잠재적 상처 치유 응용을 위한 전기방사 키토산-폴리에틸렌 옥사이드/피브리노겐 생체 복합 재료의 개발

결과 및 토론

다양한 폴리머의 조합은 생성된 복합재의 특성을 크게 향상시키는 것으로 나타났습니다[29, 30]. 결합 폴리머 시스템은 상처 드레싱 적용에 중요한 매개변수인 스캐폴드 강도, 유연성, 생분해 및 약물 방출 동역학의 조절을 효과적으로 허용합니다. 그러나 고유한 복합 재료의 생성은 구성 중합체 간의 고유한 화학적 상호작용에 의해 제한될 수 있습니다. 예를 들어, 음으로 하전된 Fb와 양으로 하전된 CS를 혼합할 때 폴리머 침전물이 형성되는 것으로 관찰되었습니다. 이 관찰은 다양한 용매 조건에서 강한 정전기적 상호작용을 갖는 분자에 대해 잘 문서화되어 있습니다[31,32,33]. 결과적으로 CS-Fb 고분자 복합 지지체의 제조는 이전에 설명된 바와 같이 이중 압출 전기방사 기술의 사용을 필요로 했습니다[34].

CS-PEO/Fb 나노섬유의 형태

CS-PEO, CS-PEO/Fb 및 Fb 스캐폴드의 평균 섬유 직경은 각각 269.9 ± 68.4, 202.3 ± 113.2, 351.1 ± 101.7 nm였습니다(그림 2). 흥미롭게도 CS-PEO/Fb 복합 지지체는 CS-PEO 또는 Fb 지지체보다 더 얇은 나노섬유를 나타냈다. 섬유 직경 크기의 감소는 동시에 대전된 폴리머 제트에 의해 생성된 추가 정전기력으로 인한 것일 수 있습니다[35,36,37]. 따라서 이러한 힘에 의해 야기된 서로로부터 멀어지는 폴리머 제트의 반발은 방사구간 거리와 증착 시간을 모두 증가시킬 수 있습니다. 결과적으로 연장된 증착 시간은 섬유 신장 및 더 얇은 섬유 형성을 유발하는 것으로 알려진 증가된 굽힘 불안정성과 관련이 있습니다.

전기방사 지지체의 대표적인 FESEM 현미경 사진. 아 CS-PEO, 평균 직경 269.9 ± 68.4nm. ㄴ CS-PEO/Fb, 평균 직경 202.3 ± 113.2nm. ㄷ Fb, 평균 직경 351.1 ± 101.7nm(n =100)

ToF-SIMS 및 물 접촉각을 통한 표면 화학 특성화

CS, Fb 및 PEO 스캐폴드의 ToF-SIMS 스펙트럼은 그림 3에 나와 있습니다. 일반적으로 고유한 화학적 지문 종을 사용하여 개별 폴리머 구성 요소를 구별할 수 있습니다. 그러나 CS와 Fb 사이의 화학적 유사성으로 인해 질소 함유 종(C₃ H₆ 아니요 ⁺ , 채널₄ N ⁺ , CN ⁻ 및 CNO ⁻ ) 두 스펙트럼에 모두 존재하여 폴리머를 서로 구별하기 어렵습니다. 그러나 Fb가 스캐폴드에 통합되었을 때 CN ^- 의 총 수는 그리고 CNO ⁻ 종은 증가했지만 다른 단편은 변하지 않거나 감소했습니다. 따라서 CN ⁻ 의 변경 사항을 검토합니다. 그리고 CNO ⁻ Fb의 간접 검출을 위해 허용되는 단편 강도. 마찬가지로 C₂의 증가 H₅ O ⁺ (45m/z) 이온을 사용하여 복합 지지체에서 PEO의 에틸렌 옥사이드 조각을 식별했습니다.

대표 a 긍정적이고 b 깨끗한 CS(위), Fb(중간) 및 PEO(아래)에 대한 음이온 ToF-SIMS 스펙트럼. 화합물 식별을 위한 고유한 지문으로 원형 이온 조각을 사용했습니다.

복합 지지체 내 Fb 구성 요소의 존재 및 분포를 설명하기 위해 CNO ^- 및 CN ⁻ 이온은 열 지도를 얻기 위해 원시 및 복합 지지체의 50 × 50-μm 래스터에 매핑되었습니다(그림 4a, b). 동일한 매핑 기술이 C₂에서 수행되었습니다. H₅ O ⁺ PEO 분포를 결정합니다(그림 4c). 증가된 히트맵 강도는 Fb 또는 PEO의 더 높은 폴리머 함량과 상관관계가 있었습니다. 우리는 CNO ⁻ 의 강도를 관찰했습니다. , CN ⁻ , 및 C₂ H₅ O ⁺ 합성 스캐폴드의 50 × 50-μm 래스터 영역 전체에 균일하게 분포되었습니다. 스캐폴드의 두께(93.8 ± .4μm)와 층별 섬유 증착으로 인해 표면 구성이 전체 스캐폴드를 대표할 것으로 예상됩니다. 따라서 ToF-SIM 데이터는 CS-PEO/Fb 나노섬유 스캐폴드가 이중 방사구 전기방사를 사용하여 제작될 때 복합 스캐폴드 전체에 개별 구성요소가 균일하게 증착됨을 시사합니다.

a의 ToF-SIMS 매핑 CNO ⁻ , b CN ⁻ , 및 c C₂ H₅ O ⁺ 50 × 50-μm 래스터 영역의 다양한 스캐폴드에 있는 이온 조각

전기방사된 CS-PEO, CS-PEO/Fb 및 Fb 섬유질 지지체의 물 접촉각은 각각 44.2° ± 5.1°, 61.4° ± 7.6° 및 115.7° ± 16.2°로 측정되었습니다(그림 5). 물 접촉각에 따라 CS-PEO 및 CS-PEO/Fb 지지체는 친수성(> 90°)인 반면 Fb 지지체는 소수성(<90°)이었습니다. CS-PEO/Fb 복합 지지체의 물 접촉각은 구성 요소 사이에 있는 표면 특성을 보여주었으며, 이는 CS-PEO와 Fb가 제조 중에 균일하게 증착되었음을 시사합니다. 고분자 표면의 표면 특성은 단백질의 침착과 접착 인자에 중요한 역할을 합니다. 특히, 중요한 박테리아 접착 인자는 소수성 표면에서 더 쉽게 발생하여 박테리아 집락화를 촉진하는 것으로 알려져 있습니다[38]. 따라서 CS-PEO/Fb의 친수성 특성은 박테리아 부착을 억제하는 데 도움이 될 수 있습니다.

유리 기판, CS-PEO, CS-PEO/Fb 및 Fb 지지체 표면의 탈이온수의 거동

CS-PEO/Fb 지지체의 기계적 단축 인장 강도

일축 인장 시험은 평균 두께가 93.8 ± 7.4 μm인 나노섬유 스캐폴드에서 수행되었습니다. 결과의 요약은 표 1에 표시되고 해당 응력-변형률 곡선은 그림 6에 표시됩니다. 일반적으로 복합 재료의 기계적 특성은 가장 약한 구성 요소와 상관 관계가 있습니다. 결과는 Fb 단독 스캐폴드가 상처 드레싱 적용에 이상적인 기계적 특성을 갖지 않을 것임을 시사합니다. 이는 보다 기계적으로 안정적인 제품을 얻기 위해 CS-PEO를 통합하는 것의 중요성을 강조합니다.

CS-PEO, CS-PEO/Fb 및 Fb 지지체의 응력-변형률 곡선. 데이터는 독립적으로 생산된 10개의 스캐폴드를 나타냅니다.

CS-PEO/Fb 지지체의 수증기 전달율

WVTR은 상처 환경의 이상적인 습도를 유지하는 데 중요한 역할을 하며, 이는 세포 과립화 및 상피화에 긍정적인 영향을 미칩니다[39, 40]. WVTR 값이 높을수록 증발 및 삼출로 인한 빠른 상처 탈수와 관련이 있으며, 이는 체온을 역으로 낮추고 신진대사를 증가시킬 수 있습니다. 반대로 매우 낮은 WVTR 값은 삼출물 축적, 치유 억제 및 감염 위험 증가와 관련이 있습니다. Lamkeet al. 정상 피부의 WVTR을 204 ± 12 g m ⁻² 로 보고했습니다. 일 ⁻¹ 279~5138 g m ⁻² 일 ⁻¹ 상처의 상태에 따라 손상된 피부의 경우 [41, 42]. 상처 상피화 및 치유 강화를 위한 이상적인 WVTR은 2028.3 ± 237.8 g m ⁻² 입니다. 일 ⁻¹ 보고된 바 있다[43]. CS-PEO 및 Fb 지지체의 WVTR은 693.2 ± 95.7 및 686.1 ± 44.17 g m ⁻² 일 ⁻¹ , 각각. 원래의 스캐폴드보다 이상적인 WVTR에 더 가깝지만 CS-PEO/Fb 스캐폴드(806.5 ± 56.1 g m ⁻² 일 ⁻¹ ) 여전히 이상적인 WVTR 아래로 떨어졌습니다(그림 7). 비계의 물리적 매개변수를 조작하면 보고된 이상적인 비율을 더 잘 모방하도록 WVTR을 개선할 수 있습니다.

전기방사된 CS-PEO, CS-PEO/Fb 및 Fb 지지체의 수증기 전달 속도. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다(n =6, *p <0.05 CS-PEO/Fb 스캐폴드와 비교할 때)

인간 진피 섬유아세포의 시험관 세포 생존율

키토산-PEO/Fb 스캐폴드는 초기 48시간 동안 인간 섬유아세포에서 유의한 증식 효과를 나타내지 않았습니다(그림 8). 그러나 72시간에 장기간 노출되면 스캐폴드가 없는 대조군에 비해 증식이 통계적으로 유의하게 감소했습니다. 결과는 시간이 지남에 따라 누적될 수 있는 스캐폴드에 의해 나타나는 세포 증식의 억제가 있음을 시사합니다.

Fb 및 CS-PEO/Fb 전기방사 지지체에 노출되었을 때 인간 진피 섬유아세포 증식의 비교(n =9, *p <0.05 각 시점에서 "비계 제어 없음"과 비교)

감소된 증식 능력은 CS와 관련된 아세틸화 정도(DA) 때문일 수 있으며, 이는 양전하를 통해 강한 세포 상호 작용을 갖는 것으로 나타났습니다[44]. Younes et al. CS(> 50% DA)로 처리된 방광암 세포는 24시간 후 생존력이 현저히 감소했으며, 이는 CS 세포독성이 증식에 영향을 미칠 수 있는 DA와 직접적으로 관련되어 있음을 시사합니다[45]. 이 효과는 시험관 내 실험 조건에서도 분리될 수 있습니다. 이전 연구에서는 CS의 생분해 산물이 대사 경로를 통해 제거될 수 있기 때문에 생체 내에서 무독성인 것으로 나타났습니다[46]. 전기방사 과정에서 남은 HFIP도 관찰된 세포독성에 기여할 수 있습니다. 그러나 HFIP에서도 제조된 전기방사된 순수 Fb 지지체에서는 동일한 세포독성이 관찰되지 않았다. HFIP는 높은 휘발성으로 인해 제조 과정에서 전기방사 지지체에서 제거되었을 가능성이 있습니다. 섬유 시스템에 포함된 잔류 HFIP가 인간 진피 섬유아세포에 일정 시간 노출되는 동안 방출된다면 세포 생존력의 관찰 가능한 감소가 명백할 것입니다.

LIVE/DEAD 분석 및 세포 부착

그림 9a–c는 피브로넥틴 코팅 유리, 비부하 CS-PEO/Fb 지지체, PDGF 적재(4 μg/mL) CS-PEO/Fb 지지체 표면에 뿌린 진피 섬유아세포의 분포와 생존력을 보여줍니다. 배양 24시간 후 살아있는 세포와 비교하여 최소한의 죽은 세포가 관찰되었습니다. PDGF가 로드된 스캐폴드와 로드되지 않은 스캐폴드 간에 식별할 수 있는 차이는 없었습니다.

Confocal micrographs of fibroblasts seeded on a , d fibronectin-coated glass; ㄴ , e unloaded CS-PEO/Fb scaffold; and c , f PDGF-loaded (4 μg/mL) CS-PEO/Fb scaffolds. a–c Cells were stained with LIVE/DEAD™:live cells (green), dead cells (red). d–f Cells were stained with DAPI (blue) and phalloidin (red)

Fibrinogen serves as an important mediator of cellular attachment and growth during wound healing. Phalloidin stains cellular actin filaments allowing for visualization of fibroblast attachment. Figure 9c, d shows the actin filament morphology of the fibroblasts on the surface of fibronectin-coated glass, unloaded CS-PEO/Fb scaffolds, and PDGF-loaded CS-PEO/Fb scaffolds. Overall, normal fibroblast morphology was observed, with the exception of some rounder cells being present on the scaffold samples. The changes in morphology may be attributed to the presence of CS, as shown in previous studies [47]. Alternatively, the differences could be due to the small porosity of the scaffold and dimensionality of the fiber surface in comparison to the flat surface of the control.

In Vitro Degradation of Electrospun CS-PEO/Fb Scaffolds

Scaffold degradation was evaluated by obtaining the dry weight of the scaffold after incubation in FBM for up to 48 h (Fig. 10). The scaffolds degraded at a linear rate after an initial burst release of material within the first hour. Weight loss in the initial hour was likely due to the solubility of PEO in aqueous solutions [16], and the subsequent weight loss was likely due to Fb and CS release. This highlights a unique biphasic degradation profile that could be beneficial for the delivery of bioactive molecules. Concurrently, CS-PEO/Fb scaffolds were shown to maintain their substructure for a minimum of 48 h (Fig. 10:insert), and the addition of 8 μg/mL of PDGF did not alter the scaffold degradation properties.

Degradation of electrospun unloaded CS-PEO/Fb scaffolds and PDGF-loaded (8 μg/mL) CS-PEO/Fb scaffolds. Insert:FESEM micrograph of CS-PEO/Fb scaffold after 48 h of incubation (n  = 6)

In Vitro Release of PDGF

Cumulative releases of PDGF after 48 h of incubation were 1.8 ± 0.7, 4.4 ± 1.8, and 11.4 ± 4.8 ng of PDGF/mg of scaffold for initially incorporated concentrations of 2, 4, and 8 μg/mL of PDGF, respectively. The results demonstrated that PDGF was released from the scaffolds in a dose-dependent manner (Fig. 11).

PDGF is released from CS-PEO/Fb scaffolds for up to 48 h in a dose-dependent manner (n  = 10, *p  < 0.05 when compared to 2 μg/mL of PDGF dosage at each specific time point, ^# p  < 0.05 when compared to 4 μg/mL of PDGF dosage at each specific time point)

During the in vitro degradation, CS-PEO/Fb scaffolds exhibited a unique biphasic release profile, with 21.6 ± 0.1% of the total eluted PDGF being detected in the first hour followed by linear release kinetics. This observation was thought to be a result of the combined polymers and highlighted the functional importance of Fb as a reservoir for the sustained release of biologically critical molecules. Growth factors (e.g., PDGF/VEGF, FGF, and TGF-β families) have been shown to bind the Fb heparin domain with high affinity and have been reported to retain their bioactivity for over 7 days [48,49,50].

Effects of Released PDGF on Fibroblast Migration

Fold differences in fibroblast migration in response to the released PDGF eluates collected from the scaffolds at various time points are shown in Fig. 12. Previously published reports have demonstrated that fibroblast attachment and migration rates are affected by PDGF in a dose-dependent manner [51, 52]. For example, Gamal et al. showed when at least 50 ng/mL PDGF was delivered locally, adherent fibroblast migration was increased [52]. In addition, Thommen et al. reported that the distance of migration was significantly increased when exposed to PDGF concentrations greater than 10 ng/mL [53]. Therefore, the biological activity of the scaffold-eluted PDGF was measured by its ability to induce migration and was normalized to a single 50 ng/mL PDGF dose.

Human dermal fibroblast migration after 24 h exposure to scaffold eluates acquired at 1, 6, 24, and 48 h in FBM (n  = 8, *p  < 0.05 when compared to unloaded CS-PEO/Fb scaffold at each specific time point)

Eluates collected from electrospun scaffolds, which were loaded with 4 or 8 μg PDGF/mL polymer solutions, demonstrated similar levels of fibroblast migration when compared to a single 50 ng/mL treatment. The data suggest that PDGF delivered by electrospun nanofibers can be equally effective in promoting fibroblast migration as a single application of PDGF. Additionally, the migration elicited by the scaffold-released PDGF was sustained for 48 h. Sustained delivery of PDGF eliminates the need for daily applications, which is an advantage over commercially available treatments such as Regranex®.

Fibroblast migration reached a maximum when cells were treated with the 24-h eluates from each of the PGDF-loaded scaffolds. Notably, when fibroblasts were treated with the 6-h eluates from the 4 and 8 μg PDGF/mL electrospun scaffolds, the same level of maximum migration was achieved. This suggests that the rate of migration increased in response to increased PDGF loading. Additionally, 4 and 8 μg/mL PDGF-loaded scaffolds might be able to elicit fibroblast migration potentials beyond the detection limits of the current assay, which can only assess the endpoint of migration, but not the migration rate. Finally, results demonstrated that eluates from unloaded CS-PEO/Fb scaffolds were also capable of eliciting a linear increase in migration over the same elution time points, albeit less effectively than the PDGF-loaded scaffolds. This result is most likely mediated by the ability of fibrinogen to enhance fibroblast migration [54, 55]. In general, PDGF-loaded composite scaffolds significantly improved in vitro migration, compared to the individual components of the scaffold.