형태 선택적인 세포 흡수를 위한 성장하는 금 나노구조

결과 및 토론

등방성 Au NS의 합성 및 특성화

이방성 Au NS는 이원 계면 활성제 혼합물을 사용하는 종자 매개 성장 접근법을 통해 합성되었습니다. CTAB 캡핑 Au 시드(~ 5 nm)를 이원 계면활성제 혼합물(OA CTAB의 몰비 ~ 20:1)의 성장 용액에 첨가하면 낮은 종횡비의 Au NR이 형성되었습니다(그림 2a 및 표 2). HRTEM 이미지는 NR의 단결정 및 개 뼈 형태를 보여주었습니다(그림 2a의 삽입). 약한 환원제로도 작용하는 지방산인 OA는 Au ³⁺ 의 환원을 촉진합니다. Au ⁺ 로 . 노란색에서 투명하게(~ 15분) 성장 용액의 색상 변화는 우리의 관찰을 확인시켜줍니다. 성장 용액에 아스코르브산을 추가로 첨가하면 Au ⁺ 의 환원율이 증가합니다. . 결과적으로 Au 원자는 NR의 끝 {111} [16]면에서 빠르게 확산되는데, 이는 혼합 미셀 구조의 패킹이 NR의 측면 {110} 및 끝 {100}에 비해 덜 조밀하기 때문입니다[25]. 따라서 측면 및 {100} 패싯보다 끝 패싯에서 NR이 과도하게 성장하면 개뼈 형태의 NR이 형성됩니다. 우리의 결과는 또한 {110} 패싯이 다른 패싯과 비교하여 계면활성제 분자와 이러한 패싯의 강한 상호작용으로 인해 Au로 코팅될 가능성이 없음을 시사합니다. 우리는 또한 개 뼈 형태의 Au NR 형성에서 OA와 아스코르브산의 역할을 확인했습니다. 성장 용액에서 OA 또는 ascorbic acid의 농도가 감소하면 Au NR만 얻어집니다. 이 결과는 금 원자의 환원율과 확산율이 감소하여 Au NR이 형성되었음을 나타냅니다(추가 파일 1:그림 S1, ESI†).

다양한 모양의 Au NS의 STEM 이미지 및 UV-Vis 스펙트럼. 아 개 뼈 형태의 Au NR의 BF-STEM 이미지와 삽입된 HRTEM 이미지는 NR의 단결정 특성을 보여줍니다. ㄴ 길쭉한 46면체 Au NS의 BF-STEM 이미지(삽입은 SEM 이미지임). ㄷ Au BP의 SEM 이미지(삽입은 단일 BP의 SEM 이미지임). d Au 구형 입자의 TEM 이미지(삽입된 HRTEM 이미지는 Au 입자의 다결정 특성을 나타냄). 이 Au NM의 BF-STEM 이미지. 에 다양한 모양의 Au NS의 UV-vis 스펙트럼

CTAB에 대한 OA의 농도가 성장 용액에서 증가했을 때(표 1), 길쭉한 THH 모양의 Au NS가 얻어졌다(그림 2b 및 표 2). Au NS의 모양 변화는 OA에 의한 혼합 미셀 구조의 변형을 기반으로 설명할 수 있습니다. 막대 모양의 혼합 미셀 구조는 낮은 농도의 OA에서 형성됩니다. 혼합 미셀 구조에서 OA의 증가된 양은 볼록하도록 구조를 수정하고 길쭉한 THH Au NS의 형성을 촉진합니다. 우리의 이전 연구는 또한 보조 계면 활성제의 농도 증가가 혼합 미셀 구조를 더 볼록하게 만든다는 것을 밝혔습니다[25]. Au NS의 모양은 OA를 DDAB로 대체하여 변경할 수도 있습니다. 우리는 이전 연구[25]에서 보고된 바와 같이 CTAB 및 DDAB(그림 2c 및 표 2)를 사용하여 바이피라미드(BP) 모양의 Au NS를 얻었습니다. 또한 수정된 Turkevich 방법으로 구형 Au 입자를 합성했습니다(그림 2d).

우리는 또한 Au NS의 모양에 대한 종자 용액의 영향을 조사했습니다. 반응 1분 후 CTAB 및 OA의 성장 용액(OA:CTAB ~ 20:1)에서 시드 용액을 취하고 OA:CTAB ~ 20:1을 함유하는 새로운 성장 용액에 첨가했습니다. nanomakura의 Au NS (NM) 형태는 성장 반응이 완료된 후 얻어졌다(그림 2e). NM의 형태는 개뼈와 유사하게 보입니다. 그러나 NS는 서로 다른 각도에서 촬영한 TEM 이미지(그림 3a 및 표 2)와 같이 모든 방향으로 성장하므로 이러한 NS를 NM이라고 합니다. Au NM의 성장 메커니즘을 설명하기 위해 다른 시간 간격으로 성장 용액에서 소량을 채취하고 STEM 이미징을 사용하여 중간 반응을 분석했습니다(그림 3b). CTAB 코팅된 종자 입자를 첫 번째 성장 용액에 첨가하면 성장 용액의 색상이 등방성 Au NS의 형성을 나타내는 짙은 보라색으로 빠르게 변했습니다. 첫 번째 성장 용액에서 300μL의 용액을 두 번째 성장 용액에 첨가한 후, 용액 몇 방울을 즉시 TEM 그리드에 추가했습니다.

Au NM(nanomakura의 형태 및 성장) ). 아 다른 각도에서 찍은 NM의 TEM 이미지. ㄴ BF-STEM 이미지는 NM 유형 Au NS의 형성에서 성장 단계를 보여줍니다. 다른 시점에서 성장 용액에서 가져온 용액을 정제 없이 TEM 그리드에 직접 추가했습니다.

대표적인 STEM 이미지는 가로 방향(0초)보다 세로 방향에서 Au NM의 성장이 상대적으로 더 빠른 것으로 나타났습니다. 30초 후 나비 넥타이 구성과 유사한 NS가 나타났습니다. 최종 크기를 갖는 NM은 반응 3분쯤에 이미 관찰되었습니다. 30분 및 8시간 후에 NS의 모양과 크기에 더 이상 변화가 없었습니다. 우리의 분석에 기초하여, Au NMs의 전체 성장은 확률론적 "팝콘"과 같은 자가 촉매 성장 메커니즘을 따르는 것으로 가정할 수 있습니다. Cortie et al.에 의해 NR에 대해 관찰되었습니다. [47]. NM은 이전에 보고된 개뼈 모양의 NS와 달리 서로 다른 회전 각도(그림 3a)에서 얻은 NM의 HRTEM 이미지로 표시되는 3차원 구조를 가지고 있습니다[48, 49].

다양한 형태의 Au NS의 광학적 특성을 측정하였고, 그 결과를 Fig. 2f에 나타내었다. Au NS는 UV-Vis--visible--near-infrared(IR) 범위에서 조정 가능한 LSPR 특성을 표시합니다. 플라즈몬 밴드는 서로 다른 축을 따른 공명 진동으로 인해 종방향 밴드와 가로 밴드인 이방성 구조에 대한 다중선으로 분할됩니다. NR은 516nm, 679nm, 796nm의 3개 이상의 고유한 밴드를 표시하며 가장 강한 밴드는 중간 밴드입니다. 세 번째 밴드의 출현은 올레산의 에칭 효과로 인해 발생하는 NR의 다분산성과 관련될 수 있습니다. 이것은 거친 가장자리를 가진 나노로드의 형성으로 이어집니다. 가로 및 세로 공명 피크(각각 557 및 760nm)는 나노막대보다 더 들쭉날쭉한 표면을 가진 NM에서 관찰됩니다. 그러나 더 큰 구조(THH 및 BP)의 경우 단일 및 넓은 LSPR 피크가 각각 568nm 및 593nm에서 관찰됩니다. THH에 대한 UV-vis 스펙트럼은 이전 연구[50]와 유사한 유사성을 나타내지만, BP에 대한 두 가지 모드는 달리 관찰된 것과 달리 넓은 피크로 융합되는 것으로 보입니다[51]. 이것은 BP 모양의 낮은 수율 또는 Au NS에 적용된 비형상 선택적 원심분리 또는 용액에서 모양 이방성을 초래하는 고르지 않은 코팅에 기인할 수 있습니다.

Au NS의 표면 기능화

다른 모양의 Au NS는 이중층 CTAB를 O-[2-(3-mercaptopropionylamino) 에틸]-O-메틸 폴리에틸렌 글리콜(PEG-SH)로 교체한 다음 MUA로 교체하는 두 단계 방법을 사용하여 기능화되었습니다. 그림 4a는 기능화의 각 단계에서 NS의 유체역학적 직경을 보여줍니다. 성공적인 기능화를 나타내는 각 NS(BP 제외)에 대해 CTAB 코팅된 NS와 비교할 때 크기가 순차적으로 증가합니다. DLS 측정은 구형 입자 가정을 기반으로 하므로 이방성 NS에 대한 크기 결정 분석은 이방성 NS와 동일한 확산 계수를 갖는 구형 NS에 근사해야 합니다.

Au NS의 크기 및 제타 전위. 아 기능화의 각 단계 후 Au NS의 DLS 크기의 변화. ㄴ 기능화의 각 단계에 따른 Au NS의 제타 전위 변화. X -축은 다양한 모양의 Au 나노구조를 나타냅니다(NR nanorods, THH tetrahexahedra, NM nanomakura , BP 이중 피라미드, SP 구형)

이것은 PEG-SH 코팅된 BP의 크기가 약간 감소했음을 명확히 하고 위의 UV-vis 데이터도 지원합니다. 기능화의 결과로 NS의 표면 전하는 그림 4b와 같이 크게 감소합니다. 양이온성 계면활성제는 PEG-SH로 쉽게 대체되며, Au 표면에 대한 더 높은 친화도로 인해 MUA로 추가로 대체됩니다. MUA의 크기가 작기 때문에 PEGylation 후에도 NS에 남아 있는 CTAB를 대체할 수 있는 유연성이 더 높습니다. MUA 코팅 NS의 최종 제타 전위 값은 NR을 제외한 모든 NS에 대해 음으로 하전된 표면을 반영합니다. 이 불일치는 작은 NR의 고르지 않은 코팅 또는 다분산성 및 측정 원리가 적용된 것과 관련될 수 있습니다. 구형 NS의 경우 초기 음의 표면 전하는 시트레이트 코팅으로 인한 것입니다. 그러나 모든 NS에 대한 높은 크기의 제타 전위는 수용액에서 NS의 안정성을 보장합니다. 기능화의 각 단계, 즉 PEG-SH에 이어 MUA를 사용하여 Au NS에 대해 수행된 XPS 측정은 표면에 매우 낮은 함량의 브롬을 나타내어 NS 표면에서 결합된 CTAB가 다량으로 제거되었음을 확인합니다. (표 1, ESI).

또한 PEG-SH 및 MUA로 NS를 코팅해도 광학 특성이 크게 변경되지 않습니다. 그러나 이방성 NS에 대한 기능화 후에 순차적 피크 확장이 얻어집니다(추가 파일 1:그림 S3, ESI†). 이는 등방성, 불균일한 코팅, 크기 확대(DLS 데이터), 샘플의 다분산성 또는 위의 조합으로 인한 NS의 회전 축이 다르기 때문일 수 있습니다. Au NS의 광학 특성은 모양, 표면, 크기 및 응집 상태에 따라 달라지므로 세포와의 상호 작용도 마찬가지입니다. 세포 상호 작용 연구는 Au NS가 흡수되는 정도, 세포 독성 효과를 밝힐 수 있으며 미래의 치료 및 진단 응용을 가리킬 수 있습니다.

다양한 모양의 Au NS의 세포 상호작용

일반적으로 Au NS는 수용체 매개 또는 수용체 비의존적일 수 있는 세포내이입, 액틴 의존적 식균작용, 또는 현재 알려지지 않은 다른 세포내이입 경로를 통해 세포에 들어간다[52]. NS가 취하는 경로를 설명하는 것은 궁극적으로 NS 세포 내 운명을 결정하기 때문에 매우 중요합니다[53]. 연구에 따르면 세포 내 흡수 메커니즘은 물리화학적 특성, AR, NS의 표면 특성 및 세포 유형에 따라 달라집니다[54,55,56,57,58]. 표면 안정화 분자의 전하는 사실상 NS의 전하가 될 것이다[59]. 양전하를 띤 NS는 생물학적 매체에서 강한 단백질 흡착을 가지며 세포막을 심각하게 손상시킬 수 있습니다. 이 때문에 세포막에 대한 강한 흡착 및/또는 단백질 흡착을 피하기 위해서는 중성 또는 음전하가 바람직하다[26, 60]. 또한, NS의 모양은 안정화 분자의 표면 적용 범위가 균일한지 여부를 결정합니다[61].

여기서 구형 NS를 제외한 모든 Au NS는 표면 활성제 CTAB로 합성되었습니다. Au NS는 세포 상호 작용 연구 전에 음전하 표면을 얻기 위해 MUA로 기능화되었습니다. 안정한 MUA 코팅된 Au NS는 이후 24시간 동안 인간 교모세포종-성상세포종 세포와 공동 인큐베이션되었으며 세포독성에 대한 모양 및 농도의 효과는 세포내 Au NS를 강조하기 위해 핵 염색이 보충된 LIVE/DEAD® 분석으로 평가되었습니다. .

가장 높은 세포 사멸은 고농도의 NM에서 관찰되었으며(그림 5a), 공백 보정 후 세포 사멸은 20%에 가깝습니다. 다른 NS는 세포독성에서 동일한 경향을 나타내지 않았으며, 이는 NM이 다른 형태보다 더 높은 비율/부피로 흡수됨을 나타낼 수 있습니다[62]. 이러한 모양에 대한 세포 계수는 공백 보정 후 5% 미만의 세포독성을 나타냈습니다(모든 모양의 이미지는 추가 파일 1:그림 S4, ESI† 참조).

교모세포종-성상세포종 세포에 대한 Au NS의 효과. 아 Percentage cell death of glioblastoma-astrocytoma cells as a function of concentration of AuNSs. Incubation time was 24 h. Images b –m are acquired after incubation of makura -shaped AuNSs in glioblastoma-astrocytoma cells taken at several time points up to 24 h. ㄴ TEM shows an invagination of the cellular membrane (m membrane, scale bar = 1 μm), and c halogen and d fluorescence images show association of makura-shaped AuNSs at the cellular membrane. 이 Uptake of makura-shaped AuNSs were observed after 6 h (scale bar = 500 nm), f with uptake in intracellular vesicles (v vesicle, scale bar = 2 μm). 지 Staining of the nucleus (n ) suggests that makura-shaped Au NSs were excluded from the nucleus. 아 TEM images taken after 12 h suggest uptake via macropinocytosis (scale bar = 500 nm), with i intravesicular location of makura-shaped AuNSs (vm vesicular membrane, scale bar = 500 nm). j Intracellular compartmentalization was also visible from the microscopy. Uptake of makura-shaped AuNSs continued at 24 h as seen in TEM images k (scale bar = 2 μm) and l (scale bar = 5 μm). m Detachment of glioblastoma-astrocytoma cells from the surface was observed, which most likely is an indication of cell death

The data presented here suggest that size plays a minor role in cytotoxicity in glioblastoma-astrocytoma cells. For instance, the small spherical NSs (15 nm) showed the same uptake/cytotoxicity as the large BPs (650/270 nm). Based on previous studies, we expected the NRs to give the highest cytotoxicity, due to their AR and surface charge. Positively charged NSs are considered to be particularly toxic as they can induce apoptosis [63] and cause the production of reactive oxygen species [64]. However, in the data presented here, the positively charged NRs did not show increased cell death compared to any other shape (Fig. 5a). This might be explained as follows:the surface charge of NS was determined with zeta potential measurements, an approach based on spherical particle assumption (Table 2). Thus, the reported charge of the NRs most likely misrepresents their actual charge. Although the AR of the rods synthesized here is large (2.8), their overall size falls in a size range that shows good uptake in cells (20–50 nm). [30, 65] A previous study has suggested that the size of NS does not only seem to govern endocytosis but also exocytosis. For instance, the removal half-life of 14 nm AuNS was much faster than removal half-life of 74 nm AuNS [26]. Here, the smaller Au rods and spheres, may, therefore, have been removed via exocytosis, which may explain their low cytotoxicity.

The main feature of the NM is not their size, but their irregular structure, and it appears from the image in Fig. 5a that shape has been the determining factor for the high uptake. However, an irregular morphology may have undermined the surface coverage of MUA and as such decreased the solution stability of the NM. Also, we cannot exclude that as two-dimensional cell studies are affected by gravity, a low stability in the cell medium increases the likelihood of sedimentation which can propel the endocytosis.

To get further insight into the uptake mechanism and interactions, we followed uptake of NM at high concentration (2 mg mL ⁻¹ ) with light microscopy and TEM for 24 h. The images show that after 2 h of co-incubation, the NM associate with the cellular membrane (Fig. 5c, d) and are engulfed by the cells (Fig. 5b, e). The mechanism of endocytosis seems to be initially receptor-mediated (Fig. 5b) and at later stages through macropinocytosis (Fig. 5h). The latter is believed to occur when large objects enter a cell, and the aggregation of NSs may have induced macropinocytosis. This might mean that the initial solution stability of the Au NM is sufficient, but that with time they aggregate and are taken up as larger species, most likely due to protein adsorption. Uptake of any extracellular NS in an intracellular vesicle involves wrapping of the cell membrane. If many such wrapping events occur, this alters the global elasticity of the cell membrane, which in turn affects the membrane integrity. If many macropinocytosis events occur, the membrane integrity may be severely impaired. This is believed to be one of the effects for the cytotoxicity observed for the NM.

Once inside the cell, it appears that the Au NM align at the periphery of the vesicles, adhering to the vesicular membrane (Fig. 5i). The endosome seems to be trafficked towards the nucleus (Fig. 5f, g, and l), which is consistent with previous studies that show that Au NSs taken up via receptor-mediated endocytosis may eventually end up in the Golgi apparatus [53, 66]. The uptake appears to continue upto 24 h (Fig. 5k), owing to the high concentration gradient of Au NS in the cell culture media [59].

At 24 h with co-incubation, the morphology of the cells changes (Fig. 5m), going from star-shaped to a more rounded shape with less visible filopodia [67], followed by detachment from the surface. Although this study does not go further in the molecular events following uptake of NS, a detachment of filopodia may suggest that NM can interact with the cytoskeleton and cause detachment and apoptosis.

We extended the cytotoxicity assay beyond 24 h and investigated the result of co-incubation at 48 and 72 h, the reason being that few cell studies are performed at these time points [68, 69], and the main argument being that cellular uptake reaches a plateau at 24 h [70]. Our results show (Additional file 1:Figure S5, ESI†) that beyond 24 h, the cells continued to detach from the flask surface, i.e., cell death and uptake continue beyond 24 h. As we cannot exclude that starvation of the cells would have increased the cytotoxicity and detachment, a cytotoxic response is a dynamic process likely to evolve over time differentially.