체 또는 나노섬유 매트에서 방출된 PL에 노출되었습니다. 그 후, 세포를 트립신 처리에 의해 수확하고, 차가운 PBS로 세척하고, 원심분리에 의해 수집하였다. 펠렛은 50mM Tris, 150mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 데옥시콜산, 페닐메틸설포닐 플루오라이드가 포함된 0.1% 소듐 도데실 설페이트(SDS) 및 프로테아제 억제제 칵테일(Roche Diagnostics, Basel)을 포함하는 용해 완충액에서 용해되었습니다. ). 이 용액을 4 °C(14,000×g ); 그런 다음 세포 용해물(상등액)을 사용하여 BCA 단백질 분석 키트(Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여 단백질 농도를 측정했습니다. 단백질(50 μg)을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 로딩하고, 폴리비닐 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 옮기고, TBS-T에서 5% 탈지유로 차단하고, 적절한 1차 항체로 프로브한 후 처리 1 h 동안 2차 HRP 결합 항체로. 면역블롯은 화학발광으로 검출한 다음 ImageJ 소프트웨어 프로그램을 사용하여 디지털 분석으로 정량화했습니다.

종양 이종이식 모델을 사용한 생체내 연구

HuCC-T1 베어링 마우스(BALB/c 누드 마우스, 5주령, 수컷, 체중 18–23 g; Orient, 성남, 한국)를 사용하여 PL이 포함된 나노섬유 스텐트의 생체 내 항종양 활성을 평가했습니다. 1 × 10 ⁶ 100 μL의 PBS에 용해된 HuCC-T1 세포를 누드 마우스의 등에 피하(s.c.) 투여했습니다. 고형종양의 직경이 약 4~5 mm가 되면 PL이 포함된 나노섬유 디스크와 빈 나노섬유 디스크를 고형종양 아래에 이식하였다. PL의 용량은 10 mg PL/kg이었다. 비교를 위해 PL을 Cremophor EL®/에탄올 혼합 용액(0.5% v /v Cremophor EL® 및 0.5% v /v PBS 중 에탄올(pH 7.4, 0.01 M)). 대조군은 종양 조직 옆에 PBS를 피하 주사하였다. PL이 포함된 나노섬유 및 빈 나노섬유 그룹의 경우 다음과 같이 나노섬유 디스크를 준비했습니다. 동일한 무게의 나노섬유 웨이퍼를 원형 디스크로 절단한 다음 마우스 피부의 뒷면을 조심스럽게 절제했습니다(길이 0.5 cm). 그 다음, 나노섬유 웨이퍼를 고형 종양 조직 아래에 조심스럽게 이식했습니다. 동일한 조건을 만들기 위해 대조군 처리 및 PL 주사를 받은 마우스도 종양 옆의 피부를 절제했습니다(길이 0.5 cm). 각 그룹은 5마리의 마우스로 구성되었습니다. 종양 부피는 5 일 간격으로 측정하였고, 나노섬유 이식 첫날을 0일로 설정하였다. 종양 부피는 다음 식으로 계산하였다:V =(아 × [b ] ² )/2. 아 :가장 큰 직경; 나 :가장 작은 직경.

모든 동물 연구는 부산대학교 동물연구소(PNUIACUC)의 지침에 따라 신중하게 수행되었습니다. 이 연구에 사용된 동물 프로토콜은 윤리적 절차 및 과학적 관리에 대해 PNUIACUC에서 엄격하게 검토되었으며 승인되었습니다(승인 번호:PNU-2017-1608).

면역조직화학

종양 조직은 30 일 후에 분리되었습니다. 그런 다음 종양 조직을 4% 포름알데히드에 고정하고 파라핀이 포매된 후 절단하여 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 하였다. 면역조직화학적 염색은 caspase-3 및 caspase-9 항체와 같은 세포사멸 관련 단백질로 수행되었습니다. 항체는 1:100 또는 1:200으로 희석하여 사용하였으며, 제조사의 protocol에 따라 Envision kit(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 염색하였다.

통계 분석

처리된 세포와 처리되지 않은 세포의 데이터에 대한 통계 분석은 Student's t 테스트. p 값 <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

결과

고분자 특성

PL 용출 GI 스텐트를 제작하기 위해 그림 1과 같이 LEse 블록 공중합체를 합성하였다. MePEG-NHS를 셀레노시스타민과 반응시킨 후 말단 아민기를 PLA의 카르복실 말단기와 접합시켰다. MePEG-셀레노시스타민 접합체로부터의 미반응 셀레노시스타민은 투석 절차에 의해 제거되었습니다. 또한, 합성된 블록 공중합체로부터 미반응 MePEG-셀레노시스타민 접합체도 투석 절차 및 메탄올 침전에 의해 제거되었다. selenocystamine의 특이적 피크는 각각 1.7 ppm과 2.9 ppm에서 확인되었고, MePEG의 특이적 피크도 3.5~3.7 ppm에서 확인되었다. PLA가 결합된 경우 PLA의 메틸기가 1.4 ppm에서 확인되었다. PCL 호모폴리머와 LEse 블록 코폴리머 블렌드를 혼합하여 나노섬유 매트를 제작했습니다. M.W. 및 LEse 블록 공중합체 및 PCL 단독 중합체의 조성은 ¹ 로 측정되었습니다. H-NMR 분광법 및 GPC. M.W. 추정 결과는 Table 1과 같다. ¹ 을 이용하여 PEG의 M.W.를 기준으로 LEse 블록 공중합체의 M.W.를 추정하였다. 9760 g/mol의 H-NMR 분광법. GPC 측정은 LEse 블록 공중합체의 Mn이 8210 g/mol, Mw가 9530 g/mol, 1.16인 것으로 나타났습니다.

LEse 블록 공중합체의 합성 방식

Piperlongumine이 포함된 나노섬유 코팅 GI 스텐트의 특성

도 2 및 표 2에서 보는 바와 같이 다양한 비율의 PCL 및 LEse 블록 공중합체를 사용하여 나노섬유를 제조하고 GI 스텐트에 코팅하였다. PCL 호모폴리머는 응집된 형태를 최소화한 미세하고 얇은 나노섬유 매트를 생성했습니다. LEse 블록 공중합체를 첨가하면 그림 2와 같이 과립 및 입자와 같은 응집된 형태가 일부 관찰되었습니다. 구조. 함량 중 LEse의 비율이 50% 이상인 경우 고분자가 유의하게 응집되어 매트의 불규칙성이 심한 것으로 나타났습니다(데이터는 표시되지 않음). LEse 블록 공중합체만으로는 나노섬유 구조를 거의 얻을 수 없었다. 따라서 PCL 단독 중합체와 혼합하여 나노 섬유 구조를 얻을 수 있습니다. 준비된 PL이 포함된 나노섬유 매트의 약물 함량은 표 2에 표시된 이론값과 거의 유사했습니다. 이러한 결과는 PL이 포함된 나노섬유 매트가 PCL 단독중합체와 LEse 블록 공중합체 혼합물로부터 성공적으로 제작된 다음 GI 스텐트에 코팅되었음을 나타냅니다. 피> <그림>

아 PL이 포함된 나노섬유로 덮인 GI 스텐트. ㄴ PL이 포함된 나노섬유의 FE-SEM 사진

그림 3은 나노섬유 매트의 약물 방출 속도를 보여줍니다. 도 3a에 도시된 바와 같이, PL은 25 일에 걸쳐 나노섬유 매트로부터 연속적으로 방출되었다. 나노섬유 매트에서 PL의 폭발적 방출은 4 일까지 관찰되었으며 PL은 25일까지 나노섬유 매트에서 지속적으로 방출되었습니다. 나노섬유 매트에서 LEse 블록 공중합체의 함량이 높을수록 나노섬유 매트에서 PL이 더 빨리 방출됩니다. LEse 블록 공중합체는 PCL 단독 중합체보다 소수성이 낮기 때문에 LEse 블록 공중합체의 함량이 높은 PCL/LEse 나노섬유 매트는 PCL 단독 중합체보다 더 많이 팽윤되어야 합니다. 그런 다음, LEse 블록 공중합체의 함량이 더 높은 나노섬유 매트는 더 빠른 약물 방출을 초래했습니다. 또한, LEse 블록 공중합체의 디셀레니드 결합이 H₂와 같은 ROS에 의해 분해될 수 있으므로 ROS의 존재하에서 PL 방출 속도를 가속화할 수 있습니다. O₂ , 그리고 이러한 요인들은 나노섬유 매트의 산화환원 반응 분해를 유도합니다(그림 3c~e). PCL 호모폴리머의 나노섬유 매트는 H₂ 첨가에 크게 반응하지 않았습니다. O₂ 즉, PCL은 H₂의 영향을 크게 받지 않습니다. O₂ 덧셈; 반면에 LEse 블록 공중합체가 혼합되었을 때 나노섬유 매트로부터의 PL 방출은 H₂ O₂ 가 추가되었습니다. 특히, 나노섬유 매트에서 더 높은 LEse 블록 공중합체 비율은 도 3c, d 및 e에 도시된 바와 같이 더 빠른 약물 방출 동역학을 유도하였다. 이러한 결과는 PL이 포함된 나노섬유 매트가 생물학적 환경에서 산화환원 반응 약물 방출 가능성을 가지고 있음을 나타냅니다. PCL/LEse 블록 공중합체(60/40)로 제조된 PL이 포함된 나노섬유 매트는 시험관 내 세포 배양 및 생체 내 동물 연구에 따라 사용되었습니다.

아 다양한 조성을 갖는 나노섬유로부터의 PL 방출. PCL/Lese 중량비는 각각 100/0, 90/10, 75/25 및 60/40이었습니다. ㄴ 나노섬유 매트로부터의 PL 방출에 대한 과산화수소의 영향(PCL/Lese 중량비는 100/0임). ㄷ 나노섬유 매트로부터의 PL 방출에 대한 과산화수소의 영향(PCL/Lese 중량비는 90/10). d 나노섬유 매트로부터의 PL 방출에 대한 과산화수소의 영향(PCL/Lese 중량비는 75/25임). 이 나노섬유 매트에서 PL 방출에 대한 과산화수소의 영향(PCL/Lese 중량비는 60/40)

체외 항암 활동

PL이 포함된 나노섬유 매트 코팅 스텐트의 항암 특성을 다양한 CCA 세포로 평가했습니다. 비교를 위해, 나노섬유 매트에서 방출된 PL은 방출 실험 중 5일과 15일에 추출되어 온전한 PL과 비교되었습니다. 그림 4에서 보는 바와 같이 HuCC-T1 세포(그림 4a), SNU1196 세포(그림 4b), SNU478 세포(그림 4b)에서 5일째와 15일째 방출된 PL에 대한 항암 활성은 PL 자체에 비해 크게 변하지 않았다. 그림 4c), SNU245 셀(그림 4d). PL 자체가 10 μg/mL 농도보다 높은 농도에서 더 높은 항암 활성을 나타내었음에도 불구하고 그들은 세포 생존 능력에서 거의 유사한 억제 가능성을 가지고 있습니다. 표 3은 IC₅₀를 보여줍니다. PL 자체의 가치를 높이고 나노섬유 매트에서 PL을 방출했습니다. PL 자체와 마찬가지로 5일째와 15일째에 방출된 PL은 약물 방출 실험 15 일까지 항암 활성을 유지하며 합리적인 IC₅₀를 나타냈습니다. 모든 CCA 세포주에서 값이 PL 자체에 비해 5일 및 15일부터 PL에서 점진적으로 증가했지만. H₂가 있는 상태에서 4일차와 15일차에 PL 출시 O₂ 또한 PL 자체뿐만 아니라 항암 활성도 유지했습니다. 이러한 결과는 생물학적 환경에서 나노섬유 제조과정과 약물 방출 기간 동안 PL의 항암 활성이 유지됨을 나타내었다. 또한, 나노섬유 매트에서 방출된 PL은 PL 자체와 유사하게 약물 방출 기간 15 일까지 ROS 생성 용량을 생성했습니다(그림 5). 도 5a 및 b에 나타난 바와 같이, PL 자체는 5 μg/mL보다 높은 비율로 훨씬 더 많은 ROS를 생성하였다. 5일째와 15일째에 방출된 PL도 ROS를 생성했지만 15일째부터 방출된 PL에 의해 ROS 생성이 약간 감소하여 PL이 포함된 나노섬유 매트가 약물 방출 기간 동안 PL의 고유한 항암 특성을 유지했음을 나타냅니다.

다양한 CCA 세포의 생존 가능성에 대한 PL 및 나노섬유 매트에서 방출된 PL의 효과. 아 HuCC-T1, b SNU1196, c SNU478 및 d SNU245 담관암 세포. 2 × 10 ⁴ 96웰 플레이트의 세포를 2 일 동안 PL에 노출시키거나 나노섬유에서 PL을 방출했습니다. 방출된 PL의 처리를 위해 PL이 포함된 나노섬유 디스크를 PBS에 담그고 10 mM H₂ 유무에 관계없이 5일 및 15일 동안 방출 실험을 수행했습니다. O₂ . 약물 방출 연구와 유사하게 배지를 3 일까지 교환하였다. 그 후, 방출 실험 5일에서 15일 사이에 배지를 수확하였다. 이 용액을 이용하여 PL 자체와 방출된 PL의 항암 활성 비교를 조사하였다

HuCC-T1 세포의 ROS 생성에 대한 PL 및 나노섬유 매트에서 방출된 PL의 효과(a ) 및 SNU245 셀(b ). PL 자체와 해제된 PL은 그림 3과 같이 처리되었습니다.

그림 6은 HuCC-T1 CCA 세포에서 세포자멸사 단백질의 발현을 보여줍니다. 방출된 PL(5 일)은 PL 자체와 비교하여 HuCC-T1 세포의 세포자멸사 유도에 유사한 활성을 가지며, 즉 BAX, caspase-3, 7, 9의 발현 및 절단된 PARP 절단은 처리에 의해 점진적으로 증가되었다. PL(5 days)과 PL 자체를 출시했습니다. 이러한 결과는 또한 방출된 PL이 PL 자체뿐만 아니라 CCA 세포에 대해서도 합리적인 항암 활성을 가지고 있음을 나타냅니다.

HuCC-T1 세포의 아폽토시스에 대한 웨스턴 블롯 분석. 세포에 PL 자체를 처리하거나 1 일 동안 나노섬유에서 PL을 방출한 후 웨스턴 블롯 분석을 수행했습니다.

HuCC-T1 종양 이종이식 모델에 대한 생체내 항암 활성

HuCC-T1을 포함하는 누드 마우스를 준비하여 PL이 포함된 나노섬유 코팅 스텐트의 생체 내 항암 활성을 평가하기 위해 도 1 및 도 5에 도시된 바와 같이 준비하였다. 7 and 8. As shown in Fig. 7, the volume of HuCC-T1 tumor was gradually increased over 1 month. Growth of tumor volume in the treatment of empty nanofiber was almost similar with control treatment. PL injection properly inhibited tumor growth, compared to control treatment or empty nanofiber treatment. Especially, tumor growth was significantly inhibited by the treatment of PL-incorporated nanofiber, i.e., tumor mass in the treatment of PL-incorporated nanofiber was one third of control treatment. These results indicate that PL-incorporated nanofiber mats have superior potential in inhibition of tumor growth of CCA cells. Furthermore, the expression of caspase-3 and 9 was also increased in tumor tissues as shown in Fig. 8, indicating that released PL from nanofiber mats properly inhibited the growth of the tumor and induced apoptosis of tumor cells. Also, PL-incorporated nanofiber-coated stent has potential to inhibit CCA cells in vitro and in vivo.

The effect of PL solution, empty nanofiber mats or PL-incorporated nanofiber mats on the growth of HuCC-T1 tumor (a ) and the body weight changes (b ). HuCC-T1 (1 × 10 ⁶ cells) cells were implanted to the back of mice. PL dose was adjusted to 10 mg/kg. One hundred microliters of PBS or PL solution was s.c. injected beside the tumor tissue for control treatment and PL solution treatment, respectively. For empty nanofiber and vorinostat nanofiber implantation, wafers of the same weight were cut and then implanted under the tumor tissue. *p <0.001; **p  < 0.01

Immunohistochemical staining (× 400) of HuCC-T1 tumor tissues. Each tumor tissues were stained with BAX, caspase-3, 7, and 9, and PARP-1