GoldMag: PSS-MA 코팅으로 단백질 검출용 안정성 및 광학 정밀도 향상

요약

금 자기 나노입자(GoldMag)는 개별 Fe₃O₄와 Au 나노입자의 특성을 결합한 독특한 물리화학적 성능으로 큰 주목받고 있습니다. GoldMag를 고분자로 코팅하면 완충액 내 복합 입자 안정성 증가뿐만 아니라 임상 관련 생체분자 현장 진단 광학 테스트 구축에 핵심 역할 합니다. 본 논문에서는 양전하 GoldMag(30nm) 표면에 음전하 폴리전해질인 폴리(4-스티렌설폰산-co-말레산)(PSS-MA)을 코팅했습니다. PSS-MA 코팅 GoldMag 복합체는 544nm에서 안정한 플라즈몬 공명 흡수 피크 가집니다. 한 쌍의 항-D-다이머 항체를 이 GoldMag 복합 나노입자 표면에 결합시키고, 표적 단백질 D-다이머를 0.3-6μg/mL 범위에서 검출했습니다. D-다이머-항체 샌드위치 브리지 형성으로 인한 GoldMag 조립에 의한 특성 피크 이동으로 검출 가능.

배경

초상자성 등 특정 자화 특성 활용하여 자기 나노입자는 약물/유전자 전달, 자기공명영상, 생물학적 분석 등 생물의학 응용 널리 연구[1-3]. 금 자기 나노입자(GoldMag, Fe₃O₄/Au 구성)는 산화철 나노입자 물리화학적 특성뿐만 아니라 금 나노입자 특성(쉬운 표면 기능화, 독특한 광학 특성)도 겸비. 이러한 차별적 특징으로 생물학 분야, 특히 광학 특성 기반 생체분자 검출에 큰 관심[4,5]. 예: Wang 등은 Fe₃O₄-Au 나노로드를 다중 병원체 검출용 광학 프로브로 사용[6]. 그러나 다른 나노입자처럼 높은 표면 에너지로 GoldMag 입자 간 인력 유발, 완충액에서 클러스터 형성. 이는 생물의학 분야 광학 검출 응용 크게 제한. 따라서 GoldMag 응집 방지 및 안정적 콜로이드 용액 확보는 필수. 고분자 코팅으로 GoldMag 맞춤화하여 표적 분자 검출에 높은 효용. GoldMag 분산성이 11-메르캅토운데칸산(MUA)[7], 폴리스티렌설포네이트(PSS)[8], 폴리에틸렌이민(PEI)[9] 등 거대 유기 화합물 표면 개질로 개선됨 보고됨. MUA는 리간드 교환 전략으로 GoldMag 표면 도입. MUA 표면 개질로 GoldMag 콜로이드 용액 안정성 향상[7]. MUA-GoldMag는 광학 특성 기반 단백질 검출 사용. 그러나 MUA 사슬이 너무 짧아 입자 충분한 분산성 보장 위한 입체 장애 제공 못함. 게다가 MUA 카르복실기 낮은 밀도로 GoldMag 흡착 단백질 양 제한. 이 단점들로 MUA 입자 광학 기기 응용 제한, 바이오마커 검출 필요 감도 제한.

폴리(4-스티렌설폰산-co-말레산)(PSS-MA)(PSS-MA 3:1, Mw~20,000), 블록 공중합체, PSS와 폴리말레산 공유 결합으로 제조, 술폰산기와 카르복실기 모두 포함. 수많은 카르복실기와 술폰산기 제공 정전기 반발, PSS-MA 긴 고분자 사슬에서 오는 입체 장애가 나노입자 안정성 유지에 매우 유용. 실제로 PSS-MA는 철 산화물 나노소재, 팔라듐, Ag-Au 이금속 나노구조 등 나노입자 제조 시 안정제로 사용[10-12]. Johnston 등은 공중합체 코팅 철 산화물 나노클러스터가 단일 거대분자 고분자 코팅 철 산화물 나노클러스터보다 더 높은 전기입체 안정화 제공 보고[13]. 또한 PSS-MA 폴리말레산 부분의 수많은 카르복실기 생체분자 화학적 변형 허용으로 생물의학 응용 가능.

D-다이머는 교차결합 피브린 분해 안정 최종 산물로, 피브린 형성 및 피브린분해 증강 결과[14]. 혈중 D-다이머 수치 측정은 혈전색전증 및 심근경색 진단에 널리 사용[15,16]. 여기서는 D-다이머를 모델로 PSS-MA-GoldMag의 특정 단백질 광학 검출 잠재력 평가. 항-D-다이머 항체 한 쌍을 PSS-MA-GoldMag에 고정하여 이중 항체 샌드위치 면역분석으로 D-다이머 검출 프로브 형성.

따라서 본 연구에서 PSS-MA로 GoldMag 표면 개질. 이는 자기 나노입자 안정성 향상뿐만 아니라 나노입자와 항체 간 결합 매개로 D-다이머 검출 가능.

방법

재료 및 시약

GoldMag(5mg/mL) Xi'an GoldMag Nanobiotech Co.(시안, 중국) 제공. 붕산, 붕사, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB), PSS-MA(PSS-MA 3:1, Mw~20,000) Sigma-Aldrich(미국) 구매. 단클론 항-D-다이머 항체 한 쌍(항체1: M-2.1.16; 항체2: M-1.2.57) Roche 구매. D-다이머 Meridian Chemicals(미국) 구매.

PSS-MA로 GoldMag 표면 개질

GoldMag는 이전 보고[17] 방법으로 합성. 13.3mL CTAB(50mmol/L)을 13.3mL GoldMag(약 3mg/mL)에 첨가. 기계적 교반(200rpm) + 초음파(SB-5200DTD, 중국) 30분 후 추가 교반 30분. 입자 탈수로 세척. CTAB-GoldMag를 10mL 탈수에 재분산, 16mL 25%(w/w) PSS-MA 용액 첨가 후 180rpm 90분 교반. 개질 입자 탈수로 2회 세척, 탈수에 분산.

특성 분석

PSS-MA-GoldMag 투과 전자 현미경(TEM, Hitachi H-600, 일본) 관찰. 크기 분포 DLS(제타-사이저, Malvern Instruments, 영국) 분석. 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR, Thermo Nicolet 5700, 미국) PSS-MA-GoldMag 작용기 특성 분석. 메틀러 톨레도 SDTA 851e 열중량 분석기(TGA) PSS-MA-GoldMag 표면 고분자 껍질 비율 분석. GoldMag 표면 플라즈몬 공명(SPR) 스펙트럼 UV-2550 분광광도계(Shimadzu, 일본) 450-700nm 파장 범위 기록.

항-D-다이머 항체-PSS-MA-GoldMag 프로브 제조

1mg GoldMag를 1mL 붕사/붕산 완충액(0.02M, pH 7.4)에 현탁, 75mg/mL 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC) 함유. 100μg 항-D-다이머 항체 첨가 후 1시간 초음파. 3mL 차단 완충액(0.02M 붕사/붕산 완충액, pH 7.4, 5% BSA) 첨가 1.5시간 인큐베이션. 외부 자기장 분리 후 항-D-다이머 항체-PSS-MA-GoldMag 복합체 4°C 붕사/붕산 완충액 보관. 항체 결합 SPR 분광법과 DLS 측정으로 확인.

D-다이머 용액은 스톡 용액(40mg/mL)을 송아지 혈청으로 희석 제조. D-다이머 3농도(0.6, 2, 6μg/mL)로 항-D-다이머 항체-PSS-MA-GoldMag 복합체와 반응 시간 최적화. 10μL 항체-프로브(0.3mg/mL) + 80μL D-다이머 용액(0.6, 2, 6μg/mL) 혼합, 25°C 10, 20, 30, 40분 인큐베이션. UV-2550 분광광도계로 PSS-MA-GoldMag 복합체 SPR 피크 파장 측정.

D-다이머 6, 3, 1.5, 0.75, 0.3μg/mL 농도 용액 제조하여 D-다이머 농도와 SPR 스펙트럼 변화 관계 분석. 10μL 프로브(0.3mg/mL) + 80μL D-다이머 용액 혼합, 25°C 30분 인큐베이션. SPR 피크 파장 측정.

중성지방, 빌리루빈, 헤모글로빈 간섭 평가 위해 D-다이머 용액(0, 3μg/mL) 제조, 각각 22mg/mL 중성지방, 0.2mg/mL 빌리루빈, 2mg/mL 헤모글로빈 첨가. 10μL 프로브 첨가 후 SPR 피크 파장 측정.

결과 및 논의

Scheme 1은 단백질 비교색 검출용 입자 표면 개질 및 기능화 절차 도식. PSS-MA 흡착 및 PSS-MA-GoldMag 구조 내 포함 연구 위해 FTIR 분광 분석, SPR 분광법, TGA 수행. Figure 1a는 순수 PSS-MA, PSS-MA-GoldMag, GoldMag FTIR 스펙트럼. 3000-3700cm⁻¹ 넓은 강한 밴드 -CO-OH 신축, 고분자 사슬 -SO₂-OH 수산기 대응[18]. 설폰산기 대칭 진동(SO₃⁻) 1037, 1126cm⁻¹, 벤젠 C=C 신축 진동 1403, 1637cm⁻¹[19]. PSS-MA 특성 흡수 밴드 PSS-MA-GoldMag에서 관찰되어 원시 입자 성공적 코팅 확인. GoldMag 표면 화학기 변화는 SPR 밴드 555nm에서 544nm로 11nm 명확한 청색 이동으로 확인(Fig. 1b). SPR 피크 위치와 폭은 나노입자 표면, 환경, 분산성 관련[20-23]. TGA 분석으로 유기물/GoldMag 중량비 약 1:4(Fig. 1c). 저온 중량 감소 탈수 기인, 고온 산화 분해 기인[19,24]. 개질 중 CTAB-GoldMag 양전하(+12.2mV), PSS-MA 코팅 후 음전하(-24.5mV) 전환(Fig. 1d). 위 모든 결과 PSS-MA 나노입자 표면 성공적 부착 확인.

TEM 마이크로그래프(Fig. 2a,b)에서 GoldMag와 PSS-MA-GoldMag 입자 개질 후 단분산. 고해상도 전자 현미경 이미지에서 입자 표면 고분자 층 명확히 보여 코팅 성공 추가 확인(Fig. 2b). Figure 2c PSS-MA-GoldMag 평균 직경 116nm. PSS-MA-GoldMag 현탁액 와인 레드 색으로 나노입자 우수 안정성 지시(물에서 1년).

GoldMag와 PSS-MA-GoldMag 광학 특성 안정성을 다양한 pH 완충액에서 SPR 분광법 분석[7]. Fig. 3a에서 GoldMag를 pH 6.0-9.0 붕사/붕산 완충액에 현탁 시 SPR 특성 피크 555nm에서 장파장 쪽으로 이동. 완충액 조성도 GoldMag 현탁액 안정성 영향. GoldMag를 붕사/붕산 완충액(pH 7.4), PB 완충액(pH 7.4), NaCl 용액(10mM)에 현탁 시 SPR 피크 탈수(550nm) 대비 더 높은 파장(558nm) 이동(Fig. 3c). 그러나 PSS-MA-GoldMag는 전해질 용액이나 다양한 pH 완충액 분산 시 특성 SPR 피크(545±2nm) 유의미 변화 없음(Fig. 3b,d). Xia 등, Storhoff 등도 나노입자 응집 시 SPR 스펙트럼 장파장 이동 보고[25,26]. GoldMag와 PSS-MA-GoldMag 제타 전위 측정(Fig. 3e,f). 제타 전위 낮음(±30mV 미만) 입자 응집 유발 보고[27,28]. GoldMag를 PB 완충액(pH 7.4), 붕사/붕산 완충액(pH 7.4), NaCl 용액(10mM) 현탁 시 제타 전위 각각 -16.7±1.1mV, -14.3±2.1mV, -8.9±1.5mV. pH 6.0-9.0 붕사/붕산 완충액에서 -14.2±1.7mV, -17±1.1mV, 13.9±1.7mV, -18.1±1.6mV. 그러나 PSS-MA 부착으로 다양한 전해질 용액 및 pH에서 제타 전위 극적으로 감소, 모든 경우 -30mV 미만. 이 결과 PSS-MA로 GoldMag 표면 개질이 완충액 조성 및 pH 변화 저항성 크게 개선, 높은 분산성 보장[29].

단백질과 PSS-MA-GoldMag 상호작용 조사 위해 항-D-다이머 항체 EDC 매개로 고분자 카르복실기와 단백질 아미노기 반응 통해 PSS-MA-GoldMag에 결합. Fig. 4a에서 항체 반응 후 SPR 피크 적색 이동 관찰, 나노입자 항체 결합 지시[30,31]. 입자 평균 직경 116nm에서 130nm 증가로 항-D-다이머 항체 PSS-MA-GoldMag 도입 확인(Fig. 4b)[24]. 항체 질량 영향 평가 위해 항-D-다이머 항체 20-200μg 첨가 후 SPR 분광법. Fig. 4c에서 SPR 피크 548±3.0nm 유지, 항체 양 독립적.

항체 활성 평가 위해 프로브 A(항체1+항체2 고정), 프로브 B(항체1만 고정) 제조. 두 프로브와 D-다이머 상호작용 SPR 분광법 분석. 3농도 D-다이머(0.6, 2, 6μg/mL) 프로브 A 첨가 후 40분 SPR 피크 최대값 변화 관찰로 최적 반응 시간 도출. Fig. 5a에서 항원-항체 샌드위치 브리지 교차연결로 PSS-MA-GoldMag 응집 결과 표면 플라즈몬 밴드 유의미 이동. 저농도(0.6μg/mL) 20-40분 SPR 스펙트럼 유의미 변화 없어 20분 충분. 중고농도(2, 6μg/mL) 30분까지 파장 지속 증가, 최적 반응 시간 30분. Fig. 5b에서 D-다이머 농도 0.3-6μg/mL 증가 시 복합 입자 SPR 스펙트럼 λmax=550→570nm 뚜렷한 적색 이동, 특성 피크 강도 감소. 이는 프로브 A 표면 항체1과 항체2 간 D-다이머 교차 연결로 PSS-MA-GoldMag 응집 유발. GoldMag 나노골드 응집 시 SPR 스펙트럼 적색 이동 및 확대 보고[32,33]. 그러나 Fig. 5d 프로브 B(항체1만) D-다이머 첨가 시 적색 이동 없음, 항체1-D-다이머 상호작용만으로는 나노입자 조립 유도 못함. 더욱이 0.3μg/mL 저농도에서도 5nm 구별가능 적색 이동 관찰, 이 바이오마커 진단 컷오프 값(0.5μg/mL) 이하 검출 한계 지시. 0.3-6μg/mL 범위에서 SPR 스펙트럼 피크 위치와 D-다이머 농도 선형 관계(r²=0.9944)(Fig. 5c).

Fig. 6에서 중성지방, 빌리루빈, 헤모글로빈 존재 시 PSS-MA-GoldMag SPR 특성 피크 유의미 이동 없음. 우리 단백질 검출 시스템이 중성지방, 빌리루빈, 헤모글로빈과 간섭 반응 없음 지시.

이 결과 PSS-MA-GoldMag가 단백질 고정화용 유망 자기 나노입자이며, 항체1-표적 단백질-항체2 샌드위치 브리지 입자 표면 형성 가능. PSS-MA-GoldMag를 면역분석 기반 현장 진단 광학 바이오마커 검출 소재로 가치 있음.

본 연구에서 PSS-MA 최초 GoldMag 개질 사용(Scheme 1). PSS-MA 도입으로 GoldMag 완충액 안정성 유의미 개선. PSS-MA 긴 고분자 사슬 입체 장애뿐만 아니라 카르복실기와 술포기 정전기 반발로 나노입자 간 반발력 유발[29], PSS-MA-GoldMag 안정성 크게 향상. 입자 표면 수많은 카르복실기 생체분자 결합 요구 충족.

결론

본 연구에서 GoldMag를 PSS-MA로 코팅하는 쉽고 빠른 방법 보고. 결과 콜로이드 안정성과 분산성 유의미 개선. 입자 넓은 pH 범위 완충액에서 우수 안정성. 또한 카르복실기 존재로 단백질 나노입자 결합 옵션 제공. D-다이머와 항체 모델로 항원-항체 나노입자 복합체 교차결합 통해 광학 특성 조절 가능 확인. 결과 PSS-MA 개질 GoldMag가 면역분석 기반 광학 검출용 매우 유망한 후보임 입증.

약어

DLS:

동적 빛 산란

FTIR:

푸리에 변환 적외선 분광법

GoldMag:

금 자기 나노입자

MUA:

11-메르캅토운데칸산

PEI:

폴리에틸렌이민

PSS:

폴리스티렌설포네이트

PSS-MA:

폴리(4-스티렌설폰산-co-말레산)

SPR:

표면 플라즈몬 공명

TEM:

투과 전자 현미경

TGA:

열중량 분석기