세포내 단백질 전달을 위한 실리카 나노입자:녹색 형광 단백질을 사용한 새로운 합성 방법

결과 및 토론

이 연구는 단백질의 생화학적 특성과 기능을 유지하는 적절한 조건에서 GFP로 실리카 나노입자를 기능화하는 것을 목표로 합니다. 이전 연구에서 우리는 2상 시클로헥산/물 시스템에서 테트라에톡시실란(TEOS)의 ʟ-아르기닌 제어 가수분해를 사용하여 15~80nm 크기 범위의 근적외선 염료 도핑된 단분산 형광 실리카 나노입자를 합성했습니다[26]. 여기에서 우리는 GFP를 모델 단백질로 실리카 매트릭스에 삽입하기 위해 이 합성 절차를 채택했습니다. 반응식 1에서 입자 합성 절차가 개략적으로 도시되어 있습니다. GFP 도핑 및 비도핑 구조(코어/쉘)는 각각 녹색과 회색으로 강조 표시됩니다. 첫 번째 단계에서 GFP가 도핑된 실리카 코어 입자(C_F ) 얻었다. 후속 재성장 단계(C_F S₁ 및 C_F S₁ S₂ ) 더 큰 입자 크기의 합성을 허용했습니다. 첫 번째 재성장 단계에서 쉘은 (C_F S_1F ) 또는 미포함(C_F S_1U ) 단백질의 혼입. 유사하게, 두 번째 재성장 단계에서 레이블이 지정된 (C_F S_1F S_2F , C_F S_1U S_2F ) 또는 레이블이 없는(C_F S_1F S_2U , C_F S_1U S_2U ) 쉘이 추가되었습니다. 이러한 변형을 통해 포함된 단백질의 양과 지정된 껍질 또는 입자 코어로의 맞춤 배열을 훌륭하게 제어할 수 있습니다. 또한 GFP가 포함되지 않은 순수 실리카 나노입자(C_U , C_U S_1U , 및 C_U S_1U S_2U ) 입자 특성에 대한 단백질 임베딩의 잠재적 영향을 조사하기 위해 합성되었습니다. 또한, 이 모든 단계에서 GFP는 두 가지 다른 완충 시스템(ʟ-아르기닌 및 NaHCO₃ ) 다양한 pH 값의 입자 합성, 형태, 형광 강도, 방출 파장 및 ζ 전위에 대한 단백질 용매의 영향을 결정합니다.

합성된 입자 및 입자 구조의 개요. 녹색은 각각 코어 또는 쉘에 GFP가 포함되었음을 나타냅니다. 회색은 GFP가 없는 껍질을 나타냅니다(C_F =코어 형광등, C_U =레이블이 없는 코어, S_F =쉘 형광등, S_U =라벨이 없는 쉘, S₁ =첫 번째 셸 레이어, S₂ =두 번째 셸 레이어)

나노입자 특성화

물리적 입자 속성의 결정

GFP 통합 후 입자 크기와 형태를 설명하고 이러한 특성에 대한 두 가지 다른 완충 시스템의 영향을 결정하기 위해 TEM 이미지를 기록했습니다(그림 1). GFP(NaHCO₃의 추가 TEM 이미지 ) 수정, GFP(ʟ-아르기닌) 수정 및 레이블이 지정되지 않은 나노 입자는 SI에 표시됩니다(추가 파일 1:그림 S1, 추가 파일 2:그림 S2, 추가 파일 3:그림 S3, 추가 파일 4:그림 S4). 두 개의 재성장 단계를 통한 합성 절차에 따라 세 가지 다른 입자 크기가 얻어졌습니다. 코어 입자의 크기는 약 15nm, 첫 번째 재성장 단계 후의 입자는 약 22nm, 두 번째 단계 이후의 입자는 약 32nm였습니다. 요약하면, 모든 나노입자는 거의 구형이었고 좁은 크기 분포를 나타냈습니다(p <10%). 완전히 염색된 3세대 GFP(ʟ-아르기닌) 나노 입자(C_F , C_F S_1F , 및 C_F S_1F S_2F ) 및 GFP(NaHCO₃ ) (C_F ) 코어 나노입자를 모델로 선택했습니다.

3세대 GFP-ʟ-아르기닌 변형 나노입자와 GFP(NaHCO₃ 코어 입자)의 TEM 이미지 ) 변형된 나노입자. a에서 , ㄷ 그리고 d , GFP(ʟ-아르기닌)의 3세대가 표시됩니다:C_F 코어 입자(a , d_TEM =15.5 ± 1.1 nm), C_F S_1F 첫 번째 재성장 단계 후 나노 입자(코어 + 쉘 1) (c , d_TEM =23.5 ± 2.0 nm) 및 C_F S_1F S_2F 두 번째 재성장 단계 후(코어 + 쉘 1 + 쉘 2) (d , d_TEM =35.3 ± 2.0 nm). b에서 , GFP(NaHCO₃ )-표지된 코어 나노입자(d_TEM =15.2 ± 1.2 nm) 표시됨

상이한 GFP 도핑 및 표지되지 않은 나노입자의 크기를 비교하면(표 1), 동일한 수의 재성장 단계가 단백질의 존재 또는 사용된 완충 용액과 무관하게 동일한 평균 입자 크기를 초래한다는 점은 주목할 만하다. 레이블이 지정되지 않은 입자도 비슷한 크기를 가졌습니다(C_U :d_TEM =13.4 ± 0.4nm, d_DLS =10 ± 3 nm; C_U S_1U :d_TEM =20.9 ± 1.3nm, d_DLS =20 ± 6 nm; C_U S_1U S_2U :d_TEM =33.2 ± 1.0nm, d_DLS =38 ± 10nm).

결론적으로, 단백질이 제공된 실리카 기질과 완충용액에 단백질의 혼입은 생성된 입자 크기 및 형태에 큰 영향을 미치지 않음을 입증하였다.

우리가 아는 한, 유사한 작은 크기와 똑같이 좁은 크기 분포(<10%)를 나타내는 문헌에 기술된 다른 GFP 내장 실리카 나노입자는 없습니다[20, 27]. 이러한 작은 나노입자는 암 진단 및 치료뿐만 아니라 세포 내 단백질 전달 분야에서 유망한 응용 가능성을 가지고 있습니다[28].

ζ-잠재력

모든 나노 입자의 ζ 전위는 전기 영동 이동성을 사용하여 계산을 통해 결정되었습니다. 모든 유형의 도핑된 나노입자는 - 28 ~ - 36 mV 범위의 절대값으로 음의 ζ 전위를 나타냈습니다(그림 2). 이에 비해 비표지 입자의 ζ 전위는 코어 입자의 경우 - 35.5 ± 2.0mV, 첫 번째 재성장 단계 후 - 34.0 ± 3.7mV 및 두 번째 단계 후 - 34.5 ± mV1.2로 매우 유사한 값을 나타냅니다. 이러한 높은 음의 ζ 전위(<− 28mV) 값은 정전기 반발로 인한 덩어리에 대한 나노 입자의 높은 안정성을 나타냅니다. 표지되지 않은 나노입자의 ζ 전위와 비교하여 데이터는 생성된 입자 크기나 입자 코어 또는 쉘의 입자 매트릭스에 GFP를 통합하는 것이 입자 전하에 상당한 영향을 미치지 않는다는 것을 나타냅니다.

표지된 나노입자의 ζ-전위 [mV]. 나노입자는 7.2mM ʟ-아르기닌 또는 10mM NaHCO₃에 용해된 GFP에서 시작하여 준비되었습니다. . 오차 막대 세 가지 측정에서 파생된 표준 편차를 나타냅니다.

분광학 연구

형광 분광기

모든 GFP 도핑된 실리카 나노입자는 유사한 최대 방출(λ _그들 =508 nm), 이는 유리 GFP의 최대 방출과도 비슷했습니다(SI, 추가 파일 5:그림 S5). 다양한 표지된 나노입자의 형광 강도를 비교하기 위해 나노입자 농도를 정규화했습니다(SI 5의 계산). 예상대로, 표지된 쉘을 단계적으로 추가하면 나노입자의 형광이 증가합니다(그림 3).

다양한 입자 시스템 각각에 대해 508nm에서 최대 방출의 정규화된 형광 강도입니다. 또한 이론적인 형광 강도(회색 점 ) 입자 부피의 증가와 관련하여 입자의 크기가 표시됩니다.

표지된 코어만 있고 도핑되지 않은 껍질이 있는 나노입자는 가장 낮은 형광성을 나타냈습니다. 하나의 추가로 표지된 껍질을 가진 나노입자는 중간 형광을 보였고, 두 개의 표지된 껍질을 가진 나노입자는 가장 강한 형광을 보였다(그림 3). 놀랍게도, 도핑되지 않은 외부 쉘의 추가는 도핑된 외부 층을 갖는 나노입자와 비교하여 나노입자의 형광을 약간 감소시키는 것으로 보였다. 이 효과는 라벨이 없는 실리카 쉘의 차폐 효과에 의해 유도될 수 있습니다. 요약하면, 코어 입자에 GFP가 도핑된 쉘을 추가하면 생성된 나노입자의 형광 강도가 증가하며 이는 나노입자 성장에 수반되는 부피 변화와 상관관계가 있는 것으로 보입니다.

정제 후 초기에 ʟ-아르기닌에 용해된 GFP의 포매는 NaHCO₃에 용해된 GFP에서 시작하여 아날로그 포매 공정을 통해 얻은 나노입자와 비교하여 생성된 나노입자의 형광 강도가 1.3배 더 높았습니다. . 유사하게, ʟ-아르기닌에 희석된 GFP는 NaHCO에 희석된 GFP에 비해 더 높은 형광 강도를 나타냈습니다₃ (추가 파일 5:그림 S5). 이 효과는 완충액의 다양한 pH 값으로 설명될 수 있습니다(pH_ʟ-arginine =10.3, pH\( _{{\mathrm{NaHCO}}_3} \) =9.2).

이러한 이유로 순수한 GFP의 형광은 pH 값의 함수로 체계적으로 측정되었습니다(SI, 추가 파일 6:그림 S6). 데이터는 pH 5.5 - 10.5 범위에서 pH가 증가함에 따라 형광의 쌍곡선 모양 증가를 보여주었습니다. 결과는 GFP의 pH 의존적 형광에 대한 다른 보고서와 일치합니다. 야생형 GFP의 경우, 형광은 pH 6 - 10 범위에서 변경되지 않지만 낮은 pH에서 감소하고 pH 값> 10에서 증가하는 것으로 보고되었습니다[29]. 또한 GFP의 pH 민감도는 점 돌연변이의 도입으로 수정될 수 있습니다[30]. 본 연구에 사용된 GFP는 Aequorea와 비교하여 3점 돌연변이를 가지고 있습니다. 야생형 단백질, 즉 S2A, F64L, S65T. 이들 중 트레오닌에 대한 65번 위치의 세린 치환은 이 아미노산이 발색단의 형성에 관여하기 때문에 480nm에서 여기될 때 단백질의 형광 강도를 증가시키는 것으로 나타났습니다. 또한 S65T/F64L 변이체는 pH 의존적 형광을 나타냅니다[30]. GFP 도핑된 나노입자(C_F )는 유사한 pH 의존성 형광을 나타내어(그림 3), pH 의존성 메커니즘이 임베딩 프로세스에 영향을 받지 않음을 나타냅니다.

형광 양자 수율

형광 나노 입자의 특성을 추가로 특성화하기 위해 양자 수율을 결정했습니다. 이는 통합된 형광 강도 대 488nm에서 흡광도를 표시하여 달성했습니다(그림 4). 그 후, 양자 수율은 수학식 1을 사용하여 계산되었다. 2. 로다민 6G를 기준으로 GFP가 도핑된 나노입자 C_F의 양자 수율 S_1F 순수한 GFP는 φ\( _{{\mathrm{C}}_{\mathrm{F}}{\mathrm{S}}_{1\mathrm{F}}} \) =0.62로 결정되었으며 φ_순수GFP =0.38, 각각. 두 번째 참조로 Atto488을 사용하여 결과를 확인했습니다(SI, 추가 파일 7:그림 S7). 순수한 GFP와 비교하여 GFP가 도핑된 나노입자의 더 높은 양자 수율은 GFP가 실리카 매트릭스에 캡슐화되어 발생하는 것으로 보이며 단백질의 공간적 고정 또는 실리카 매트릭스에 의해 제공되는 변경된 화학적 환경과 연결될 수 있습니다. .

GFP가 도핑된 입자와 순수 GFP의 통합 형광 강도 대 488nm에서의 흡광도 플롯입니다. 로다민 6G를 기준으로 사용했습니다. 선형 상관 관계는 직선으로 적합했습니다. . 해당 선형 방정식은 다음과 같습니다. y _순수GFP =1.00554 × 10 ¹⁰ × x , R ² =0.97712; y\( _{C_F{S}_{1F}} \) =6.12332 × 10 ⁹ × x , R ² =0.99331; 예 _로다민6G =4.1772 × 10 ⁹ × x , R ² =0.99678

입자 안정성

단백질 누출

GFP가 도핑된 나노입자의 결합 안정성을 입증하기 위해 침출 실험을 수행하였다. GFP(MW~27kDa)의 통과를 허용하지만 나노입자를 유지하는 MWCO로 막을 통한 한외여과 후, 여과액에서 형광이 검출되지 않아 GFP가 실리카 매트릭스에 영구적으로 결합되었음을 나타냅니다.

분석용 초원심분리

얻어진 결과를 뒷받침하고 입자 매트릭스에 결합하는 GFP의 유형을 결정하기 위해 분석 초원심분리를 수행했습니다. 이를 위해 C_F 레이블이 지정됨 S_1F S_2F 입자 및 레이블이 지정되지 않은 C_U S_1U S_2U particles mixed with GFP were measured at the same particle and GFP concentrations. The results (Additional file 8:Figure S8 in the SI) indicate that most of the GFP molecules are embedded into the silica matrix during the synthesis.

Thermal Stability

To determine their thermal stability, the fluorescence signals of C_F in comparison to pure GFP were measured after incubation at room temperature and 60 °C respectively (Fig. 5). After 24 h at room temperature, no decrease in the fluorescence of both samples was detectable, indicating no influence on the protein stability. However, after 24 h at elevated temperature of 60 °C, only 20% of the initial fluorescence intensity of C_F could be observed, whereas no fluorescence signal of pure GFP reverted. This strongly indicates a higher thermal stability of GFP-embedded silica compared to pure GFP. Since an elevated temperature leads to a significant increase in the thermal motions of the protein molecule, which can disrupt its structure, it is hypothesised that the surrounding silica matrix protected the GFP against external influences by spatial constraints.

Influence of temperature (r.t., 60 °C) on the fluorescence of GFP-doped particles (C_F , ʟ-arginine) and pure GFP. The normalised fluorescence intensity [%] of the emission maximum at 508 nm versus time [h] is shown

Photostability

Furthermore, the photostability of the samples was tested. For measurements, the nanoparticle stock suspension (C_F , ʟ-arginine) was diluted tenfold. Pure GFP was diluted in ʟ-arginine according to the calculated concentration of GFP in the nanoparticle suspension. After exposure of the samples to light of a green LED array over a period of time up to 20 min, the fluorescence intensity was measured (Fig. 6). Within 20 min, the fluorescence intensity of the nanoparticle suspension decreased only slightly. After 20 min, 89% of the initial fluorescence (100%) of the nanoparticles was preserved. In comparison, the pure GFP seemed to be more affected by light exposure. After 20 min, only 81% of the initial fluorescence of pure GFP remained. This result indicated, that GFP, when embedded into silica nanoparticles, was better protected from photochemical alterations induced by the LED light than the pure protein.

Photostability of GFP-doped nanoparticles (C_F ) and pure GFP in ʟ-arginine. The normalised fluorescence intensity [%] of the emission maximum at 508 nm was measured after exposure to LED light for the given times. Data are mean values. Error bars indicate the standard deviation

Stability Against Protein Degradation

As a further characterisation step, the degradation of GFP in the presence of proteinase K was tested. Therefore, three different systems were used (pure GFP, unlabelled C_U S_1U S_2U mixed with GFP and labelled C_F S_1F S_2F ). For all systems, equal amounts of GFP and particles were used. After 90 min of incubation, the fluorescence intensity of pure GFP and unlabelled particles with added GFP decreased to 5 - 7% of the initial fluorescence intensity, whereas the one of the labelled particles decreased to 52% (Fig. 7). This result indicates that the GFP is protected by the silica matrix and is degraded slower than free GFP in presence of proteolytic enzymes.

Stability against protein degradation of pure GFP (grey ), unlabelled particles mixed with GFP (C_U S_1U S_2U , blue ), and GFP-doped silica nanoparticles (C_F S_1F S_2F , green ). The normalised fluorescence intensity [%] of the emission maximum at 508 nm was plotted against the incubation time [min] with proteinase K

To conclude, the encapsulation of GFP into silica matrix appeared to bring about significant advantages:The stability of the protein was increased not only against elevated temperatures and light-induced photobleaching but also against the degradation through enzymes. Therefore, the silica matrix seems to protect the embedded GFP as compared to the free GFP.

Cellular Uptake Experiments

In order to determine, if the GFP-doped nanoparticles are able to deliver their cargo into cells, uptake experiments were performed (Fig. 8). A549 cells were exposed to GFP-doped nanoparticles and for comparison to the pure protein. In order to optimise the GFP load of the particles for imaging, a higher amount of GFP as compared to the nanoparticles described before was embedded into the particles. More specifically, a 20-fold amount of GFP in ʟ-arginine was used to label the second shell of the C_F S_1F S_2F 입자. These nanoparticles were diluted to a final concentration of 37 μg SiO₂ per millilitre in cell culture medium and incubated for 24 h with the cells. The amount of GFP in both samples (nanoparticles and pure GFP) was 5 μg mL ⁻¹ .

Confocal microscopy images of A549 cells after 24 h exposure to GFP dissolved in ʟ-arginine (A1 –A3 ) and GFP-doped nanoparticles C_F S_1F S_2F (B1 –B3 ), and control cells (C ). Top (1):merge-images; middle (2):Cell membrane (WGA):red; bottom (3):GFP, green . Arrows indicate internalised nanoparticles. Contrast and brightness were enhanced by using the ImageJ software

In order to visualise the cells, the cell membrane was labelled, using tetramethylrhodamine-coupled WGA (wheat germ agglutinin). Confocal imaging was used to localise the GFP-doped nanoparticles and the pure GFP in the cells. After exposure of cells to GFP, no signal related to GFP was observed inside the cell bodies (Fig. 8a). Compared to the control cells, no difference in signal intensity of both channels could be observed (Fig. 8c).

In contrast, after exposure of the cells to the GFP-loaded nanoparticles, bright fluorescence signals were detected in the perinuclear region, indicating internalisation of the loaded nanoparticles through endocytosis. The GFP-loaded nanoparticles appeared to be excluded from the nuclear compartment. A second fraction of agglomerated nanoparticles was detected on top of the cell membrane (Fig. 8b).

In conclusion, the GFP-doped nanoparticles are internalised by the cells and are able to transport their cargo into the cells. After exposure of the cells to GFP, fluorescence signals were not detected inside the cell body. This finding is in line with the results of Pesce et al. [31], who did not observe cell-associated fluorescence after incubation of A549 cells with GFP for 24 h. The lack of cell-associated GFP signals might be due to the fact that GFP is not internalised by the cells. Alternatively, GFP fluorescence might be quenched by the low pH value present in endocytic vesicles or lysosomes or degraded by proteolytic enzymes. Therefore, the fluorescence signals of the nanoparticles might indicate a protective effect of the silica nanoparticle matrix against lysosomal degradation.