고감도 그래핀 옥사이드 형광 압타센서로 CCRF-CEM 백혈병 세포 신속 검출

초록

그래핀 옥사이드-압타머 복합체(GO-apt) 기반의 편리하고 저렴하며 고감도인 형광 압타센서를 개발해 백혈병 검출에 적용했습니다. 그래핀 옥사이드(GO)는 카복시플루오레세인 표지 Sgc8 압타머(FAM-apt)를 π-π 스태킹으로 흡착하고 형광 공명 에너지 전달(FRET)로 형광을 소멸시킵니다. Sgc8 표적 세포인 CCRF-CEM이 없을 때 형광은 거의 완전히 소멸됩니다. 반대로 CCRF-CEM 세포를 첨가하면 소멸된 형광이 빠르고 유의미하게 회복됩니다. 따라서 형광 신호 변화에 기반해 1 × 10² ~ 1 × 10⁷ cells/mL 범위에서 CCRF-CEM 세포 수를 검출할 수 있으며, 검출 한계(LOD)는 10 cells/mL입니다. 이 GO 기반 형광 압타센서 전략은 암 검출에 유망할 것으로 기대됩니다.

배경

백혈병은 공격적이고 흔한 악성 혈액 질환으로, 특히 소아·청소년에서 인간의 생존과 건강을 위협합니다[1, 2]. 정상 조혈 세포뿐만 아니라 골수와 면역계에도 영향을 미칩니다[3-5]. 따라서 백혈병의 조기 진단은 환자 치료와 삶의 질 향상에 필수적입니다. 현재 백혈병 세포 검출에 흔히 사용되는 방법은 말초 혈액 세포와 골수를 채취한 후 세포 형태학, 세포화학[7-9], 면역표현형[10, 11], 면역조직화학[12, 13], 압타머 기반 유세포분석[14, 15] 등 다양한 분석을 수행하는 것입니다[6]. 이들 방법은 백혈병 세포를 검출할 수 있으나 높은 비용, 낮은 감도, 복잡함 등 단점이 남아 있습니다. 따라서 저비용, 고감도, 간단한 백혈병 검출법을 찾는 것이 시급합니다.

압타머는 체계적 진화에 의한 리간드 지수적 풍부화(SELEX)라는 체외 스크리닝으로 선별된 짧은 단일가닥 DNA(ssDNA) 또는 RNA입니다[16, 17]. 특수한 3차 구조 덕분에 작은 유기 분자, 단백질, 심지어 세포를 포함한 표적과 견고한 결합 친화력과 높은 특이성을 가집니다[18-20]. 또한 압타머는 쉽게 합성 및 변형 가능해 암 검출 프로브로 널리 사용됩니다[21]. 압타머 기반 기능성 나노소재를 이용한 암 검출도 최근 핫토픽입니다[22, 23], 양자점과 실리카 나노입자 등이 예입니다[24].

그래핀 옥사이드(GO)는 우수한 수용성[25], 큰 비표면적, 뛰어난 형광 소멸 능력[26, 27] 등 독특한 특성으로 주목받는 새로운 2차원 평면 탄소 나노소재입니다. 이러한 특성으로 GO는 형광 공명 에너지 전달(FRET)에서 훌륭한 에너지 수용체로 여겨져 형광 압타센서에 광범위한 응용 전망이 있습니다[28]. 또한 GO는 π-π 스태킹 상호작용으로 압타머와 결합하지만 이중가닥 DNA나 압타머-표적 복합체와는 결합하지 않습니다[19, 29, 30]. 따라서 그래핀 기반 압타머 센서는 자유 압타머 프로브보다 압타머 안정성을 개선할 수 있습니다[31].

현재 GO 기반 형광 압타센서로 표적을 검출하는 전략의 실현 가능성을 보고한 연구가 다수 있습니다[21, 32]. 그러나 지금까지 GO 기반 압타센서로 백혈병 세포를 검출한 연구는 거의 없습니다. 여기서 우리는 GO와 카복시플루오레세인 표지 Sgc8 압타머(FAM-apt) 기반으로 백혈병 세포의 신호 '턴온' 검출을 위한 새로운 전략을 설계했습니다. GO와 압타머를 각각 형광 소멸제와 표적제로 사용했습니다. 백혈병 세포가 없을 때 GO는 FAM-apt와 상호작용해 거의 모든 형광을 소멸시키고 검출 신호는 오프 상태가 됩니다. 그러나 표적 세포가 존재하면 압타머가 적극적으로 세포를 표적화해 GO에서 떨어져 나가 검출 시스템에서 형광이 회복되고 검출 신호가 온 상태가 됩니다. 따라서 형광 강도 변화에 따라 표적 세포 농도를 해당하게 측정할 수 있습니다.

실험 방법

시약

서열 5′-FAM-AT CTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-3′의 FAM-apt를 Sangon Biotech Co., Ltd.(상하이, 중국)에서 합성했습니다. 본 연구에서는 20 mM Tris-HCl(pH 7.4), 5 mM MgCl₂, 100 mM NaCl을 포함한 자가 조절 Tris-HCl 완충액을 사용했습니다. 압타머는 Tris-HCl 완충액에 용해했습니다. 그래핀 옥사이드 분말은 Xianfeng Nano Materials Tech Co., Ltd.(난징, 중국)에서 구입했습니다. 모든 용액은 Milli-Q 정제 시스템(Millipore, Bedford, MA, USA)으로 18 MΩ 초순수로 제조했습니다.

세포

CCRF-CEM(인간 급성 림프모구 백혈병 세포주), Ramos(인간 버킷 림프종 세포주), 293T(인간 배아 신장 세포주), H22(쥐 간세포암 세포주) 세포주를 중국과학원 세포은행(상하이, 중국)에서 구입했습니다. 모든 세포주는 5% 이산화탄소, 37°C에서 배양했으며, 1640 배지에 10% 태아소혈청(FBS; HyClone)과 100 U/mL 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, Grand Island, NY, USA)을 첨가했습니다.

장비

모든 형광 스펙트럼과 형광 강도는 F-7000 형광 분광광도계(Hitachi, 도쿄, 일본)로 측정 기록했습니다. 700-µL 석영 큐벳으로 시료 용액을 담았습니다. 카복시플루오레세인(FAM)의 특성 피크 파장에 따라 490 nm 여기, 518 nm 방출로 발광 강도를 모니터링했습니다.

모든 원자힘현미경(AFM) 이미지는 SPI3800N 현미경(Seiko Instruments Industry Co., 도쿄, 일본)으로 획득했습니다.

GO, FAM-apt, 그래핀 옥사이드-압타머 복합체(GO-apt)의 제타 전위는 나노입자 크기, 제타 전위, 절대 분자량 분석기(Zetasizer Nano ZS, Malvern, UK)로 측정했습니다.

GO, FAM-apt, GO-apt의 UV-가시광 흡수 스펙트럼은 NanoDrop 2000(Thermo, USA)으로 기록했습니다.

GO-apt 형광 압타센서 제조

그래핀 옥사이드 분말을 Milli-Q 초순수에 녹여 분산시킨 후 초음파 처리해 1 mg/mL 균질한 흑색 용액을 얻었습니다. 20 mM Tris-HCl 완충액으로 희석해 20 nM FAM-apt 농도를 만들었습니다. 이후 1 µL FAM-apt(10 µM)와 10 µL GO 용액(1 mg/mL)을 혼합하고 Tris-HCl 완충액으로 500 µL까지 희석했습니다.

세포 이미징

CCRF-CEM과 Ramos 세포를 6웰 플레이트(웰당 5 × 10⁵ 세포)에서 12시간 배양했습니다. 세포를 차가운 인산완충생리식염수(PBS)로 2회 세척하고 GO-apt 용액과 4°C 암소에서 30분 배양했습니다. 이후 3회 세척하고 4% 폴리옥시메틸렌으로 20분 고정했습니다. 다시 PBS로 세척하고 4′,6-디아미디노-2-페닐인돌 이염산염(DAPI; Life Co., USA)으로 5분 암소 염색했습니다. 마지막으로 PBS로 3회 세척하고 형광 현미경(Nikon DS-Ri1, 일본)으로 관찰했습니다.

CCRF-CEM 세포 검출

CCRF-CEM 세포를 원심 분리해 수집하고 1 mL PBS에 현탁했습니다. 다양한 농도(0 ~ 1.0 × 10⁷/mL)의 CCRF-CEM 세포를 GO-apt 형광 압타센서와 4°C 암소에서 30분 배양했습니다. 배양 후 560-500 nm 파장 범위에서 형광 분광법으로 CCRF-CEM 세포를 검출했습니다. 검출 한계(LOD)는 3σ/S 계산으로 추정했습니다. 여기서 σ는 GO-apt 용액의 표준편차(n=10), S는 선형 방정식의 기울기입니다[33].

특이성 분석

GO 기반 형광 압타센서의 특이성을 조사하기 위해 Ramos 세포, H22 세포, 293T 세포 등 여러 다른 세포로 시스템을 테스트했습니다. 각 100-µL 반응 시스템에 1 × 10⁶ 세포를 포함했습니다.

통계 분석

각 실험을 3회 반복했습니다. 데이터는 SigmaPlot 12.5 소프트웨어로 처리했고, 통계 분석은 GraphPad Prism 6.02(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)로 수행했습니다. 모든 분석에서 유의성 임계값은 P < 0.0001입니다.

결과 및 고찰

CCRF-CEM 검출을 위한 GO-apt 형광 압타센서 원리

본 연구에서는 GO와 FAM-apt를 사용해 CCRF-CEM 세포를 검출하는 형광 압타센서를 설계했습니다. CCRF-CEM 세포 검출을 위한 형광 센서 원리는 그림 1에 나타냈습니다. CCRF-CEM 세포가 없을 때 FAM 변형 압타머는 π-π 스태킹으로 GO 표면에 흡착됩니다. GO와 형광체가 에너지 전달을 위해 너무 가까워지므로 소멸제로서 GO가 FAM 형광을 소멸시킵니다. CCRF-CEM 세포가 존재하면 GO-압타머의 약한 결합력으로 압타머가 GO 표면에서 떨어져 나가 세포와 결합해 형광이 회복됩니다. 따라서 FAM 형광 강도 회복에 따라 CCRF-CEM 세포 수를 해당하게 검출할 수 있습니다.

CCRF-CEM 세포 검출을 위한 GO-apt 형광 압타센서 개략도

형광 소멸과 회복

GO에 의한 형광 소멸과 CCRF-CEM 세포 존재 시 형광 회복의 연속적 과정을 형광 분광광도계로 관찰할 수 있습니다. GO-형광 압타머 기반 센싱 전 과정은 그림 2a에 나타냈습니다. 25 nM Tris-HCl 완충액 중 FAM-apt 형광 스펙트럼은 FAM 존재로 강한 형광 강도를 보입니다(그림 2a, 곡선 a). 그러나 GO 첨가 후 형광 강도가 현저히 감소했습니다(그림 2a, 곡선 b), GO와 압타머가 가깝게 흡착될 때 GO가 형광을 효율적으로 소멸시킬 수 있음을 나타냅니다. 놀랍게도 5 × 10⁶ CCRF-CEM 세포를 첨가하면 소멸된 형광이 제때 회복되었습니다(그림 2a, 곡선 c). 반면 GO 결합 없는 FAM-apt는 CCRF-CEM 세포 첨가 시 형광 강도에 뚜렷한 변화가 없었습니다(그림 2a, 곡선 d). CCRF-CEM은 비형광 세포입니다(그림 2a, 곡선 e); 따라서 형광 회복은 주로 압타머가 그래핀 표면에서 해리되어 형광기가 노출되기 때문입니다. FAM 표지 Sgc8 압타머와 CCRF-CEM의 다양한 조건에서 형광 방출 스펙트럼 통계 분석을 수행했습니다(그림 2b).

Go-apt의 CEM 세포 검출 타당성. a 다양한 조건에서 FAM-apt와 CCRF-CEM 세포의 형광 방출 스펙트럼: (a) FAM-apt, (b) FAM-apt + GO, (c) FAM-apt + GO + CCFF-CEM, (d) FAM-apt + CCFF-CEM, (e) CCRF-CEM; FAM-apt (20 nM); GO (25 μg/mL); CCRF-CEM (1 × 10⁶ 세포). 여기 490 nm. b 다양한 조건에서 FAM-apt와 CCRF-CEM의 형광 방출 스펙트럼 통계 분석. NS 비유의. ****P < 0.0001

GO-apt 형광 압타센서 특성 분석

설계를 검증하기 위해 균일하고 분산된 GO를 얻었습니다. 그림 3a에서 두께 1.17 nm의 GO 시트가 AFM으로 전형적인 2차원 외관을 가짐을 알 수 있습니다. 그러나 두께 1.94 nm의 GO-apt는 FAM-apt가 GO 표면에 성공적으로 흡착되었음을 보여줍니다. FAM-apt와 GO의 제타 전위는 각각 -11.35와 -23.90 mV였으나, GO가 FAM-apt와 비공유적으로 상호작용할 때 제타 전위 절대값이 증가했습니다(그림 3b). 이 결과들은 압타센서가 성공적으로 구축되었음을 나타냅니다. 그림 3c에서 GO는 방향족 C=C 결합의 π-π* 전이에 기인한 234 nm에서 강한 흡수를 보입니다. FAM-apt는 DNA 서열(260 nm)과 FAM(503 nm) 흡수 대역으로 특징지어지며, FAM-apt 용액에 GO 첨가 시 적색 편이가 발생하고 FAM의 503 nm 흡광도가 증가합니다. 가능한 이유는 FAM-apt가 GO 표면에 흡착되어 GO와 염료의 두 π 시스템 간 바닥 상태에서 전자적 상호작용이 일어나기 때문입니다. 따라서 GO-apt가 성공적으로 구축되었음을 나타냅니다.

GO-apt 특성 분석. a GO와 CEM-apt의 AFM 이미지. b FAM-apt, GO, CEM-apt 표면 제타 전위. 오차 막대는 ± SD (n = 3). c UV-가시광 흡수 스펙트럼: (a) GO, (b) FAM-apt, (c) GO-apt

세포 형광 현미경

떨어져 나간 FAM-apt의 세포 수준 특이적 결합을 직접 시각화하기 위해 CCRF-CEM과 Ramos 세포를 Go-apt와 배양 후 형광 현미경으로 분석했습니다. 형광 스펙트럼 실험과 일관되게 FAM-apt는 Go-apt에서 떨어져 나가 CCRF-CEM 세포에 결합해 형광 염색하지만 Ramos 세포에는 결합하지 않습니다(그림 4).

GO-apt와 혼합 후 CCRF-CEM과 Ramos 세포 형광 현미경 사진. 핵은 DAPI로 염색. 눈금 막대 25 µm

CCRF-CEM 검출을 위한 실험 조건 최적화

형광 압타센서의 우수한 성능을 얻기 위해 형광 소멸과 회복 시간을 최적화했습니다. FAM-apt와 GO, 그리고 CCRF-CEM 세포가 있는 균질 GO 용액 내 FAM-apt의 동역학적 거동을 소멸 및 회복 시간 함수로 형광 강도 모니터링으로 조사했습니다(그림 5a, b). 그림 5a에서 GO 존재 하 FAM-apt 형광 소멸이 배양 시간 함수로 관찰됩니다. FAM-apt가 GO 표면에 빠르게 흡착된 후 에너지 전달을 겪으며, 형광 강도가 유의하게 감소하고 2분 후 느려지는 경향을 보입니다. 반면 CEM-apt 형성과 GO 표면에서의 방출은 더 느립니다. 배양 시간이 30분 이상일 때 형광 강도가 플랫폼에 도달했습니다(그림 5b). 이 시간 의존 실험은 GO가 우수한 소멸제로서 FAM-apt 형광을 빠르게 소멸시키고 CEM 존재 시 점진적으로 형광을 회복함을 보여줍니다.

실험 조건 최적화. a GO에 의한 FAM-apt(20 nM) Tris-HCl 완충액 내 형광 소멸 시간 함수. b CCRF-CEM(1 × 10⁶)에 의한 GO 용액 내 FAM-apt 형광 회복 시간 함수. c CCRF-CEM 세포 부재(곡선 a) 및 존재(곡선 b) 시 GO 농도에 따른 FAM-apt 형광 강도 영향. d 1 × 10⁶ CCRF-CEM 세포에 의한 FAM-apt 형광 강도 비(F/F₀)의 GO 농도 함수. 여기 490 nm

CCRF-CEM 검출에 형광 압타센서를 더 민감하게 하기 위해 GO 농도 최적화는 필수적입니다. 그림 5c는 우리 전략을 명확히 보여주며, CCRF-CEM 부재(그림 5c, 곡선 a)와 존재(그림 5c, 곡선 b) 시 다양한 GO 농도가 FAM-apt 형광 강도에 미치는 영향을 나타냅니다. 그림 5c에서 볼 수 있듯 GO 첨가 시 형광 신호 배경이 유의하게 감소합니다. 그림 5d는 1 × 10⁶ CEM 세포에 의한 FAM-apt 회복 형광의 GO 농도 함수입니다. 그림 5d에서 GO 농도 20 µg/mL일 때 F/F₀ 비율(F₀와 F는 각각 CCRF-CEM 부재와 존재 시 518 nm에서 FAM 형광 강도)이 13.0354로 최대값을 가짐을 알 수 있습니다. 따라서 20 µg/mL를 최적 GO 농도로 간주했습니다.

GO-apt 형광 압타센서로 CCRF-CEM 검출

좋은 실험 결과를 얻기 위해 최적 실험 조건으로 CCRF-CEM을 검출했습니다. 그림 6a는 CCRF-CEM 개수가 0에서 1 × 10⁷로 증가함에 따라 형광 강도도 그에 따라 증가함을 보여줍니다. 더욱이 F/F₀는 1 × 10² ~ 1 × 10⁷ 범위에서 CCRF-CEM 개수에 명확한 선형 의존성을 보입니다(그림 6b). 선형 회귀 방정식은 Y(F/F₀) = 3.2608 × log C − 5.1892 (C는 CCRF-CEM 개수)이며 회귀 계수 R² = 0.9922입니다. 검출 한계는 10 세포 미만으로 간주됩니다. 따라서 GO 기반 형광 압타머 센싱은 넓은 검출 범위를 가져 CCRF-CEM 검출용 이상적 바이오센서로 사용될 수 있습니다. 다른 방법과 비교해 이 방법은 더 높은 감도를 가집니다(표 1) [34-39].

Go-apt의 CEM 세포 검출. a 다양한 농도 CCRF-CEM 세포 존재 시 GO-apt 형광 압타센서 형광 방출 스펙트럼. b 형광 강도 비(F/F₀)와 CCRF-CEM 세포 농도 간 선형 관계

GO-apt 형광 압타센서 특이성

GO-apt 형광 압타센서의 특이성을 조사하기 위해 Ramos 세포, H22 세포, 293T 세포 등 여러 다른 세포로 시스템을 테스트했습니다. 각 100-µL 반응 시스템에 1 × 10⁶ 세포를 포함했습니다. 그림 7은 CCRF-CEM이 다른 대조군보다 높은 형광 강도를 얻음을 보여줍니다. 결과는 설계된 형광 압타센서가 고특이성을 가짐을 명확히 나타냅니다.

CEM용 형광 압타센서 특이성. CEM 세포, Ramos 세포, H22 세포, 293T 세포 존재 시 GO-apt 형광 압타센서 형광 강도 비(F/F₀) (각각 1 × 10⁶), F₀와 F는 각각 518 nm에서 검출 세포 부재/존재 시 형광 강도. 여기 490 nm

결론

우리는 CCRF-CEM 세포 검출을 위한 편리하고 저렴하며 고감도인 형광 압타센서를 개발했습니다. 이 전략은 그래핀과 단일가닥 DNA 간 π-π 스태킹에 의한 비공유 결합 상호작용과 그래핀의 우수한 형광 소멸 성능을 영리하게 활용합니다. 압타머에 비해 CEM-압타머 복합체의 GO 결합이 약해 그래핀에 의해 소멸된 형광이 점진적으로 회복됩니다. 최적 조건에서 검출 한계는 100 세포 미만으로 간주됩니다. 따라서 우수한 성능을 바탕으로 형광 압타센서는 종양 세포 검출에 광범위한 전망을 가집니다.

변경 이력

약어

AFM:

원자힘현미경

CEM-apt:

CCRF-CEM-압타머 복합체

FAM-apt:

FAM 표지 Sgc8 압타머

FRET:

형광 공명 에너지 전달

GO:

그래핀 옥사이드

GO-apt:

그래핀 옥사이드-압타머 복합체

PBS:

인산완충생리식염수