반도체 나노결정으로 인코딩된 고분자 전해질 마이크로캡슐을 기반으로 하는 차세대 치료 물질:개발 및 기능 특성화

결과 및 토론

탄산칼슘 미립자의 합성 및 특성화

구형 무기 결정, 특히 탄산칼슘 미소구체를 기질로 사용하는 것은 생체 적합성과 생물계에 공격적인 용매를 사용하지 않고 고분자 전해질 미소 캡슐을 형성하는 과정에서 제거 가능성에 의해 결정됩니다. 탄산칼슘 미세입자 자체는 또한 변형되거나 장기간 방출되는 약물 전달 시스템으로 사용될 수 있으며, 약물을 로딩하고 미세 환경으로의 방출을 제어하기 위한 매트릭스 역할을 합니다. 즉, 전달 시스템에서 다양한 잠재적 용도가 있습니다. ,38,39,40,41,42,43,44,45,46].

미세 결정의 크기와 모양을 결정하는 핵심 요소는 교반 속도와 지속 시간, 반응 혼합물의 배양 시간입니다[33, 41]. 우리는 최적의 크기 분포를 가진 탄산칼슘 미소구체를 얻기 위한 조건을 실험적으로 결정했습니다. 단일 CaCO₃ 마이크로 입자는 거의 규칙적인 둥근 모양을 갖는 것으로 밝혀졌습니다. 추가 파일 1:그림 S2는 다양한 교반 속도에서 얻은 탄산칼슘 미립자의 크기 분포를 보여줍니다. 이들 데이터로부터 알 수 있는 바와 같이, 입자의 크기 불균일성은 교반 속도가 증가함에 따라 증가하였다. 교반 속도가 250rpm인 경우 얻은 입자의 크기는 4.0~6.0μm 범위였습니다. 이 경우 샘플의 모든 미세 입자는 분리되었으며 크기 분포는 정상에 가까웠습니다(추가 파일 1:그림 S2a). 그러나 혼합물을 500rpm에서 교반하면 더 작은 입자의 응집인 불규칙한 모양의 입자가 관찰되었으며 개별 입자의 평균 크기는 2.7~5.6μm로 다양했습니다(추가 파일 1:그림 S2b). 750rpm의 교반 속도에서 입자 크기의 산란이 증가했습니다. 이 샘플은 또한 불규칙한 모양의 응집체를 포함했으며 개별 미세 입자의 평균 크기는 3.8~5.7μm 범위입니다(추가 파일 1:그림 S2c).

따라서 반응 혼합물을 250rpm의 속도로 교반하면 최적의 크기 분포와 거의 규칙적인 모양을 갖는 입자를 얻을 수 있고 입자 응집을 방지할 수 있습니다. 따라서 우리는 이 교반 속도에서 미세 입자 크기 분포에 대한 교반 지속 시간의 영향을 추정했습니다(추가 파일 1:그림 S3). 15초 동안 반응 혼합물을 교반하면 30초 교반에 비해 더 큰 입자의 수가 증가했습니다. 교반 시간을 60초로 늘리면 비슷한 효과가 나타납니다. 즉, 전자의 경우(추가 파일 1:그림 S3a) 교반 시간이 부족하고 후자의 경우(추가 파일 1:그림 S3c) 교반 시간이 과도합니다. 따라서 최적의 교반 조건은 250rpm의 속도와 30초의 지속 시간을 고려했습니다.

주사전자현미경(SEM) 데이터에 따르면, 탄산칼슘 미립자의 표면은 다공성을 특징으로 하는 불균일한 표면이었다(그림 1a). × 40,000 배율에서 미세 입자가 더 작은 서브마이크로미터 입자로 차례로 형성되었음을 알 수 있습니다(그림 1b). 따라서, 얻어진 미세입자는 다공성 구조를 갖고 기질로 적합할 뿐만 아니라 전달 시스템 자체로도 사용될 수 있는 매트릭스를 나타내었고 이들의 특정 표면 구조로 인해 층별 매트릭스로 용이하게 사용될 수 있다. 폴리머 증착.

탄산칼슘 미립자의 주사 전자 현미경 사진(a ) 및 더 높은 배율의 표면(b )

양자점으로 인코딩된 고분자 전해질 마이크로캡슐의 제조 및 특성화

준비된 수용성 양자점은 최대 방출이 590nm인 넓은 흡수 스펙트럼과 좁은 형광 스펙트럼을 특징으로 합니다(그림 2). 이러한 QD 샘플의 유체역학적 직경은 23.96~28.2nm 범위였습니다. 추가 파일 1:그림 S4는 HS-(PEG)₁₂로 안정화된 QD의 크기 분포를 보여줍니다. -쿠우. HS-(PEG)₁₂를 사용한 QD 표면 수정 -COOH는 수상에서 QD 안정성을 보장할 뿐만 아니라 인코딩 과정에서 양전하 고분자 전해질 층 사이에 QD의 효과적인 흡착에 충분한 표면 음전하를 보장합니다[22, 47].

HS-(PEG)₁₂로 가용화된 CdSe/ZnS 코어/쉘 양자점의 광학적 특성 -COOH 리간드

고분자 전해질 층 및 QD의 각 단계에서 측정된 탄산칼슘 미세입자 샘플의 표면 전하 값(표 1)은 각 폴리머 증착 후 표면 재충전뿐만 아니라 원래 매트릭스의 표면 전하, 가용화된 QD를 확인했습니다. 각 후속 레이어의 효과적인 흡수에 충분합니다.

합성 탄산칼슘 미립자의 고유한 표면 전하와 다공성 표면 구조로 인해 반대 전하를 띤 고분자 전해질 및 QD 증착을 위한 매트릭스로 사용할 수 있습니다(그림 3). QD로 인코딩된 고분자 전해질 고분자 마이크로캡슐에 PAH 및 PSS 고분자를 적용하는 것은 생체 적합성, 무독성 및 비생분해성에 의해 결정되어 쉘 내에서 QD를 유지하는 데 도움이 됩니다. 고분자 전해질 마이크로캡슐 형성에도 널리 사용되는 폴리-l-아르기닌, 폴리-l-라이신, 키토산, 알긴산 나트륨 염 및 덱스트란 설페이트의 생분해성은 폴리머 막에서 QD 확산을 유도하여 감소해야 합니다. 미세 입자의 형광 특성 [3, 11, 39, 48, 49, 50, 51, 52]. 본 연구에서 사용된 PAH 폴리양이온과 PSS 폴리음이온은 각각 아민과 설페이트 그룹을 포함하여 폴리머 층 사이의 정전기적 상호작용을 보장하여 인터폴리머 복합체를 형성합니다[16, 25, 36, 37]. 첫 번째 고분자 층의 선택은 합성된 탄산칼슘 미립자의 표면 전하 값에 의해 결정되었습니다.

양자점으로 인코딩된 마이크로캡슐의 제조 절차:매트릭스 표면에 폴리양이온(1) 및 다중음이온(2), PAH 및 PSS 고분자 전해질 각각의 층 형성; 생성된 마이크로입자를 양자점 및 추가 층별 중합체 증착으로 인코딩(3); 탄산칼슘 코어 제거(4)

그림 4는 기판 표면에 고분자 쉘이 형성되는 단계의 SEM 이미지를 보여줍니다. 현미경 사진에서 볼 수 있는 바와 같이, 미립자는 탄산칼슘 입자의 코어와 쉘을 포함하고 있으며, 이는 흡착된 폴리머 층의 수가 증가함에 따라 더욱 뚜렷해진다. 고분자 전해질 층으로 코팅된 미세입자의 표면은 기질의 형상을 따라 특성이 균일하여 다공성임을 시사한다(그림 4a, b)[44]. 고분자 외피가 두꺼워질수록 미세입자 표면은 더욱 균일하고 매끄러워졌다(그림 4c, d).

4개(a)를 적용한 후 탄산칼슘 미립자의 주사 전자 현미경 이미지 , b ) 및 10(c , d ) 고분자 전해질 층

QD로 인코딩된 고분자 전해질 마이크로캡슐 제조의 마지막 단계에는 탄산칼슘 코어의 제거와 마이크로캡슐의 최종 구조 형성이 포함됩니다. 탄산칼슘 입자로 구성된 매트릭스를 용해시키기 위해 마이크로입자를 EDTA로 세척하였다. EDTA는 칼슘을 포함한 2가 금속의 염과 상호작용하여 수용성 착물을 형성하기 때문에 주로 사용되었으며, 저분자량은 EDTA용 고분자 전해질 껍질의 투과성을 보장하고 Ca ²⁺ 와의 착물화를 보장합니다. . 이것은 고분자 전해질 입자의 코어가 용해되고 속이 빈 구조를 형성합니다[45, 46].

우리 연구에서 얻은 QD로 인코딩된 미세입자 및 고분자 전해질 미세캡슐은 구형 또는 거의 구형이며 크기는 3.8~6.5μm입니다(그림 5). 형광 모드에서 미세 입자 및 미세 캡슐의 형태 및 구조 분석은 고분자 전해질 미세 캡슐 내에 공동을 보여 주었고, 이는 미세 입자에 비해 높은 투명도에서 분명합니다(그림 5b). 이것은 EDTA를 사용한 코어 용해 절차가 효과적임을 입증했습니다. 공초점 현미경 데이터는 또한 얻어진 형광 고분자 전해질 마이크로캡슐의 중공 구조를 보여주었다(그림 6). 이러한 마이크로캡슐은 BSA 코팅에 의한 표면 개질로 인해 거친 표면을 가진 구형 입자로 특징지을 수 있는 단일 입자(그림 6a, b)로 구별될 수 있습니다.

고분자 전해질로 코팅되고 양자점으로 인코딩된 탄산칼슘 미립자의 형광 현미경 이미지(a ) 및 이들로부터 얻은 고분자 전해질 마이크로캡슐(b )

양자점으로 인코딩되고 BSA로 코팅된 고분자 전해질 마이크로캡슐의 공초점 현미경 이미지:마이크로캡슐의 단면(a ); 단일 고분자 전해질 마이크로캡슐의 3D 투영(b )

인코딩 효율 추정

인코딩 효율은 미립자의 양전하를 띤 폴리머 표면에 흡착된 QD의 양에 의해 추정되었다. QD 용액과 함께 마이크로입자를 인큐베이션하기 전과 후에 마이크로입자 인코딩에 사용된 원래 용액과 상청액에서 QD의 양을 추정한 결과, 마이크로입자 표면에 결합된 QD의 수는 0.36~2.241mg(그림 7a). 용액에서 양자점의 양이 더 증가하면 흡착된 양자점의 수가 감소한다. This may have resulted from an insufficient density of the positive charge determined by amine groups of PAH on the microparticle surface because of an excessive amount of QDs and the resultant saturation of the surface with them. Apparently, the QDs were adsorbed more efficiently if their amount was smaller than 2.241 mg owing to sterically favorable conditions and less interference with one another’s attachment. The pattern of the dependence of the encoding efficiency on the QD content of the solution used for the encoding agrees with our earlier data [22].

Estimation of the efficiency of encoding of microparticles with different amounts of quantum dots (a ) and their fluorescence characteristics (b ). Asterisk indicates significant difference of QD-encoded microbeads from the QD-encoded microcapsules (p  < 0.05)

Estimation of the optical characteristics of the obtained polyelectrolyte microcapsules is an essential stage of the assessment of encoding efficiency. Its results show how suitable the given technique is for fabrication of imaging agents based on QD-encoded polyelectrolyte microcapsules.

Figure 7b shows the fluorescence intensities of the microparticles and microcapsules measured as the mean normalized intensity of gray color as dependent on the amount of QDs used for encoding them. As seen from the figure, the fluorescence intensity of the encoded microparticles was higher than that of the microcapsules obtained from them. At the same time, the microcapsules encoded with different amounts of QDs did not differ significantly from one another in fluorescence intensity (p  > 0.05). Despite some decrease in the fluorescence intensity of the microcapsules, their encoding with the amount of QDs indicated above ensures a contrast sufficient for effective imaging.

Quantum Dot Fluorescence Lifetime within Encoded Polyelectrolyte Microcapsules

As noted above, the fluorescence intensity of the polyelectrolyte microcapsules was decreased compared to the microparticles used for their fabrication and encoded with the same QDs. Therefore, we have estimated the fluorescence lifetimes of both the original QDs and the same QDs embedded in the microparticles or the polymeric walls of the microcapsules.

The QD fluorescence kinetic curves (Fig. 8) are characterized by monoexponential dependence of fluorescent intensity on time according to the following equation:

Fluorescence lifetimes of the solubilized CdSe/ZnS quantum dots with a fluorescence peak at 590 nm incorporated in the fabricated microparticles and microcapsules

나 (그 ) is the intensity of QD fluorescence in response to excitation pulses and A ₁ , х , 그리고 t ₁ are parameters describing the change in the intensity with time.

We determined the fluorescence lifetime for each sample (Table 2). The original solubilized QDs had the longest fluorescence lifetime; it was decreased after the QDs were adsorbed onto the microparticles and incorporated into the structure of the polymer shell. This may have resulted from interaction between the QDs and PAH, as we found earlier [22]. In the case of microcapsules, the QD fluorescence lifetime tended to further decrease compared to the QDs within the microparticles from which the microcapsules were fabricated. A possible cause of this decrease was a technological factor entailed in the fabrication of microcapsules, namely, the dissolution of the core and the related increase in the necessary number of washings.

It should be noted, that the fluorescence lifetime also tended to decrease with time after the microcapsule fabrication. However, since 48 h after the microcapsule fabrication, further changes in the mean fluorescence lifetime were insignificant. The fluorescence decay was apparently caused by a decrease in the fluorescence quantum yield of QD embedded in the shells of the capsules. This effect is likely to have resulted from the change in the distribution of the electron potential and the geometric rearrangement of QDs in the inner layers of the polymer shell after the core removal that increased the probability of nonradiative recombination due to the charge transfer to between neighboring QDs or between QDs and polymer molecules [22].

Interaction of Quantum Dot- Encoded Polyelectrolyte Microcapsules with Phagocytic Cells In Vitro

We used confocal microscopy to analyze the interaction of QD-encoded polyelectrolyte microcapsules with live phagocytic cells, their uptake by cells, and the possibility of cell labeling. The murine alveolar macrophage (MH-S) cells were used as a model, because of the capability of these cells to phagocytize xenogenic objects.

The MH-S cells were treated with approximately 1.2×10 ⁶ of QD-encoded microcapsules by short-term (4 h) or long-term (24 h) incubations. We observed signs of primary uptake of the microcapsules in both cases:after the short- and (Fig. 9a–d) long-term incubation (Fig. 9e–h). Polyelectrolyte microcapsules or their conglomerates could be seen in green color. The microcapsules could be clearly distinguished both in the external environment of cells and inside the MH-S cells that could be evidenced by the distance between the microcapsules and nuclei of the MH-S cells which were stained by far-red DNA stain DRAQ5 and can be seen as red spherical shaped objects at all the microphotographs. As individual microcapsules and as their conglomerates were detected to undergo the uptake process. The fact that microcapsules were located in internal cell environment or at least attached to the surface of the macrophages is confirmed by clearly distinguished short distances between the nuclei and the polyelectrolyte microcapsules (Fig. 9b, d, g, h). In Fig. 9g, residually stained boundaries of the macrophage cytoplasmic membranes are distinctly seen, which indicates effective uptake, and well-discernible microcapsules are easy to detect to be attached on their surface either within the cells.

Confocal images of the MH-S cells treated with the QD-encoded polyelectrolyte microcapsules coated with BSA. The upper row shows the images of the samples after 4 h of short-term incubation; the microcapsules are shown by white arrows (a –d ). The lower row demonstrates the images of the samples after 24 h of long-term incubation; the microcapsules are shown by white arrows (e –h ). The nuclei of the macrophages were counterstained with far-red DNA stain DRAQ5

During the short-term incubation, single microcapsules were found to be phagocytized by MH-S cells prior to conglomerates of the microparticles. While after long-term incubation (24 h), the amount of the conglomerates of the polyelectrolyte microcapsules undergoing the uptake process and located inside cells or at least attached to the cell surface was more significant than after short-term incubation. Thus, the polyelectrolyte microcapsules obtained in this study used as promising tools for imaging and tracking of live cells.