자성 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 나노복합체:제조 방법이 항균성에 미치는 영향

방법

화학물질

철(III) 염화물 육수화물(FeCl₃ .6H₂ O, ≥ 98%), 염화철(II) 사수화물(FeCl₂ .4H₂ O, ≥ 99%), 수산화암모늄(26% NH₃ H₂에서 O), N-이소프로필-아크릴아미드(NiPAM, ≥ 99%), N,N-메틸렌비스(아크릴아미드)(BIS, ≥ 99%), 나트륨 도데실 설페이트(SDS, ≥ 99%) 및 과황산암모늄(APS, ≥ 98.5) %)는 모두 독일 Sigma-Aldrich에서 신선하게 구입했습니다.

에멀젼 중합에 의한 PNIPAAm의 제조

NiPAM(4g), BIS(0.2g) 및 SDS(0.3g)를 대기 질소 하에 70°C에서 350ml의 탈이온수(DI)에 용해했습니다. APS(0.0035g)를 DI 1ml에 용해하고 반응 용기에 첨가하여 반응을 시작했습니다. 4시간 후 반응을 멈추고 준비된 입자를 탈이온수로 세척하였다. 마지막으로 PNIPAAm 나노입자를 원심분리(30분 동안 12,000rpm)로 분리하고 추가 반응에 사용했습니다.

자철광 준비(Fe₃ O₄ ) 나노입자

FeCl₂ ·4H₂ O(1.9g) 및 FeCl₃ ·6H₂ O(5.4g)(몰비 1:2)를 DI(100ml)에 용해하고 70°C로 가열했습니다. 수산화암모늄(NH₄ 오; 6 ml)를 용액에 빠르게 첨가하여 즉시 진한 흑색 자성 침전물을 생성하였다. 마지막으로 Fe₃ O₄ 나노입자 현탁액을 70°C에서 30분 동안 교반했습니다. 제품을 DI로 여러 번 세척한 후 Fe₃ O₄ 미세 분말이 형성될 때까지 회전 증발기(40°C에서 25mbar)에서 나노입자를 건조했습니다. 이것은 모든 추가 반응에 사용되었습니다.

에멀젼 중합에 의한 자성 PNIPAAm 나노복합체의 제조(Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1)

NiPAM(0.4 g), 신선하게 준비된 Fe₃ O₄ 나노입자(0.2g), BIS(0.2g) 및 SDS(0.3g)를 DI 350ml에 용해하고 질소 분위기에서 70°C로 가열했습니다. 그런 다음 APS(0.0035g)를 1ml의 DI에 용해시키고 반응 용기에 첨가하여 반응을 시작했습니다. 4시간 후 반응을 멈추고 제조된 나노복합체를 DI로 세척하였다. 마지막으로 Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1을 원심분리(30분 동안 12,000rpm)로 분리한 다음 회전 증발기를 사용하여 건조했습니다(40°C에서 25mbar). 분말 재료는 실온의 암실에 보관했습니다.

원위치 침전(Fe₃을 통한 자기 PNIPAAm 나노복합체 제조) O₄ -PNIPAAm-2)

FeCl₂ (0.148 g), FeCl₃ (0.4g) 및 10ml DI를 잘 혼합하고 1g의 PNIPAAm에 첨가했습니다. NH₄ 그런 다음 OH(3ml)를 용액에 빠르게 첨가하여 즉시 진한 흑색 자성 침전물을 생성했습니다. 그런 다음 현탁액을 70°C에서 30분 동안 교반했습니다. 제조된 나노복합체를 DI로 세척한 후 Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2를 원심분리(30분 동안 12,000rpm)로 분리하고 회전 증발기(40°C에서 25mbar)를 사용하여 건조했습니다. 생성된 분말은 실온의 암실에서 보관되었습니다.

물리적 첨가를 통한 자성 PNIPAAm 나노복합체의 제조(Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3)

신선하게 준비된 PNIPAAm(1g), 신선하게 준비된 Fe₃ O₄ 나노입자(0.5g) 및 DI(5ml)를 잘 혼합하고 생성된 현탁액을 70°C에서 30분 동안 교반했습니다. 이렇게 제조된 나노복합체를 DI로 세척한 후 Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3을 원심분리(30분 동안 12,000rpm)를 통해 분리하고 회전 증발기(40°C에서 25mbar)를 사용하여 건조했습니다. 분말 재료는 실온의 암실에 보관했습니다.

나노복합체 특성화

Fe₃의 크기와 제타 전위 O₄ -PNIPAAm 나노복합체는 DI에 나노입자가 완전히 용해된 후 측정되었습니다(DI에 분산시킨 후 실온에서 2분 동안 초음파 처리). Zetasizer Nano 분석기(Malvern Instruments, USA)를 사용하여 pH 7에서 제타 전위 측정을 수행했습니다. Zetasizer Nano 동적 광산란(DLS) 장치를 사용하여 DI에서 입자 응집체의 유체역학적 직경을 측정했습니다. 코팅의 양을 정량화하고 나노복합체의 열 안정성을 결정하기 위해 열중량 분석(TGA)이 수행되었습니다. 열 연구는 질소 분위기(가열 속도 10°C/분)에서 TGA Q500(TA Instruments, USA)을 사용하여 25~900°C 범위의 온도에서 3~4mg의 건조 샘플에 대해 수행되었습니다. 재료의 자기적 특성은 MicroMag™ 2900 진동 샘플 자력계(Princeton Measuring Corporation, USA)를 사용하여 측정되었습니다. 주사 전자 현미경(SEM)을 사용하여 현미경 이미지를 얻었으며, 입자는 먼저 DI에 완전히 용해되고 용액 한 방울은 쇼트키 음극이 장착된 Zeiss ULTRA Plus 전계 방출 SEM의 구리 그리드에 놓였습니다. 모든 이미지는 1.5kV에서 작동하는 이미징용 Smart SEM 소프트웨어 v 5.05(Zeiss, Germany)를 사용하여 분석되었습니다.

세균 균주 및 배지

그람 음성 대장균 CCM3954 및 그람 양성 황색 포도상구균 CCM 3953(Brno, Czech Republic)은 모든 실험에 사용되었습니다. 균주에 대한 자세한 정보는 'Czech Collection of Microorganisms' 웹페이지(http://www.sci.muni.cz/ccm/)에서 제공됩니다. 각 박테리아 배양물은 생물학적 실험을 수행하기 전에 신선하게 준비되어 대두 영양액(Sigma-Aldrich)에 밤새 보관되었습니다.

DNA 손상

혜성 분석은 Singh et al.의 방법론에 따라 수행되었습니다. [15] 및 Solanky et al. [16]. 달리 명시되지 않는 한 모든 화학 물질은 PENTA(체코 공화국)에서 구입했습니다. 신선한 박테리아 배양(10 ⁷ 으로 조정됨 세포/ml)을 밤새 성장시킨 다음 두 가지 농도(0.1 및 1g/l)의 PNIPAAm 및 각각의 Fe₃와 함께 배양했습니다. O₄ -37°C에서 30분 동안 PNIPAAm 나노복합체

슬라이드의 젖빛 표면에 100ml의 아가로스를 넣고 24×50mm 커버 유리(ThermoFisher Scientific, USA)로 덮어 마이크로겔을 준비했습니다. 슬라이드를 실온에서 5분 동안 방치한 다음 커버 유리를 제거하고 슬라이드를 건조했습니다. 이 건조된 아가로스 층(첫 번째 층)은 후속 층을 위한 견고한 기반을 제공했습니다. 박테리아를 PNIPAAm 및 Fe₃에 노출시킨 후 O₄ -PNIPAAm 나노복합체를 30분 동안 2μl(약 10,000개의 노출된 세포 포함)을 취하여 새로 준비된 0.5% 아가로스 100μl와 혼합했습니다. 이 혼합물을 젖빛 슬라이드에 피펫으로 옮기고 즉시 덮개 유리(두 번째 층)로 덮었습니다. 그런 다음 슬라이드를 얼음 위의 강철 트레이에서 냉각했습니다. 1분 후 덮개 유리를 제거하고 100μl의 용해 아가로스(5μg/ml RNAse A가 포함된 0.5% 아가로스[Ameresco, USA], 0.25% 나트륨 N-라우로일사르코신 및 0.5mg/ml 리소자임 포함)의 세 번째 층을 제거했습니다. 다시 덮개 유리를 사용하여 제작되었습니다. 그런 다음 슬라이드를 10분 동안 얼음 위에 둔 다음 37°C에서 30분 동안 습한 챔버에 넣었습니다. 커버 유리를 제거한 후 슬라이드를 2.5M의 NaCl, 100mM의 EDTA 사나트륨 염, pH 10의 10mM 트리스 완충액, 1% 라우로일 사르코신 나트륨 및 1% 트리톤 X-100을 포함하는 용해 용액에 담그었습니다. 실온에서 1시간의 용해 후, 슬라이드를 2.5M의 NaCl, 10mM의 EDTA 및 10mM의 트리스 pH 7을 포함하는 효소 소화 용액으로 옮겼습니다. 1mg/ml의 프로테이나제 K가 포함된 4개의 완충액 37°C에서 2시간 동안 배양한 후 전기영동 장치(Scie-plas, UK)의 수평 슬래브에 놓고 300mM의 아세트산나트륨 및 100mM pH 9 트리스 완충액으로 20분 동안 평형화한 다음 30분 동안 12V(0.4V/cm, 약 100mA) 전기영동 후 슬라이드를 에탄올 중 1M 암모늄 아세테이트(10M 암모늄 아세테이트 5ml 및 무수 에탄올 45ml)에 20분, 무수 에탄올 0.5시간, 70% 에탄올에 10분 담근 후 슬라이드를 사용합니다. 실온에서 공기 건조시켰다. 균일한 염색을 위해 슬라이드를 새로 준비한 5% TE 완충액과 10mM의 NaH₂ 용액 50ml로 전처리했습니다. PO₄ . 그런 다음 슬라이드를 TE 완충액에서 새로 준비된 1mM SYBR 염색 용액(Sigma-Aldrich, USA) 50μl로 30분 동안 염색했습니다. X 400 배율의 AxioImager 형광 현미경과 AxioVision v 4 소프트웨어(Zeiss, Germany)를 사용하여 DNA 가닥 파손(혜성)의 이동을 시각화했습니다. 일반적으로 50개의 혜성의 꼬리 길이는 각 샘플에 대해 개별적으로 측정되었습니다.

박테리아 성장률, 세포 생존율 및 형태

실험 프로토콜은 Darwish et al. [17]. 간단히 말해 Fe₃ O₄ -PNIPAAm 나노복합 스톡 현탁액(10g/l)을 0.01, 0.05, 0.5 및 1g/l의 최종 농도를 얻기 위해 신선한 박테리아 배양물에 첨가했습니다. 각 농도는 24웰 플레이트에서 3중으로 생성되었습니다. 성장 배지 및 Fe₃에서만 박테리아 세포로 구성된 음성 대조군 O₄ -PNIPAAm 나노복합체는 성장 배지에서만 병렬로 실행되었습니다. 그런 다음 플레이트를 37°C에서 배양한 다음 Synergy™ HTX 플레이트 판독기(Biotek, USA)를 사용하여 6시간 동안 2시간마다 샘플의 광학 밀도를 600nm(OD600)에서 측정했습니다. 박테리아 성장률은 OD600 측정(흡광도 단위, AU) 대 배양 시간(시간)의 R 선형 회귀로 정의되었습니다. 세포가 없는 나노복합체 샘플의 예비 측정(600nm에서 6시간)은 박테리아 세포로 측정한 나노복합체의 흡광도 값을 방해하지 않는 일정한 흡광도 값을 보여주었습니다.

박테리아 성장 속도에 대한 10% 억제(EC10)에서 나노복합체의 유효 농도(µ )는 Fe₃의 각 형태에 대해 계산되었습니다. O₄ - PNIPAAm:I 방정식 기반 (%) =(μ _C -μ _T )/μ _C ×100, 여기서 나 억제, µ _C 는 평균 대조군 성장률 값이고 μ _T 는 나노복합체에 의해 영향을 받는 배양물의 성장률이다[18].

24시간 배양 후 각 샘플의 100μl 분취량을 L7007 Bacterial Viability Kit(Molecular Probes, Invitrogen, USA)를 사용하여 암실에서 15분 동안 염색했습니다. 살아있는 세포(Ex/Em 485/528 nm)와 죽은 세포(Ex/Em 485/645 nm)의 비율 측정은 Synergy™ HTX 플레이트 판독기(Biotek, USA)를 사용하여 수행되었습니다. 죽은 세포의 비율은 살아있는 세포에 대한 죽은 세포의 비율로 계산되었습니다. 동시에 E의 이미지. 대장균 및 S. 구균 Ex/Em 470/490–700 nm의 AxioImager 형광 현미경(Zeiss, Germany)을 사용하여 얻었다. 의 길이 E. 대장균 S의 세포와 면적. 구균 AxioVision v 4 소프트웨어(Zeiss, Germany)를 사용하여 x 600 배율에서 세포 클러스터를 결정했습니다.

통계 분석

PNIPAAm에서 배양된 박테리아 균주의 차이점, 다른 Fe₃ O₄ -PNIPAAm 나노복합체 및 나노복합체가 없는 대조군 샘플은 ANOVA 및 Dunnett's test(GraphPad PRISM, USA)를 사용하여 테스트되었습니다.

결과

이 연구에서 우리는 Fe₃를 합성했습니다. O₄ - 세 가지 다른 프로토콜을 사용하는 PNIPAAm 나노복합체:에멀젼 중합(Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1), 현장 강수(Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2) 및 물리적 추가(Fe₃ O₄ -PNIPAm-3). SEM 이미징은 사용된 프로토콜 유형이 Fe₃와 함께 샘플 형태와 입자 크기에 명확한 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. O₄ -PNIPAm-1, Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 및 Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3은 나노입자 사이의 높은 표면 에너지로 인한 광범위한 크기 분포, 응집 및 자기 쌍극자 상호작용의 존재를 나타냅니다. ( 그림 1 ) .

PNIPAAm의 주사 전자 현미경 이미지 및 히스토그램(a ), Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1(b ), Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2(c ) 및 Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3(d ). 스케일 바 =200nm

TGA는 Fe₃ O₄ -PNIPAAm 샘플은 400°C 이상의 온도에서 비교적 안정했습니다(그림 2). 전반적으로, PNIPAAm 나노입자는 Fe₃보다 낮은 잔류 함량을 보였습니다. O₄ -PNIPAAm 나노복합체. 표면 전하에 대한 제타 전위 값은 PNIPAAm의 경우 - 1.58mV, Fe₃의 경우 - 15.6mV였습니다. O₄ -PNIPAm-1, − 16.4mV(Fe₃) O₄ -PNIPAm-2 및 − 1.8mV(Fe₃) O₄ -PNIPAAm-3. 자화 포화에 대한 진동 샘플 자력계 값은 Fe₃의 경우 50.4emu/g이었습니다. O₄ -PNIPAAm-1, Fe₃용 53.7 emu/g O₄ -Fe₃용 PNIPAAm-2 및 21.0 emu/g O₄ -PNIPAAm-3. 위(45 °C) 및 (25 °C) 미만의 동적 광 산란 LCST는 PNIPAAm의 유체역학적 크기를 25°C에서 50nm 및 45°C에서 27nm로 나타냈습니다. Fe₃의 경우 25°C에서 412nm 및 45°C에서 197nm O₄ -PNIPAAm-1; Fe₃의 경우 25°C에서 212nm 및 45°C에서 130nm O₄ -Fe₃의 경우 PNIPAAm-2 및 25°C에서 122nm 및 45°C에서 60nm O₄ -PNIPAAm-3(그림 3).

PNIPAAm(a), Fe₃의 열중량 분석 O₄ -PNIPAAm-1(b), Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2(c) 및 Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 (d)

PNIPAAm(a)에 대한 하한 임계 용액 온도 상전이(25°C) 및 이상(45°C)의 동적 광산란 ), Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1(b ), Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2(c ) 및 Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3(d )

Fe₃ O₄ - 박테리아 DNA에 대한 PNIPAAm 나노복합체 효과

30분의 짧은 노출 후 두 E에 대한 DNA 가닥 파손이 결정되었습니다. 대장균 및 S. 구균 Fe₃로 처리된 세포에서 O₄ -PNIPAAm 나노복합체, 40% EtOH(양성 대조군) 및 미처리 세포(음성 대조군). 모든 Fe₃ O₄ -PNIPAAm 나노복합체는 유사하게 유의미한 효과를 나타냈습니다(P <0.001) 평균 E. 대장균 및 S. 구균 나노복합체 없이 배양된 대조군 세포와 비교하여 모든 농도에서 혜성 꼬리 길이(그림 4).

대장균의 예 혜성 꼬리, Fe₃ 처리 후 O₄ -PNIPAAm-3(a ). Escherichia coli의 DNA 가닥 절단 결과(혜성 꼬리 길이) (b ) 및 황색 포도상구균 (ㄷ ) 40% EtOH(양성 대조군), 나노복합체(음성 대조군), PNIPAAm(0.1 및 1g/l) 및 (1) Fe₃ 없이 30분 동안 인큐베이션 O₄ -PNIPAAm-1, (2) Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 및 (3) Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3(오차 막대는 50개 세포의 혜성 길이에 대한 SD를 나타냄). 유의 수준 ***P <0.001

Fe₃ O₄ -PNIPAAm 나노복합체 항균 효과

성장 속도는 그람 양성 S를 나타냅니다. 구균 그람 음성 E보다 내성이 낮았습니다. 대장균 6시간 노출 후 모든 나노복합체에 Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 및 Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2는 모두 PNIPAAm 및 Fe₃에 비해 박테리아 성장을 강력하게 억제했습니다. O₄ -PNIPAAm-3, E. 대장균 성장률이 0.08에서 0.028로 크게 감소했습니다(P <0.001) Fe₃ 포함 O₄ -PNIPAAm-2 및 0.005(P <0.001) Fe₃ 포함 O₄ -PNIPAAm-1(1g/l). E에서는 효과가 관찰되지 않았습니다. 대장균 PNIPAAm 또는 Fe₃에 의한 성장률 O₄ -PNIPAAm-3(그림 5a). 이에 비해 S의 성장률은 구균 모든 Fe₃의 영향을 받았습니다. O₄ -PNIPAAm 나노복합체 및 PNIPAAm 나노입자에 의한 것. 더 낮은 농도(0.01 g/l 및 0.05 g/l)에서 성장률은 0.07에서 0.06으로 약간 감소했습니다(P <0.05). 그러나 더 높은 농도(0.5 및 1g/l)에서 PNIPAAm의 경우 0.07에서 0.001로, Fe₃의 경우 0.0으로 상당한 감소가 있었습니다. O₄ -PNIPAAm-1, Fe₃ 포함 0.01 O₄ -PNIPAAm-2 및 Fe₃ 포함 0.009 O₄ -PNIPAAm-3(모든 P <0.001; 그림 5b). 또한 모든 Fe₃용 EC10 O₄ -PNIPAAm 나노복합체 및 PNIPAAm 나노입자 대조군은 S에 대해 더 낮았습니다. 구균 E에 대한 것보다. 대장균 (표 1).

대장균의 상대 성장률 (아 ) 및 황색 포도상구균 (b ) PNIPAAm(빨간색 원), Fe₃의 다양한 농도(0.01, 0.05, 0.5 및 1g/l)에서 6시간 배양 후 O₄ -PNIPAAm-1(오렌지 다이아몬드[1]), Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2(녹색 삼각형[2]) 및 Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3(파란색 삼각형[3]). 오차 막대는 n에서 계산된 SD를 보여줍니다. =3. 유의 수준 ***P <0.001

사망한 비율 E. 대장균 Fe₃ 농도 증가에 따라 세포 증가 O₄ - 24시간 후의 PNIPAAm 나노복합체. 예를 들어, PNIPAAm(0.5 및 1g/l)은 E의 상당한 증가를 야기했습니다. 대장균 Fe₃가 없는 배양과 비교하여 죽은 세포(20%) O₄ -PNIPAAm 나노복합체(12%). Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1(0.5g/l)은 최대 28%의 사망 E를 초래했습니다. 대장균 세포 및 1g/l에서 32%(P <0.001). Fe₃의 효과 O₄ -PNIPAAm-2는 Fe₃보다 낮았습니다. O₄ -PNIPAAm-1 및 Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3, 각각 0.01 및 1g/l 농도에 노출되었을 때 죽은 세포의 비율이 13%에서 25%로 증가했습니다(P <0.001). 0.5 및 1g/l에서 Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3은 약 25%의 죽은 세포를 생성했습니다(P <0.001; 그림 6a). 죽은 S의 비율. 구균 세포는 1g/l Fe₃에 의해서만 상당한 영향을 받았습니다. O₄ -PNIPAAm-1 및 Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3, 죽은 세포가 각각 최대 50% 및 48%에 도달함(P <0.001). 나노복합체가 없는 대조군은 약 18%의 죽은 세포를 함유한 반면 낮은 농도의 PNIPAAm, Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 및 Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3, 죽은 세포의 비율은 훨씬 낮았습니다. 0.5 및 1g/l 농도의 PNIPAAm은 25% 및 30%(P <0.005) 각각 죽은 세포. Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2는 S에 영향을 미치지 않았습니다. 구균 문화(그림 6b).

죽은 대장균의 비율 (아 ) 및 황색 포도상구균 (b ) PNIPAAm 및 (1) Fe₃에 24시간 노출 후 세포 O₄ -PNIPAAm-1, (2) Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 및 (3) Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3. 오차 막대는 n의 SD를 표시합니다. =3. 유의 수준 *P <0.05, **P <0.005, ***P <0.001

평균 E에는 차이가 없었다. 대장균 세포 길이(5μm) 및 평균 S. 구균 세포 클러스터 면적(200μm ² ) 가장 낮은 농도(0.1g/l, 그림 7)에서 모든 나노복합체 또는 PNIPAAm 대조군의 경우. 더 높은 농도에서 E. 대장균 길이는 Fe₃가 있을 때 변경되지 않았습니다. O₄ -PNIPAAm-2, S도 마찬가지입니다. 구균 Fe₃ 존재 시 세포 그룹 영역 O₄ -PNIPAAm-1. 그러나 E. 대장균 길이는 1g/l의 PNIPAAm(5.4μm, P <0.005), Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1(6μm, P <0.001) 및 Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3(10μm, P <0.001) (그림 7a), 반면 S. 구균 PNIPAAm에 노출되었을 때 더 큰 클러스터 형성(1937 μm ² , 피 <0.001), Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2(924μm ² , 피 <0.001) 및 Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3(1722μm ² ) , 피 <0.001) (그림 7b).

대장균의 길이 셀(a ) 및 황색 포도상구균 군집 면적 셀(b ) PNIPAAm 및 (1) Fe₃와 함께 24시간 배양 후 O₄ -PNIPAAm-1, (2) Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 및 (3) Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3. 오차 막대는 n에서 결정된 SD를 보여줍니다. =50. 유의 수준 **P <0.05 및 ***P <0.001

토론

합성 방법과 고분자 매트릭스에 자성 나노입자를 첨가하는 방법 모두 자성 Fe₃의 고유한 물리화학적 특성에 분명한 영향을 미쳤습니다. O₄ -PNIPAAm 나노복합체. 단계적 합성은 나노복합체 특성에 강한 영향을 미쳐 입자 모양, 크기 분포, 크기 및 표면 화학의 변화를 가져오고 자기 특성의 후속적인 변화를 초래했습니다[19, 20]. 유화 중합(Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1), 쉽고 정확한 방법은 좁은 입자 크기 분포와 가장 낮은 응집 경향을 갖는 안정적인 나노복합체를 생성했으며, 이는 특히 생물의학 응용 분야에서 중요한 특성입니다[17]. 입체 및 쿨롱 반발의 결과로 생성된 입자 크기는 침전을 피할 수 있을 정도로 충분히 작습니다[21]. 가장 덜 효과적인 방법은 물리적 추가(Fe₃ O₄ -PNIPAm-3). 그것은 세 가지 별개의 단계를 통해 생산되었기 때문에 준비하는 데 더 오랜 시간이 걸렸을 뿐만 아니라, 생성된 나노복합체는 다른 두 가지 생산 방법보다 더 높은 응집을 보였습니다. 또한, 우리의 결과는 Fe₃ O₄ - 이러한 방식으로 생성된 PNIPAAm-3에는 바람직하지 않은 PNIPAAm 및 Fe₃가 포함되었을 수 있습니다. O₄ 나노 입자 잔류물.

폴리머는 물리적(비공유) 또는 공유 결합에 의해 자기 나노입자에 부착될 수 있으며 합성 경로에 따라 특정 특성을 나타내는 하이브리드 물질이 생성됩니다. 하이브리드 나노입자 형성이 일어나는 용매에서 제조가 진행되면 자성 나노입자의 상당한 재현탁이 일어나며, 이로 인해 응집 및 편석이 문제가 될 수 있다. 이 경우 자성 나노입자의 in situ 형성이 많은 경우에 더 나은 대안이 될 수 있습니다. 또한, 계면 활성제 농도가 너무 낮으면 유착으로 인해 액적의 크기가 변경되는 반면 농도가 너무 높으면 미셀이 형성되어 미셀 핵이 생성될 수 있습니다. 이와 관련하여 무기 입자 표면이 폴리머 매트릭스와 양립할 수 있도록 하기 위해 표면 특성의 정확한 특성과 입자 변형 정도에 따라 계면활성제 농도를 신중하게 선택하는 것이 중요합니다.

Fe₃의 자기적 특성을 평가하기 위해 O₄ -PNIPAAm 나노복합체의 경우, 나노복합체에서 MNP의 함량을 아는 것이 중요합니다. TGA는 MNP의 양을 정량화하고 Fe₃의 열적 안정성을 조사하기 위해 사용되었습니다. O₄ - PNIPAAm 나노입자 단독과 비교한 PNIPAAm 나노복합체. Fe₃ 3개 모두 O₄ -PNIPAAm 나노복합체는 아마도 Fe₃의 존재로 인해 PNIPAAm 나노입자보다 더 높은 열 안정성을 나타냈습니다. O₄ 매트릭스의 입자(그림 2). 자성 나노복합체의 더 높은 잔류물은 무기 Fe₃의 존재에 기인할 수 있습니다. O₄ 더 높은 온도에서도 유지되는 샘플의 화합물.

Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1은 가장 낮은 중량 손실과 함께 가장 높은 열적 나노복합체 안정성을 보였다. 200°C까지 체중 감소의 주요 원인은 수분 손실과 폴리머 층의 물리적 흡착을 통한 것이었습니다[22]. 그러나 200°C 이상에서 손실은 주로 PNIPAAm을 결합하는 화학 층의 분해로 인한 것입니다. 400°C 이상에서 안정한 시료 잔류물은 원래 중량의 87%를 차지했으며, 이는 나노복합체의 자성 나노입자의 양에 해당합니다. One aim of this preparation process was to produce a nanocomposite with magnetic properties preventing aggregation and enabling it to re-disperse rapidly as soon as the magnetic field is turned off. Such properties would allow its use in a range of different fields, including hyperthermic treatment of tumours, as contrasting agents in magnetic resonance imaging, in tissue repair, biomedical device coating, immunoassay, cell separation and biomagnetic separation of biomolecules [18, 23,24,25,26]. We tested our nanomaterials through magnetisation saturation, which assesses the maximum possible magnetisation of the substance beyond which no further change takes place despite an increase in the magnetic field. Our results showed Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 to have the highest magnetisation saturation level of the three nanocomposites tested. Our values were lower (53.7 emu/g) than those previously reported for uncoated Fe₃ O₄ nanoparticles (92 emu/g) [27], however, presumably due to surface order/disorder interactions in the magnetic spin moment and an increase in nanocomposite weight and volume due to the presence of the PNIPAAm polymer layer.

Of special interest as regards biomedical application is the behaviour of polymer-water solutions stable below a LCST [28]. After heating the prepared Fe₃ O₄ -PNIPAAm nanomaterials above the transition temperature, a coil-to-globule transition occurred, followed by inter-molecular association. All three Fe₃ O₄ -PNIPAAm nanomaterials displayed very similar behaviour, with all shrinking as temperature increased. PNIPAAm is widely used as a thermoresponsive polymer due to the proximity of its LCST (~ 30–32 °C) to physiological temperature. Furthermore, the thermo-responsibility of PNIPAAm has proved useful for drug release in vivo [28]. Nanoscale magnetic hydrogels based on PNIPAAm have now been developed for theranostic application, with those embedded with low concentrations of Fe₃ O₄ magnetic nanostructures resulting in an LCST of ~ 40 °C, making Fe₃ O₄ -PNIPAAm of especial interest for controlled drug release application [29].

SEM nanoparticle histograms displayed a broader size distribution than those using DLS (Fig. 1). Interpretation of DLS data involves the interplay of multiple parameters, however, including the size, concentration, shape, polydispersity and surface properties of the particles. Measurement of the hydrodynamic size of thermoresponsive samples in relation to temperature is a common method of characterising LCST behaviour, with nanoparticles shrinking as temperatures increase, soluble polymers precipitating and particle size increasing. As expected, PNIPAAm had a lower hydrodynamic size than the Fe₃ O₄ -PNIPAAm nanocomposites. Of the nanocomposites, Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 displayed the lowest hydrodynamic size and a narrow size distribution. Variability in hydrodynamic size is likely to be due to the presence of Fe₃ O₄ nanoparticles in the PNIPAM matrix, which increases both the particle dimension and aggregation in water (Fig. 3) [8].

All Fe₃ O₄ -PNIPAAm nanocomposites displayed antimicrobial properties (Table 2), with both Gram-negative and Gram-positive bacteria negatively affecting E. 대장균 growth rate in the order Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 > Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 > Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 = PNIPAAm and S. 구균 growth rate as Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 > Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 > Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 > PNIPAAm. Similarly, the antibacterial properties desired for medical applications such as biomedical device coatings and wound dressing materials have been confirmed for a number of new PNIPAAm composites, including ZnO-PNIPAAm, Ag-PNIPAAm and chitosan-PNIPAAm [23,24,25,26].

In comparison with the modified Fe₃ O₄ nanomaterials described in our earlier studies, the PNIPAAm-1, PNIPAAm-2 and PNIPAAm-3 nanocomposites all showed a stronger effect on both E. 대장균 및 S. 구균 , with S. 구균 EC10 growth inhibition ranging from 0.04 to 0.06 g/l for the three nanomaterials, while modified APTS-, PEG- and TEOS-MNPs ranged between 0.1 and 0.25 g/l [17], and polymer-coated Fe₃ O₄ (PEI-mC-, PEI- and OA-MNPs) had a value of 0.15 g/l [18]. Inhibition of bacterial growth could have been caused by several factors, including cell membrane damage, oxidative stress and cell elongation, resulting in the production of lethal cells. The cells could, on the other hand, survive such unfavourable conditions by employing repair enzymes, antioxidants and/or transient growth arrest. This could partly explain the phenomenon that in lower concentrations (0.01 and 0.05 g/l) of PNIPAAm, Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 and Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3, the proportion of dead cells of S. 구균 was lower after 24-h incubation than in control where no such factor inducing mobilisation of the defence/repair system was present. Higher concentrations of PNIPAAm and nanocomposites caused indeed significant increase in dead cells of E. 대장균 및 S. 구균 corresponding well with significant decrease in growth rate of the cell cultures.

Exposure to 1 g/l of the nanocomposite resulted in changes to bacterial cell morphology, with greatest change to E. 대장균 cell length caused by Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 > Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 > PNIPAAm > Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2, and Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 > Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 > PNIPAAm > Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 for S. 구균 clustering. This effect was also observed previously when the same bacteria were exposed to different functional magnetic nanoparticles [17]. Elongation of E. 대장균 cells in the presence of nanocomposites is indicative of transient growth arrest and is evidence of an adaptive response to oxidative stress or DNA damage [30]. In the case of S. 구균 , which is a biofilm formation species, the cells became embedded over a larger area than the nanocomposite-free control when exposed to PNIPAAm, Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 and Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 (Fig. 8). No S. 구균 biofilm was produced when in contact with Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1, possibly due to its stronger antibacterial properties. S. 구균 usually produces a biofilm in harsh environments to protect the cells [31]; however, this could also have an adverse effect on the bacteria as nanocomposites can integrate through the biofilm and harm the cells, as has already been described for Pseudomonas sp. [32].

S. 구균 cell culture without nanocomposites (a ) and the cells embedded in biofilm after incubation with nanocomposites for 24 h (b ). The scale bar is 10 μm

Iron could lead to DNA damage in bacterial cells as described in previous reviews [33, 34]; hence, we attempted to test whether our MNPs caused DNA damage to bacteria. The presence of Fe₃ O₄ -PNIPAAm nanocomposites at both low and high concentrations (0.01 or 1 g/l) caused significant damage to E. 대장균 및 S. 구균 DNA, even after short exposures (30 min). To the best of our knowledge, this is the first acute genotoxicity study of magnetic composites on bacteria; as a result, we cannot compare our results with those of other authors directly. Previous studies have shown no genotoxicity attributable to PNIPAAm nanoparticles, however, and no decrease in cell viability when tested against two kinds of mammalian cell at nanoparticle concentrations of up to 800 mg/l [30]. On the other hand, previous genotoxicity studies on MNPs (γ-Fe₃ O₄ ) have shown a negative effect on human fibroblast cells at 100 mg/l [35]. Studies performed with mammalian cell lines, however, cannot be directly compared to studies done with bacterial cells, due to significant differences in eukaryotic and prokaryotic cells.

Conclusions

Magnetic poly(N-isopropyl-acrylamide) nanocomposites were prepared through emulsion polymerisation (Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1), in situ precipitation (Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2) and physical addition (Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3). Both Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 and Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 showed higher values for surface charge and thermal stability, indicating a stable colloidal system. At room temperature, Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 displayed highest magnetisation saturation. Presence of Fe₃ O₄ -PNIPAAm nanocomposites at both low and high concentrations caused significant damage to both E. 대장균 및 S. 구균 DNA, even after short exposure, and led to a decrease in cell viability. Overall, we suggest that Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1, prepared through emulsion polymerisation, is the most appropriate method for producing a magnetic nanocomposite with high antimicrobial activity towards Gram-negative E. 대장균 and Gram-positive S. 구균 .

약어

Fe₃ O₄ -PNIPAAm:

Magnetic poly(N-isopropylacrylamide)

MNPs:

Magnetite nanoparticles

콘드로이틴 황산염-메토트렉세이트 나노겔의 항종양 연구 광열 치료 및 광음향 영상을 위한 폴리피롤 코팅 철-백금 나노입자의 합성 및 시험관 성능