이 연구는 CO2에 의해 매개되는 5-플로로우라실(5-FU)로 캡슐화된 에토좀의 투과성을 조사하기 위해 고안되었습니다. 비후성 흉터 조직에 대한 프랙셔널 레이저. 또한 CO2의 치료 및 지속 효과 토끼 귀 비대 흉터 모델에서 5-FU 캡슐화된 에토솜과 결합된 분수 레이저가 평가될 것입니다.
5-FU의 투과량과 5-FU의 머무름 함량은 모두 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 측정했습니다. Rodanmin 6GO(Rho)로 표지된 5-FU(5E)로 캡슐화된 에토좀의 형광 강도는 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)으로 측정했습니다. CO2에 의해 매개되는 토끼 귀 비후성 흉터에서 Rho로 표지된 5E의 투과성 촉진 프랙셔널 레이저는 조사 후 0시간, 6시간, 12시간, 24시간, 3일 및 7일에 평가되었습니다. 마이크로 채널의 개방 속도는 CLSM에 따라 계산되었습니다. 5EL의 치료 효과는 생체 내 토끼 귀 비대 흉터에 대해 평가되었습니다. 치료 전후의 토끼 귀 비후 흉터의 상대적인 두께를 캘리퍼스법으로 측정하였다. 토끼 귀 비후 흉터의 흉터 상승 지수(SEI)는 H&E 염색을 사용하여 측정되었습니다.
데이터에 따르면 5EL군의 침투량이 5E군보다 높았다(4.15 ± 2.22 vs. 0.73 ± 0.33, p <0.05) 1시간 처리 후. 또한, 5EL의 침투량은 5E 그룹보다 높았다(107.61 ± 13.27 vs. 20.73 ± 3.77; p <0.05) 24시간 처리 후. 5EL군의 유지율도 5E군보다 높은 수준을 보였다(24.42 ± 4.37 vs.12.25 ± 1.64, p <0.05). 5EL 그룹의 비대 흉터 조직에서 Rho의 형광 강도는 다른 시점(1, 6, 24시간)에서 5E 그룹보다 더 높았습니다. 마이크로 채널의 개방률은 24시간 이내에 점진적으로 감소했고 마이크로 채널은 CO2 조사 후 3일 완전히 닫혔습니다. 분수 레이저. 치료 7일 후 토끼 귀 비후 흉터의 상대 두께와 SEI는 5EL군이 5E군보다 유의하게 낮았습니다.
CO2 프랙셔널 레이저와 국소 5E를 결합하면 생체 내 비후성 흉터 치료에 효과적일 수 있으며 인간 비후성 흉터에 대한 새로운 치료 방법을 제공할 수 있습니다.
<섹션 데이터-제목="배경">비후성 흉터는 과도한 양의 콜라겐 침착이 특징인 피부 상태로, 흉터가 솟아오르지만 관찰된 정도의 켈로이드에는 도달하지 않습니다[1]. 선진국에서는 매년 5,500만 건의 선택적 수술과 2,500만 건의 외상 후 수술로 인해 총 1억 명의 환자가 흉터를 개발했습니다[2]. 수술 후 환자의 약 60%에서 수술 후 일반적으로 처음 3개월 동안 비후성 흉터가 발생했습니다. 대부분의 비후성 흉터는 수술 후 12개월이 지나도 비후성 상태를 유지합니다[3]. 현재 일반적인 치료 방법에는 수술적 치료와 비수술적 치료가 있습니다. 압박, 방사선 요법, 화학 요법 및 기타 약물 외과 적 치료가 주요 치료법입니다. 지금까지 이러한 치료법은 결함으로 인해 원하는 치료 효과를 얻을 수 없었습니다[4, 5]. 약물 요법은 국소 주사를 기반으로 한 외부 페인팅에 대한 병리학적 흉터에 대한 가장 일반적인 비수술적 치료법 중 하나입니다. 약물 부작용으로 인해 국소 주사는 종종 소규모 및 저용량 치료로 제한됩니다. 더욱이, 짧은 약물 반감기 때문에 국소 약물 주사는 항상 흉터에 오래 지속되는 높은 농도를 유지하는 데 실패했습니다. 따라서 반복 주사가 필요한 경우가 많습니다[6]. 흉터 조직의 밀도와 심한 통증을 고려할 때 일반적으로 주사는 환자에게 허용되지 않습니다. 통증이 없고 간에 부작용이 없고 장기간 외용으로 사용하기 편리한 장점에도 불구하고[7, 8], 병적 흉터의 특수한 조직 구조로 인해 약물이 흉터에 들어갈 수 없었다. 최근 보고에 따르면 국소 약물은 흉터 조직에 침투하기 어렵다[9]. 따라서 현재 약물의 외부 사용은 제한되어 있습니다.
에토솜은 2000년 Touitou[10]에 의해 사용된 새로운 지질 운반체로 피부를 통해 약물을 전달하는 데 효과적입니다. 에토솜의 주성분은 에탄올로 큐티클 지질 분자의 촘촘한 배열을 변화시키고 지질 유동성을 향상시키며 에탄올 리포솜 막의 유연성과 이동성을 촉진할 수 있습니다. 에토솜의 에탄올은 또한 각질층의 변형을 가속화하고 피부의 무질서한 각질층을 통해 약물의 운반 및 침투 능력을 향상시킬 수 있습니다[11,12,13]. 그러나 흉터 조직은 정상적인 피부 조직과 달리 특별한 구조를 가지고 있습니다. 우리의 이전 연구에서 우리는 에토솜이 인간 흉터에서 약물을 위한 매우 효율적인 운반체임을 입증했습니다[14]. 흉터 조직에 약물이 잘 분포되지 않고 피부 외부에서 내부로 현저히 감소하는 것이 필수적입니다. 약물은 주로 표피와 진피의 표피층에 축적되지만 모든 진피층에는 축적되지 않아 항흉터 효과가 감소합니다.
미용 기술인 절제 프랙셔널 레이저 요법은 현재 매우 대중적이고 널리 수용되는 방식이며 주로 얼굴 주름, 표재성 흉터, 색소 침착 장애 및 피부 결 개선의 임상 치료에 사용됩니다[15,16,17]. 도트 매트릭스 광열분해 이론[18]에 기초하여, 절제 프랙셔널 레이저는 작은 레이저 빔의 어레이와 같은 배열을 생성하고 열 손상 영역으로 둘러싸인 절제 미세 수직 채널을 생성하여 피부 장벽을 파괴하여 중간 피부에 상처 치유 반응을 유도합니다. 외관 [19,20,21,22]. 약물 경피 흡수의 주요 장벽은 각질층이라고 보고되었습니다[23, 24]. 최근 연구에 따르면 가장 일반적으로 사용되는 임상 절제 프랙셔널 레이저 중 하나인 CO2 프랙셔널 레이저는 각질층을 파괴하고 조밀한 미세다공성 채널을 형성하여 약물 경피 흡수를 방해하는 주요 장벽을 약화시키고 우수한 경피 약물 침투 촉진 전망을 제공할 수 있습니다[25,26,27,28].
이 연구에서는 CO2를 탐색했습니다. 인간 흉터 샘플 및 토끼 귀 비대 흉터 모델에서 흉터 방지 약물 5-플로라실(5-FU)을 운반하는 분수 레이저 매개 에토좀 겔. 이 새로운 접근법을 사용하여 우리는 긴 흉터 치료 과정을 단축하기 위해 흉터 방지 약물 투여의 효율성을 향상시키는 데 중점을 두었습니다. 처음으로 토끼 귀 비대 흉터 모델을 적용하여 CO2 결정 비후성 흉터 및 약물 침투 효과에 5-FU를 운반하는 분수 레이저 매개 나노 스케일 에토솜. 함께 CO2 국소 약물과 결합된 프랙셔널 레이저는 인간의 비후성 흉터에 대한 새로운 치료 방법을 제공합니다.
Touitou의 방법[10]은 5-FU 캡슐화된 에토좀의 준비로 사용되었습니다. 25°C의 입자 크기 분포 및 다분산 지수(PDI)는 레이저 입자 크기 분석기(λ =632.8nm). PDI <0.1은 균일한 입도 분포를 나타내고, PDI> 0.3은 불균일한 입도 분포를 나타냅니다. 에토솜의 형태를 관찰하기 위해 투과전자현미경(TEM)을 사용하였다. 본 연구에서는 에토좀의 캡슐화 효율(EE)을 측정하기 위해 초원심분리법[29]을 사용하였다.
Franz 세포의 수용체 구획에서 5-FU의 농도는 Waters 2695 HPLC 시스템(Meadows Instrumentation, Illinois) 및 역상 Diamonsil TM C18 컬럼(250mm× 4.6mm, 5μm)이 있는 2487 자외선 검출기에 의해 결정되었습니다. ). 5-FU는 메탄올–H2의 이동상으로 265nm에서 감지되었습니다. O(5:95 v /v ) 1ml/min의 유속으로 데이터는 Waters Empower System을 사용하여 피크 면적과 외부 표준 방법으로 분석되었습니다.
인간의 비대 흉터 조직을 10μm 증분에서 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)으로 분석했습니다. Fluar 10x, 0.5 개구수 대물렌즈가 장착된 Laser Scanning Microscope LSM 510(Zeiss, Jena, Germany)을 사용하여 형광 강도를 분석했습니다. 543nm HeNe 레이저로 광학 여기를 수행했으며 로다민 6GO(Rho)에 대해 560nm 이상에서 형광 방출이 감지되었습니다. 릴리스 버전 4.0 SP2 이미지 분석 소프트웨어로 이미지를 분석하여 흉터 조직의 형광 분포 및 형광 강도를 계산했습니다. 시야의 10 × 10배에서 픽셀 값의 크기와 분포는 반정량적 방법으로 5-FU EG(Rho로 표시) 침투 범위를 결정하기 위한 것이었습니다.
Shanghai Jiaotong 대학 부속 9인민 성형외과 병원의 인간 비후 흉터 표본은 21~35세의 모든 여성인 3건의 환자에서 흉터 절제술에서 얻은 것입니다. 흉터는 어깨와 등에 있습니다. 6개월에서 1년의 비후성 흉터 과정; 흉터 조직 무결성; 궤양 없음; 감염 병변 없음; 그리고 가장 낮은 흉터도 피부보다 높아야 하며, 환자는 질병 이후로 어떤 치료도 받지 않았습니다. 전신 마취는 흉터 조직에 대한 국소 마취제의 효과를 제거하기 위해 사용되었습니다. 채취한 검체를 피하조직에서 즉시 제거하고 표피를 보호하고 두께 4.0mm, 면적 3cm × 3 cm의 흉터조직샘플을 만들고 상온에서 식염수로 세척한 후 거즈건조표면수분으로 건조시킨 후 랩으로 감싼다. 알루미늄 호일로 포장하여 - 20 °C의 냉장고에 보관합니다. 인간의 비대 흉터 조직을 제거하고 사용 전에 - 20°C 냉동고에 보관했습니다. 인간의 비대 흉터 조직을 25°C에서 2시간 동안 pH 7.4 PBS에 담그고 조직 표면의 물을 마른 거즈로 부드럽게 제거했습니다. 비후성 흉터 조직의 모든 표피 조직 영역은 CO2였습니다. 분수 레이저 조사. 레이저 매개변수 다음에 DeepFX 모드, 25mj 에너지 밀도, 20% 적용 범위, 300Hz 방출 주파수, 10번째 스폿 크기 및 중복되지 않습니다. 조사된 모든 샘플은 5-FU의 흉터 조직 함량을 결정하기 위해 HPLC 검출을 사용하여 수집되었습니다. 조직 병리학 섹션은 즉시 CLSM 분석에 사용됩니다.
토끼 귀 비대 흉터 모델의 방법은 아래에 간략하게 설명되어 있습니다. 12마리의 뉴질랜드 흰 토끼, 수컷, 체중 2kg(SLAC, 상하이)을 2주 동안 따로 보관했습니다. 토끼 마취를 위해 근육 주사를 통해 루미안을 체중 100g당 케타민 1.5mg과 혼합했습니다. 모든 상처는 토끼 귀의 중심점으로 둘러싸여 있었습니다. 직경 1cm의 둥근 상처는 각각 결함이 있었고 연골막을 제거했습니다. 수술 28일 후 토끼 귀는 상처에서 딱지를 떼어내고 완전히 치유되었으며 육안으로 볼 수 있는 직경 약 0.9cm의 비후성 흉터가 있습니다. 흉터는 선홍색이었고 명백한 증식 주변의 피부에 융기가 있었고 흉터는 두껍고 단단했습니다.
CO2 이후의 다른 시점 토끼 귀 비대 흉터 모델에서 분수 레이저 치료, 에토솜이 있는 적색 형광 Rodanmin 6GO를 흉터 조직에 적용했습니다. 3시간 후, CLSM을 채널 개방율 결정에 사용했습니다. 채널 개도율 =열린 채널 번호/(오픈 채널 번호 + 닫힌 채널 번호) × 100%. 채널 개방율의 백분율은 CO2의 영향을 반영합니다. 분수 레이저 침투 효과.
일반적으로 토끼는 10% 펜토바르비탈 i.v.를 사용하여 희생됩니다. 주사(마취를 위한 정상 용량의 5배 용량, 35 mg/kg). 즉시 표본을 제거하고 H&E 염색 단계를 진행합니다. Hematoxylin 및 eosin 염색 방법은 표준 H&E 염색 프로토콜에 따릅니다.
토끼 귀 비대 흉터 유도 28일 후 4개 그룹의 중재가 수행됩니다. 5EL 그룹:CO2와 결합된 5-FU로 캡슐화된 엔토솜 겔 분수 레이저; 5E 그룹:5-FU로 캡슐화된 엔토솜 겔; CO2 그룹:CO2 프랙셔널 레이저 치료; 및 통제 그룹. 토끼 귀 비대 반흔 조직의 가장 두꺼운 부분의 두께를 A, 토끼 귀 비대 반흔 조직의 가장 두꺼운 부분(중심점 부근)에서 1.0 cm 떨어진 두께를 B로 정의하였다. 상대 두께는 A/B로 계산됩니다. 피부 흉터 비대는 SEI에 의해 설명되었습니다. SEI =새로 형성된 진피의 면적/상처가 없는 진피의 면적. SEI> 1.5는 비후성 흉터를 나타냅니다.
모든 실험은 세 번 반복되었습니다. 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 표시됩니다. 통계 분석은 SPSS 버전 19.0(SPSS Inc., Chicago, USA)을 사용하여 수행되었습니다. 학생의 t 검정을 사용하여 유의성을 계산했습니다. *p 값 <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었고; **p 값 <0.01은 통계적으로 매우 중요한 것으로 간주되었습니다. ***p 값 <0.001은 통계적으로 매우 중요한 것으로 간주되었으며 ****p 값 <0.0001은 통계적으로 매우 매우 중요한 것으로 간주되었습니다.
<섹션 데이터-제목="결과">먼저, 5-플로로우라실(5E)로 캡슐화된 에토솜 겔의 품질을 검증하기 위해 투과전자현미경(TEM) 관찰을 통해 형태와 직경을 검출하였다. 현탁 상태의 에토솜은 현미경으로 100nm 미만인 보편적인 크기의 완전한 원형 또는 타원형 소포를 형성했습니다(그림 1a-b). 겔 제형 후, 에토솜은 손상되지 않은 상태로 유지되었습니다(그림 1c-d). 레이저 입자 크기 분석기를 사용하여 현탁액 상태의 에토솜은 직경이 87.72 ± 9.27nm인 것으로 나타났고 PDI는 0.10 ± 0.01이었습니다. 한편, 에토솜의 입자 크기는 98.78 ± 10.88 nm, PDI는 0.11 ± 0.02였다. 통계학적 비교는 입자 크기에 큰 차이가 없음을 보여줍니다(p> 0.05). 또한 두 PDI 모두 유의한 차이가 없었습니다(p> 0.05). 또한, 레이저 입도 분석기와 TEM에서 얻은 데이터도 비슷한 결과를 보여주었다. 또한, 포획 효능(EE)도 초원심분리 방법을 사용하여 결정했습니다(표 1). 그 결과 에토좀 현탁액의 EE는 10.47 ± 1.47%, 에토좀 겔의 EE는 11.56 ± 1.12%(n =6), 의미 없음(p)> 0.05). 결론적으로 에토좀의 현탁 상태와 겔 상태에서는 형태 및 입자 크기 변화가 관찰되지 않았다.
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5-FU 에토솜의 투과 전자 현미경 이미지. 솔루션의 기풍(a 그리고 b ) 및 젤의 에토솜(c 그리고 d )
5-플로로우라실(5-FU)로 캡슐화된 에토솜의 품질을 평가한 후 CO2 유무에 관계없이 인간의 비후성 흉터에서 투과성을 조사했습니다. 체외 프랙셔널 레이저. 인간의 비대 흉터 조직은 CO2에 의해 조사되었습니다. 프랙셔널 레이저와 5E를 고르게 도포했습니다. 5-FU의 누적 농도는 HPLC에 의해 1, 3, 6, 10, 16 및 24시간에 결정되었습니다(2). CO2의 5-FU 누적 농도를 비교했습니다. 다른 시점에서 5-플로로우라실(5EL) 그룹 및 5E 그룹으로 캡슐화된 에토솜과 결합된 분수 레이저. 1시간에 5EL 그룹의 5-FU 누적 농도는 4.15 ± 2.22μg/ml/cm 2 였습니다. , 5E군보다 높은 농도(0.73 ± 0.33μg/ml/cm 2 , p <0.001). 장기치료(24시간)에서 5EL군의 5-FU 누적투과농도(107.61 ± 13.27 μg/ml/cm 2 )도 5E군보다 높았다(20.73 ± 3.77 μg/ml/cm 2 , p <0.0001). 더 이른 시점인 3, 6, 10 및 16시간에서 5EL 그룹은 항상 5E 그룹보다 더 높은 5-FU 누적 투과 농도를 보였습니다(그림 2a). 또한 5EL군에서 5-FU의 머무름량은 24.42 ± 4.37 μg/cm 2 , 이는 5E 그룹(12.45 ± 1.64μg/cm 2 )보다 높습니다. , p <0.01, n =6) (그림 2b). 이 결과는 CO2 부분 레이저 조사는 인간의 비대 흉터 조직을 통해 5-FU 함유 리포솜을 상당히 촉진하고 시험관 내 비대 흉터 조직에서 5-FU 보유를 도울 수 있습니다.
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CO2 프랙셔널 레이저는 시험관 내 비대 흉터를 통해 5E 투과성을 촉진합니다. 아 시험관 내 인간 비후성 흉터에 대한 24시간 연구에서 5E 및 5EL 그룹의 침투 비교. 값은 평균 ± SD로 표시되었습니다. n =6. b 24시간 동안 적용 후 시험관 내 비대 흉터에서 5-FU의 누적 보유. n =6. ***p 값 <0.001은 통계적으로 매우 중요한 것으로 간주되었습니다. ****p 값 <0.0001은 통계적으로 매우 매우 중요한 것으로 간주되었습니다.
5-FU 침투의 깊이와 정도는 CO2의 침투 강화 효과를 평가하기 위해 Rho로 표시된 5E를 사용하여 결정되었습니다. 체외에서 분수 레이저. 형광 분석은 5-FU 처리 후 1, 6 및 24시간에 5E 및 5EL 그룹의 강도를 나타내는 데 사용되었습니다(그림 3a). 결과는 1시간 5EL 처리 후 Rho 형광이 표피와 진피 얕은 층, 특히 CO2 주변에 분포되었음을 보여주었습니다. 부분 레이저 유도 가스화 영역. 대조적으로 CO2 없이 부분 레이저 조사, Rho 형광 분포는 5E 그룹의 표피 영역으로 제한되었습니다. 5EL 그룹에서 6시간 처리 후, Rho 형광은 진피 깊숙이까지 확장되어 더 많은 축적을 나타냈습니다. 5E군의 형광분포는 진피에서 나타나기 시작하였으나 형광강도는 진피에서 표피로 점차 감소하였다. 24시간 처리 후 두 그룹의 형광이 전체 피부 조직에 널리 분포되었지만 형광 강도는 5EL 그룹에서 유의하게 더 높았습니다. 또한 릴리스 버전 4.0 SP2 이미지 분석 소프트웨어를 정량 분석에 사용하여 두 그룹의 형광 강도를 계산했습니다. 정량분석 결과 5EL군이 5E군보다 유의하게 증가된 Rho 형광강도를 보였다(1시간:59.61 ± 6.39 vs.6.39 ± 1.64, p <0.0001; 6시간:163.32 ± 13.23 대 49.89 ± 4.01, p <0.0001; 24시간:270.36 ± 8.73vs. 148.25 ± 16.89, p <0.0001) (그림 3b). 요약하면 CO2 부분 레이저 조사는 시험관 내에서 인간의 비대 흉터 조직으로 5E 침투를 크게 촉진합니다.
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CO2 프랙셔널 레이저는 시험관 내 비대 흉터를 통해 투과성을 촉진합니다. 아 적색 형광은 시험관 내에서 1, 6, 24시간 후 비후성 흉터 조직을 투과한 에토솜으로 표시됩니다. ㄴ 1, 6, 24시간 후 시험관 내 비대 흉터 조직에서 로다민 6GO 표지된 에토솜의 형광 강도. ****p 값 <0.0001은 통계적으로 매우 매우 중요한 것으로 간주되었습니다.
CO2의 더 실질적인 증거를 얻으려면 분수 레이저 효과, 우리는 토끼 비대 흉터 모델을 사용하여 생체 내에서 5-FU 침투를 수행했습니다. 토끼 비대 흉터 모델 설정은 방법으로 설명되었습니다. CO2 적용 후 다른 시점(3시간, 6시간, 12시간, 24시간, 3일, 7일) fractional laser, 5E 또는 5EL 처리가 수행되었고 형광 분포는 CLSM에 의해 즉시 결정되었습니다(그림 4). Rho 형광은 제거 영역에 더 가까운 토끼 귀 비대 흉터의 진피층에 광범위하게 가시적이고 널리 분포되어 있습니다(그림 4a). 이러한 결과는 5E와 혼합된 Rho가 CO2 이후 다공성 채널을 통해 주로 침투함을 나타낼 수 있습니다. 분수 레이저 조사. 형광은 작은 분포 영역에서도 6시간 5EL 후에 진피 조직을 둘러싼 절제 영역에서 감지될 수 있습니다(그림 4b). 형광 분포 영역은 약물 치료 후 12시간 동안 계속해서 축소되며, 이는 상처가 치유될 때 미세 다공성 채널이 점차적으로 닫힘을 나타냅니다(그림 4c). CO2의 24시간, 3일, 7일 처리 후 부분적인 레이저 조사에서 형광은 구멍 주변의 껍질 구멍 내에서만 발견될 수 있었고 진피로의 침투는 없었습니다(그림 4d-f), 이는 CO2 프랙셔널 레이저 투과 효과는 표피의 완전한 재상피화로 사라졌습니다. 우리의 데이터는 마이크로 채널 개방이 5EL 치료에서 약물 침투에 중요한 역할을 한다고 제안했습니다. 그 후 레이저 조사 후 각각 3시간, 6시간, 12시간, 24시간, 3일 및 7일의 마이크로 채널 개방율을 계산했습니다. 3시간과 6시간의 시점에서 미세다공성 채널이 모두 열려 있어 미세채널 개방률이 100%임을 나타냅니다. 마이크로 채널 개방률은 12시간에 90.59%, 24시간에 15.58%로 감소하기 시작했습니다. 특히 5EL 처리 후 3일과 7일에 미세다공성 채널이 모두 닫혔다. 종합하면 이 결과는 CO2 프랙셔널 레이저는 생체 내 토끼 비대 흉터 조직의 약물 침투를 제어합니다.
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CO2 분수 레이저는 생체 내에서 마이크로 채널 개방 속도를 촉진합니다. 적색 형광은 에토솜 투과 토끼 귀 비대 흉터 조직 0시간(a ), 6시간(b ), 12시간(c ), 24시간(d) ), 3일(e ) 및 7일(f ) CO2 이후 생체 내 프랙셔널 레이저 치료
5EL 치료를 깊이 이해하기 위해 우리는 토끼 귀 비후 흉터의 상대적 두께 측정을 수행했습니다. 토끼 귀 비대 흉터 모델 설정 후, 5EL 처리 전후의 상대 두께 값을 계산했습니다. 치료 전 그룹에서는 유의한 차이가 발견되지 않았습니다. 그러나 5EL군의 상대두께는 1.27 ± 0.15로 5E군(1.52 ± 0.10, p <0.05) 및 미처리(1.61 ± 0.15, p <0.0001) 그룹(그림 5). 흥미롭게도 CO2 레이저 치료 전용군과 5EL군. 이 데이터는 CO2 프랙셔널 레이저는 생체 내에서 토끼 귀 비후성 흉터를 치료하는 데 지배적인 역할을 합니다.
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다른 치료를 적용하기 전과 후의 토끼 비후성 흉터의 상대적 두께 비교. 5EL:CO2와 결합된 5-FU로 캡슐화된 엔토좀 겔 분수 레이저, n =14; CO2 :CO2 분수 레이저 전용, n =12; 5E 그룹:5-FU로 캡슐화된 엔토좀 겔, n =14; 컨트롤:공백, n =16. *p 값 <0.001은 유의미한 것으로 간주됨, ****p 값 <0.0001은 통계적으로 매우 매우 중요한 것으로 간주되었습니다.
우리는 또한 CO2 사용의 차이를 결정하기 위해 토끼 귀 비후 흉터의 형태를 비교했습니다. 분수 레이저. 5EL군에서는 비후성 흉터가 납작해지고 색이 옅은 분홍색으로 크게 변했다(그림 6a-b). CO2에서 프랙셔널 레이저 치료 단독군에서는 비후성 흉터 두께가 어느 정도 감소하고 색이 옅은 빨간색으로 변했습니다(그림 6c-d). 5E 그룹에서는 비후성 흉터 두께가 약간 감소했지만 색상은 밝은 빨간색을 유지했습니다(그림 6e-f). 마지막으로, 처리 전과 비교하여 처리되지 않은 그룹에서는 유의한 변화가 없었습니다(그림 6g-h). 다음으로, 토끼 귀 비후성 흉터 조직에 대해 이 4개 그룹에 대해 처리 후 7일 동안의 병리학적 분석을 위해 H&E 염색을 사용했습니다(그림 7). 5EL 그룹과 CO2 프랙셔널 레이저 치료만 받은 그룹은 드문 표재 진피 콜라겐 섬유가 결절성 또는 나선형 배열을 갖는 점형 딱지와 비후성 흉터의 감소된 진피층 두께를 보였다(그림 7a-b). 많은 수의 진피 콜라겐 섬유 침투, 콜라겐 섬유의 무질서한 배열 및 표재성 진피 결절 또는 나선형 배열이 5E 그룹과 처리되지 않은 그룹에서 발견되었습니다(그림 7c-d). 비후성 흉터에 대한 또 다른 중요한 평가 방법은 흉터 상승 지수(SEI)입니다. 5EL군(1.16 ± 0.08), CO2의 상대두께패턴과 유사한 SEI 프랙셔널 레이저 치료군(1.22 ± 0.10)은 5E군(1.32 ± 0.13) 및 무처리군(1.49 ± 0.08)에 비해 유의하게 감소하였다(Fig. 8). 종합하면 형태 분석 및 SEI 계산 데이터는 CO2를 나타냅니다. 생체 내 토끼 귀 비대 흉터 치유에 대한 분수 레이저 기능.
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7일 동안 다른 치료를 적용하기 전과 후의 토끼 비대 흉터의 사진 영상. 5EL 그룹:CO2와 결합된 5-FU로 캡슐화된 엔토좀 겔 분수 레이저, 전(a ) 및 이후(b ) 7일 동안의 치료 CO2 그룹:CO2 분수 레이저, 전(c ) 및 이후(d )7일 동안의 치료 5E 그룹 B:5-FU로 캡슐화된 엔토솜 겔(e ) 및 이후(f ) 7일 동안의 치료 및 공백 그룹:공백, 앞(g ) 및 이후(h ) 7일 동안의 치료
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7일 동안 다른 치료를 적용한 후 토끼 비대 흉터의 H&E 조직학적 분석. 5EL 그룹:CO2와 결합된 5-FU로 캡슐화된 엔토좀 겔 분수 레이저(a ); CO2 그룹:CO2 프랙셔널 레이저 치료(b ); 5E 그룹:5-FU로 캡슐화된 엔토솜 겔(c ); 및 공백 그룹:공백(d ). 원래 배율:× 40
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7일 동안 다른 치료법을 적용한 후 토끼 비대 흉터의 SEI 비교. 5EL:CO2와 결합된 5-FU로 캡슐화된 엔토좀 겔 분수 레이저, n =14; CO2 :CO2 분수 레이저, n =12; 5E:5-FU로 캡슐화된 엔토솜 겔, n =14; 컨트롤:공백, n =16. ***p 값 <0.001은 통계적으로 매우 중요한 것으로 간주되었으며 ****p 값 <0.0001은 통계적으로 매우 매우 중요한 것으로 간주되었습니다.
약물 치료는 비후성 흉터의 비수술적 치료를 위해 주로 국소 또는 국소 주사와 같은 주요 치료 접근 방식입니다. 다양한 약물의 부작용으로 인해 국소 주사는 종종 소량으로 제한되어 치료 범위가 적습니다. 또한 약물의 반감기가 짧기 때문에 흉터에 고농축이 지속되어 반복적인 주사가 필요하다[6, 30, 31]. 또한 흉터 조직이 매우 집중되어 있어 주사 시 심한 통증을 경험하는 경우가 많아 환자가 치료를 받아들이지 않는 경우가 많습니다. Although external drug usage having advantage of being convenient, painless, with long-term stability, low side effects, avoiding to affection of the gastrointestinal environment [7, 8], there are several limitations. First of all, topical and injected drugs availability is limited by special pathological scar tissue structure, which presents with a thickening of the stratum corneum and hyperplasia of the dermis, which hinders the penetration of the drug and achieving an effective therapeutic concentration. Recent reports have proven this and described how external use of drugs inefficiently penetrates the scar tissue [4, 9]. Ethosomes, proposed by Touitou et al. [10] in 2000 as a transdermal drug carrier, have been widely reported [11, 12, 32]. In this study, we improved the ethosomes preparation process to nano-level (particle size 70~90 nm). This change of a new nanoscale dimensions and the spatial conformation of the ethosomes allow them to penetrate into the scar tissue through a narrowly tightly connected cell gap not only due to the small size, but also by the similarity to the cell membrane of scar tissue cells. Based on such penetration mechanisms, ethosomes become a convenient transdermal drug carrier [14, 33, 34]. However, the anti-scar drug 5-FU encapsulated with ethosomes is mainly concentrated in the epidermis and dermis, which is not conducive to fibroblasts in deeper layers of the dermis. Therefore, our purpose is to explore a method that would allow to increase the penetration of drugs and would promote the uniform dispersion of drugs in scar tissue.
So far, commonly used methods to promote the penetration are divided into two categories:the promotion of chemical substances and physical methods to enhance permeability. The physical enhancement techniques include electroporation, iontophoresis, laser, microdermabrasion, microneedle, pressure, radiofrequency induction, and sonography [35]. There are many different types of lasers that have been shown to promote percutaneous administration, and ablative fractional lasers become the most popular laser in recent years for promoting drug penetration into the skin [20]. Ablative fractional laser can not only extremely reduce drug dosage, but also be conducive to drug penetration into deep skin and achieve high local concentrations to obtain a therapeutic effect. CO2 fractional laser, Erbium-doped Yttrium Aluminum Garnet (Er:YAG) fractional laser, and Erbium-doped Yttrium Scandiu Gallium Garnet (Er:YSGG) fractional laser can produce ablative zone or microporous channels on the surface of the skin. Compared with Er:YAG fractional laser (2940 nm wavelength) and Er:YSGG fractional laser (2790 nm wavelength), CO2 fractional laser (10,600 nm wavelength) has lower water absorption coefficient, larger thermal damage, and greater destruction effect of stratum corneum of the epidermis, which is more conducive to promote penetration effect [36].
In this study, 5-FU retention in the 5EL group (24.42 ± 4.37 μg / cm 2 ) was significantly higher than in the 5E group (12.45 ± 1.64 μg/cm 2 ) in scar tissue of 24 h treatment in vitro. Additionally, in Rho-labeled assay, 5EL group has shown higher fluorescence intensity than 5E group at 1-, 6-, and 24-h treatment time points. Image analysis showed that fluorescence can be found distributed in the gasification zone and surrounding dermal tissue matrix after 1-h CO2 laser treatment in the 5EL group, and the fluorescence in 5E group is only distributed in the epidermis. After 6- and 24-h treatment, diffuse fluorescence range is wider and fluorescence intensity is higher in the 5EL group than in the 5E group. CO2 fractional laser-induced gasification zone provided an effective way for drug penetration through the skin scar tissue, enlarge range of dermis penetration depth, and retention content in scar tissue. There are three different forms of thermal effect damage by CO2 fractional laser acting on the skin or scar tissue, from center to outliner, the gasification zone, thermal coagulation necrosis zone, and thermal denaturation zone [37]. Fluorescence data showed that Rho fluorescence was distributed from more concentrated gasification zone to diffused tissue, suggesting that there is no effect for permeation of drugs in thermal coagulation necrosis zone and thermal denaturation zone, which also confirmed the feasibility of CO2 fractional laser for the promotion of topical anti-scarring drug penetration. Together, CO2 fractional laser is conducive to more anti-scarring drugs 5-FU retention in scar tissue and achieve high drug concentration required to strengthen the anti-scarring effect.
The duration of CO2 fractional laser enhancing 5E was evaluated by CLSM on rabbit ear hypertrophic scar in vivo. The opening rates of microporous channels for drug permeation were 100% (0 h), 100% (6 h), 90.59% (12 h), and decreased to 15.58% (24 h) after CO2 fractional laser treatment of hypertrophic scar. Moreover, microporous channel opening rates dropped to zero on 3 and 7 days, and the drug can no longer penetrate into the skin through these channels. These results were consistent with that of epidermal re-epithelialization after ablative fractional laser irradiation, which is the skin wound around the keratinocytes to the wound defect migration and proliferation, covering the wound to form a complete layer of cells formed by the epidermis. When the dermal layer of skin was wound, the repair process will immediately start and quickly rebuild the skin barrier [38, 39]. The whole skin tissue trauma repair process can be divided into four continuous and overlapping steps:coagulation, inflammation, re-epithelialization, and remodeling [40]. Human skin after ablation of the fractional laser irradiation injury area (including the gasification area and coagulation necrosis area) complete epidermal re-epithelialization in 2 to 3 days and dermal remodeling for at least 4 weeks [41]. Thus, although the lesion in the dermis does not heal within 24 h after the CO2 laser treatment, the epidermis has completed the complex epithelization, including the formation of the stratum corneum, where the topical drug could not penetrate through channels. Taken together, epidermis, especially the stratum corneum, is still the main barrier for drug penetration through the skin.
In addition, our CLSM data showed both in in vitro human hypertrophic scar skin and in vivo rabbit ear hypertrophic scar skin, Rho-labeled 5E can penetrate the necrotic coagulation layer and the formation of crust on the surface after the CO2 fractional laser irradiation. It suggested that the skin under the crust but not the coagulation necrotic layer and crust tissue can impede the penetration of drug. Therefore, 24 h is the critical time-point for the effect of CO2 fractional laser on the penetration effect of hypertrophic scar in rabbits.
It has been reported that the clinical application of exfoliative fractional laser is an effective method to treat various skin diseases (such as solar keratosis, basal cell carcinoma, Bowen’s disease, etc.) [25,26,27,28]. However, the clinical efficacy of CO2 fractional laser in combination with drugs has not been explored in the treatment of hypertrophic scars [42, 43]; in particular, there are no reports of combined CO2 fractional laser (physical technique) with anti-scar drug nano-level ethosomes (chemical substances promoting scar penetration) for the treatment of hypertrophic scars. Using in vivo study, we performed a rabbit hypertrophic scar model for validation of CO2 fractional laser protocol. On the seventh day after intervention, the relative thickness of the four groups of hypertrophic scar was measured:experimental group (CO2 fractional laser combined with 5-FU EG):1.27 ± 0.15
The toxicity of the ethosomes should be a big concern in this study. Nevertheless, after reviewing literature, there are no results exhibiting the toxicity of ethosomes in vitro or in vivo study [44,45,46]. The permeability mechanism of ethosomes is mainly as follows:high concentration of ethosomes, the flexibility, and fluidity of ethanol liposome membrane, makes ethosomes deform in the process of transmission, and enhances the permeability in scar tissue [47].
Although the difference between the experiment group and control group A was not statistically significant, the relative thickness and SEI of the experimental group was smaller than that in the control group A. Both groups were treated with CO2 fractional laser, with or without 5E. This finding suggests that CO2 fractional laser may have the dominant role, which overtakes the minor effect of 5E drug in the final anti-scar effect.
CO2 fractional laser can rapidly and significantly promote 5-fluorouracil encapsulated ethosomes’ permeability through hypertrophic scars in vitro. CO2 fractional laser is a potentially efficient method of promoting drug permeation in hypertrophic scars’ treatment. Our hypertrophic scar model (rabbit) showed that CO2 fractional laser combined with external-loaded 5-fluorouracil encapsulated ethosomes can effectively cure hypertrophic scars. Also, CO2 fractional laser itself can facilitate collagen remodeling in hypertrophic scar of rabbit ears. CO2 fractional laser can significantly promote the permeation of 5-fluorouracil encapsulated ethosomes, but the effect begins to relinquish 24 h after CO2 fractional laser irradiation, which indicates that 24 h is a critical period.
나노물질
안전은 모든 제조 산업의 핵심입니다. 작업장에서 안전이 우선 순위가 아닌 경우 질병 및 부상으로 인해 가동 중단 및 생산 중단이 더 많이 발생합니다. 절단 작업에 KUKA 레이저 절단 로봇을 사용하면 이러한 유형의 중단을 거의 완전히 제거할 수 있으므로 안전 수준이 향상되는 동시에 공장의 사기 수준도 향상됩니다. 재료 조각을 자를 때마다 재료 가장자리를 둘러싼 작은 입자가 공기 중으로 방출됩니다. 음식 입자나 생분해성 입자에 대해 이야기하는 경우 큰 문제가 아닐 수 있습니다. 그러나 KUKA 레이저 절단 로봇 시스템은 일반적으로
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