조골세포 유사 3T3-E1 세포에서 지르코니아 나노입자 유도 독성 효과

초록

지르코니아(ZrO₂ )은 기계적 강도가 높고 독성이 적기 때문에 바이오 센서, 암 치료, 임플란트 및 치과와 같은 잠재적인 바이오 응용 분야에 널리 사용되는 금속 산화물 중 하나입니다. 광범위한 적용으로 인해 이러한 나노 입자(NP)에 대한 잠재적 노출이 증가하여 광범위한 관심을 받았습니다. 따라서 ZrO₂의 독성 프로파일을 조사하는 것이 시급합니다. NP. 이산화티타늄(TiO₂ )은 약하게 독성이 있는 것으로 알려진 또 다른 광범위하게 사용되는 나노물질입니다. 이 연구에서 TiO₂ NP는 ZrO₂의 생체 적합성을 평가하기 위한 대조군으로 사용되었습니다. NP. TiO₂의 세포독성을 감지했습니다. 및 ZrO₂ 조골세포와 유사한 3T3-E1 세포의 나노입자와 반응성 산소종(ROS)이 TiO₂에서 중요한 역할을 한다는 것을 발견했습니다. 및 ZrO₂ 농도 의존적 방식으로 NP-유도된 세포독성. TiO₂도 보여주었습니다. 및 ZrO₂ NP는 고농도에서 3T3-E1 세포와 배양한 후 세포 사멸 및 형태 변화를 유도할 수 있습니다. 또한 TiO₂ 및 ZrO₂ 고농도의 NP는 저농도의 NP에 비해 세포 골형성 분화를 억제할 수 있습니다. 결론적으로 TiO₂ 및 ZrO₂ NP는 농도 의존적 방식으로 시험관 내에서 세포독성 반응을 유도할 수 있으며, 이는 골형성에도 영향을 미칠 수 있습니다. ZrO₂ NP는 TiO보다 더 강력한 독성 효과를 나타냄₂ NP.

소개

지난 수십 년 동안 조작된 나노입자(NP)의 응용은 전자, 생물의학 응용 및 제약과 같은 다양한 분야로 확대되었습니다. 지르코니아(ZrO₂ ) 나노입자는 내화물, 주물사, 세라믹 합성에 사용되는 주요 나노물질 중 하나이다. 기계적 강도가 좋아 바이오센서, 암치료, 임플란트, 관절내 인공삽입물, 치과 등의 의공학 분야에서도 활용되고 있다[1, 2]. 그러나 입자가 광범위하게 사용되면서 건강 및 환경에 대한 잠재적 위험에 대한 우려가 제기되었으며, 그 중 직업 및 소비자 안전을 보장하는 것이 필수적인 관심사입니다. 지금까지 ZrO₂에 대한 독성 연구 NP는 제한되어 있으며 결과는 논란의 여지가 있습니다.

일부 연구에 따르면 ZrO₂ 나노입자는 산화제2철, 이산화티타늄(TiO₂ ) 및 산화아연(ZnO)[3,4,5,6]. 이러한 결과와 일치하여 다른 사람들은 ZrO₂를 보고했습니다. NP는 경미한 [3, 7] 또는 세포독성 효과가 없는 [8,9,10] 유도할 수 있으며, 소수의 연구만이 경미한 세포독성 가능성을 나타냈습니다. 그러나 Stoccoro et al. [11] ZrO₂의 독성 효과를 개발했습니다. NP 및 TiO₂ 나노입자의 코팅 여부에 관계없이 그들은 모든 종류의 나노입자가 서로 다른 정도로 독성 효과를 나타냄을 발견했습니다. 또한 ZrO₂ 이후 다른 연구에서 세포 형태 변화 및 세포 표면의 균열이 관찰되었습니다. 적혈구에서 최대 1mg/mL 농도의 NP 처리[12]. 따라서 이 연구에서는 ZrO₂의 세포독성 효과를 평가했습니다. NP는 생체 내에서 향후 응용 프로그램에 대한 유용한 통찰력을 제공합니다. 한편 TiO₂로 세포를 처리했습니다. 독성 프로필이 잘 개발된 대조군으로 NPs [13].

이전 연구에서는 나노입자가 조직 공학 재료로 널리 사용되었으며 조골세포의 골형성 분화를 개선하는 능력이 있음을 보여주었습니다[14,15,16,17]. 한 보고서에 따르면 실리카(Si) 나노입자는 아마도 Si 나노입자로 인한 뼈 형성으로 인해 생쥐의 노화 관련 뼈 손실을 역전시킬 수 있다고 밝혔습니다[16]. Liu et al. [14]은(Ag) 나노입자/폴리(DL-락트산-코-글리콜산) 코팅된 스테인리스 스틸 합금이 강력한 항균 능력을 가지고 있으며 시험관 내에서 MC3T3-E1 세포의 골아세포 증식 및 성숙을 촉진할 수 있음을 발견했습니다. 더욱이 탄소나노튜브는 뼈의 석회화를 유도하는 것으로 보고되었는데, 이는 세포내 소기관의 크기와 유사한 나노크기의 구조 때문일 가능성이 큽니다[18].

ZrO₂ NP는 생체 적합성과 생체 부식에 대한 저항성 때문에 바이오세라믹 임플란트의 주요 구성 요소로 적용되어 왔습니다[19]. 대부분의 연구는 ZrO₂의 유리한 특성에 초점을 맞추었지만 NP, 생물학적 부작용은 무시할 수 없습니다. 따라서 이 연구에서는 TiO₂를 사용했습니다. , 대조군으로 유사한 물리화학적 특성을 보인 전통적인 나노물질이다. 우리는 TiO₂의 영향을 조사하는 것을 목표로 했습니다. 및 ZrO₂ 공동 배양 후 MC3T3-E1 조골 세포의 세포 생존, 산화 스트레스, 세포 형태 및 골 형성 반응에 대한 NP 및 이에 따른 TiO₂의 골유도성 및 ZrO₂ NP 처리.

자료 및 방법

자료 준비 및 특성화

TiO₂ NP(CAS 번호 637262) 및 ZrO₂ NP(CAS 번호 544760)는 Sigma-Aldrich(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에서 구입했으며 투과 전자 현미경(TEM, MFP-3D-S, Asylum Research, Santa Barbara, CA, USA)으로 특성화되었습니다. , 제타 전위 및 동적 광산란(DLS) 입자 크기 분석 측정(Zetasizer Nano ZS, Malvern, UK). NP는 TEM 검출을 위해 알코올에 분산되어 NP의 형태와 입자 크기를 더 명확하게 보여줄 수 있습니다. 또한, 입자의 응집된 크기는 DLS를 통해 검출되었으며, 여기서 완전한 배양 배지는 세포 배양에 적용된 입자 특성과 일치시키기 위해 사용되었습니다. 세포 처리 전에 스톡 용액을 초음파 세포 분열 시스템(Ningbo Xinzhi Biotechnology, China)으로 30분 동안 얼음 냉각과 함께 분산시키고 세포 실험 전에 완전 배양 배지로 다른 농도로 희석했습니다.

3T3-E1 세포 배양

3T3-E1 세포주(중국 상하이 중국 의과 학회 공공 연구 및 개발을 위한 상하이 인프라 세포 은행)는 최소 필수 배지 알파(α-MEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)에서 배양되었습니다. , USA) 10% 소태아혈청(FBS, Thermo Fisher Scientific, USA) 및 1% 항생제/항진균제(Thermo Fisher Scientific, USA)를 포함합니다. 세포를 5% CO₂와 함께 37°C에서 배양했습니다. 95% 가습 분위기에서 배양 배지를 격일로 교체했습니다.

세포 증식 분석

CCK-8 분석법(Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto city, Japan)을 사용하여 세포 생존율을 검출했습니다. 세포를 96웰 플레이트에 웰당 5000개 세포로 시딩했습니다. TiO₂ NP 및 ZrO₂ 그런 다음 NP를 96웰 플레이트에 0, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 150μg/mL의 연속 농도로 첨가한 다음 37°C에서 5% CO<하위>2 , N과 함께 -아세틸-1-시스테인(NAC) 여부, 이는 ROS 생성을 억제하는 데 사용되었습니다. 대조군은 치료를 받지 않은 채로 두었다. 그런 다음 각 웰에 110μL 검출 시약을 추가하여 CCK-8 테스트를 수행한 다음 96웰 플레이트를 37°C에서 추가로 2시간 동안 인큐베이션했습니다. NP가 이 분석 분석을 방해하는 것을 방지하기 위해 96웰 플레이트에서 테스트할 시약을 2시간 반응 시간 후에 새로운 96웰 플레이트로 옮겼습니다. 침착된 NP 및 세포는 1차 플레이트에 남겨두었다. 각 웰의 광학 밀도(OD)는 마이크로플레이트 리더(SpectraMax M5, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 450nm의 단일 파장에서 측정되었습니다. 각 처리는 6회 반복 수행되었습니다.

유세포분석에 의한 Annexin V 세포자멸사 분석

세포는 컨플루언시를 위해 30,000개 세포/웰의 밀도로 12-웰 플레이트에서 배양되었습니다. TiO₂ 이후 NP 및 ZrO₂ 48시간 동안 NP 처리하고, 세포를 PBS로 세척하고 EDTA 유리 트립신 완충액을 사용하여 수집했습니다. 세포를 25,000개 세포/mL 농도의 PBS 완충액으로 재현탁하고 1000xg에서 원심분리했습니다. . 그런 다음 빛에 노출되지 않고 상온에서 FITC Annexin V와 PI(Invitrogen™, USA)로 세포를 염색하였다. 마지막으로 세포를 400μL의 결합 완충액과 혼합하고 유세포 분석기로 즉시 분석했습니다(BD FACSAria III, BD, Franklin Lakes, NJ, USA).

ROS 생성 분석

세포 내 ROS의 형성은 Reactive Oxygen Species Assay Kit(Beyotime, Shanghai, China)를 사용하여 결정되었습니다. 간단히 말해서, PBS로 세척한 후, 세포를 2mL 배양 배지에서 20,000개 세포/웰로 6웰 플레이트에 시딩하고 TiO₂로 처리했습니다. NP 및 ZrO₂ 48시간 동안 0, 10, 50, 100μg/mL 농도의 NP, NAC 포함 여부 TiO₂ 처리 후 NP 및 ZrO₂ NP, 세포를 수집하고 37°C 및 5% CO₂에서 30분 동안 10μM DCFH-DA와 함께 인큐베이션했습니다. . 형광 강도는 BD FACSAria III(BD, Franklin Lakes, NJ, USA)에서 분석되었습니다.

공초점 현미경

많은 비율의 세포가 apoptosis 상태로 전환되었기 때문에 우리는 연구에서 세포의 세포 골격 구조 변화를 관찰하기 위한 시점으로 24시간을 선택했습니다. 3T3-E1 세포를 유리 커버슬립에 파종하고 TiO₂ 존재하에서 배양했습니다. NP 및 ZrO₂ 24시간 동안의 NP 세포를 PBS 완충액으로 3회 처리한 후 즉시 세척하고 4% 파라포름알데히드로 고정하고 0.1% Triton X-100으로 투과화시킨 후 5% BSA를 함유하는 PBS로 차단하였다. 그런 다음, 세포를 4°C에서 밤새 α-tubulin(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, 1:4000)에 대해 인큐베이션하고 다음 날 1시간 동안 37°C에서 FITC 결합 이차 항체를 로딩했습니다. PBS로 3회 세척한다. 결과적으로 세포골격은 암실에서 1시간 동안 rhodamine-phalloidin(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA, 1:1000)으로 염색되었고, 핵은 Hoechst 33342(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 20분 동안 염색되었습니다. Coverslip은 FV10i 공초점 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 검사했습니다.

광물화 유도 감지

3T3-E1 세포를 6웰 플레이트에 15,000개 세포/웰의 밀도로 시딩했습니다. 세포는 TiO₂로 처리되었습니다. NP 및 ZrO₂ 10 및 100μg/mL 농도의 NP 및 나노물질을 포함하는 배양 배지는 격일로 교체되었습니다. 모든 배양 배지를 교체하기 전에 세포를 PBS를 통해 부드럽게 세척하여 잔류 나노물질을 제거했습니다. TiO₂ 존재하에서 7, 14, 21일 동안 배양한 후 NP 및 ZrO₂ NPs, 세포는 alizarin red S로 염색되었습니다. 간단히 말해서, 세포를 4°C에서 30분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정하고 주변 온도에서 alizarin red S 용액(40mM, pH 4.1)으로 추가로 20분 동안 염색했습니다. 증류수로 3회 세척한 후 광학현미경(Olympus, Japan)으로 광물성 결절을 관찰하였다.

RNA 추출 및 RT-PCR

총 RNA는 TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 통해 추출되었습니다. 그 후, 자외선 분광 광도계를 이용하여 RNA 농도를 평가하였다. 분리된 RNA는 RT 시약 키트(TaKaRa Bio, Dalian, China)를 사용하여 cDNA로 역전사되었습니다. Real-time PCR은 SYBR 녹색 시약(TaKaRa Bio, Dalian, China)을 사용하여 수행했습니다. 런트 관련 전사 인자 2(RUNX2), 콜라겐 1α1(Col1α1), 알칼리 포스파타제(ALP), 오스테오폰틴(OPN), 오스테오칼신(OC), 골 시알로프로테인(BSP)을 포함한 골형성 관련 유전자가 검출되었습니다. 데이터는 2^-ΔΔ 를 사용하여 분석되었습니다. CT 방법. 사용된 프라이머는 표 1에 나열되어 있습니다.

통계 분석

결과는 평균 ± SEM으로 표시되었습니다. 모든 데이터는 ANOVA 테스트에 의해 통계적으로 분석되었습니다. 분산의 동질성 검정을 수행하였으며, 등분산을 가정할 때와 동질성이 없을 때 Bonferroni와 Dunnett의 T3 검정을 각각 사용하였다. 피 0.05 미만의 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

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결과

TiO의 특성₂ 및 ZrO₂ NP

우리는 먼저 TiO₂를 특성화했습니다. NP 및 ZrO₂ 투과 전자 현미경(TEM) 및 동적 광산란(DLS)을 통한 NP 분말(그림 1a, b, 표 2). TEM 및 SEM 이미지는 입자 모양과 크기를 나타냅니다. TiO₂ NP는 평균 크기가 25.4 ± 2.8nm인 작은 막대 모양의 구체였습니다. ZrO₂ NP는 평균 크기가 31.9 ± 1.9nm인 작은 막대 모양의 구체였습니다. TiO₂의 크기를 측정하려면 NP 및 ZrO₂ 용액의 NP, DLS가 사용되었으며 TiO₂ 입자 NP 및 ZrO₂ NP는 각각 81.2nm 및 93.1nm로 확장되어 응집 효과를 나타냅니다. TiO₂의 제타 전위 NP 및 ZrO₂ NP는 각각 32.9 ± 5.4mV 및 42.4 ± 7.4mV였습니다.

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TiO₂의 특성 및 ZrO₂ NP. TiO₂ (아 ) 및 ZrO₂ (b ) TEM을 사용하여 NP 형태 및 크기를 검출했습니다. (ㄷ ) TiO₂ 후 3T3 세포와 나노물질의 공동 배양 상황 관찰 및 ZrO₂ 10, 50, 100μg/mL의 NP 처리 농도. (d ) TEM 결과는 TiO₂ 후에 얻어졌습니다. 및 ZrO₂ 1시간 동안 NP 처리

그런 다음 TiO₂ 후 3T3 세포의 사진을 관찰했습니다. NP 및 ZrO₂ 다양한 농도에서 NP 노출. 우리는 NP가 세포에 고르게 분포되거나 주변에 퍼지는 것을 발견했습니다. NP는 마이크로스케일에서 관찰된 NP의 작은 부분으로 인해 고농도에서 강력한 응집 능력을 보인 반면, 많은 양의 NP는 나노 스케일로 작았고 아마도 보기 힘든 세포로 전위되었을 것입니다(그림 1c). 또한 TiO₂ 후 세포의 TEM 결과 및 ZrO₂ 1시간 동안의 NP 처리를 얻었습니다. 우리의 데이터는 NP가 세포 소포로 전위될 수 있음을 보여주었다. 한편, 미토콘드리아 팽창 및 액포 발생과 같은 일부 소기관 손상도 관찰됩니다.

TiO₂ 및 ZrO₂ 3T3-E1 세포에서 NP 유발 독성 효과

TiO₂ 후 세포 생존력을 평가했습니다. NP 및 ZrO₂ 일련의 농도(10, 20, 40, 60, 80, 100, 150μg/mL)의 NP 처리. TiO₂의 경우 NP(그림 2a)는 배양 24시간 후 TiO₂ NP는 더 낮은 용량(≤ 20μg/mL)에서 무독성인 반면, 더 높은 농도(> 20μg/mL)에서는 세포 생존력의 명백한 감소가 관찰되었습니다(p <0.001). 배양 48시간 후에 20μg/mL 처리 그룹에서 세포 생존력의 더 극적인 감소가 관찰되었습니다. TiO₂ 20μg/mL 농도의 NP는 세포 생존력 감소를 유도합니다(p <0.01). 또한 더 높은 용량의 TiO₂ NP(> 20μg/mL)는 48시간(p <0.001). 그러나 10μg/mL의 TiO₂로 처리했을 때 세포 생존율은 안정적으로 유지되었습니다. 48시간 동안의 NP 또한 ZrO₂의 경우 NP(그림 2b), TiO₂와 비교할 때 유사한 결과가 관찰되었습니다. NP; 48시간 동안 150μg/mL 농도에서 더 높은 독성 효과가 관찰되었으며, 여기서 세포 생존율은 50% 미만으로 감소했습니다. 이 결과는 TiO₂ 및 ZrO₂ NP는 더 낮은 용량에서 생체적합성이었습니다. 그러나 이 두 나노물질은 높은 독성 농도에서 약간의 세포독성을 보였다.

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TiO₂ 및 ZrO₂ 3T3-E1 세포에서 NP-유도된 세포 생존율 감소. 3T3-E1 세포는 TiO₂로 처리되었습니다. (아 ) 및 ZrO₂ (b ) 24시간 및 48시간 동안 0, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 150μg/mL 농도의 NP를 처리한 다음 CCK-8 분석을 통해 세포 생존력을 검출했습니다. 한편, NAC 처리 후 세포 생존력 변화가 감지되어 세포 내 ROS를 제거할 수 있었습니다. 결과는 평균 ± SEM을 나타냅니다. *p <0.05; **p <0.01; ***p <0.001, 대조군과 비교

TiO에 대한 NAC 억제 효과₂ 및 ZrO₂ 나노입자 유도 세포독성

그런 다음 ROS 소거제인 NAC의 억제 효과를 확인했습니다. 결과는 NAC가 잠재적으로 TiO₂를 억제함을 보여주었습니다. (그림 2a) 및 ZrO₂ NP(그림 2b)는 24시간 및 48시간 처리 후 세포 생존을 유도했습니다. NAC 억제 후 모든 농도의 TiO₂에서 24시간 동안 세포 생존이 유지되었습니다. 및 ZrO₂ 최고 농도(150μg/mL)를 제외한 NP 처리. 고농도의 TiO₂를 처리한 세포에서 억제 효과가 약간 감소했지만 (100 및 150μg/mL) 및 ZrO₂ 48시간 시점에서 NP(80, 100 및 150μg/mL), 80μg/mL 미만 농도에서는 강력한 세포 생존력 변화가 관찰되지 않았으며, 여기서 세포 생존력은 NAC가 없는 경우보다 훨씬 더 높았습니다.

TiO₂ 및 ZrO₂ 3T3-E1 세포에서 NP로 유도된 ROS 생성

TiO₂ 이후에 ROS 생성을 추가로 감지했습니다. 및 ZrO₂ 3T3-E1 세포에서 NP 노출(그림 3). 우리의 결과는 TiO₂ 및 ZrO₂ NP는 24시간 후 ROS 생성을 유도했으며, 이는 100μg/mL 농도에서 가장 유의미했습니다. TiO₂에 대한 중요한 ROS 생성이 없었습니다. 10μg/mL 농도의 NP, ZrO₂ NP는 동일한 농도에서 강력한 ROS 생성을 유도했습니다. 한편, NAC는 TiO₂를 상당히 억제할 수 있습니다. 및 ZrO₂ 모든 농도에서 3T3-E1 세포에서 NP 유도 ROS 생성.

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TiO₂ 및 ZrO₂ 3T3-E1 세포에서 NP 유도 ROS 생성. 3T3-E1 세포는 TiO₂로 처리되었습니다. 및 ZrO₂ 48시간 동안 다양한 농도의 NP와 NAC(10mM)를 동시에 배양한 다음 3T3-E1 세포에서 ROS 수준을 검출했습니다. 결과는 평균 ± SEM을 나타냅니다. *p <0.05; **p <0.01; ***p <0.001, 대조군과 비교

TiO₂ 및 ZrO₂ 3T3-E1 세포에서 NP로 유도된 세포자멸사 및 괴사

다양한 농도의 TiO₂ 후 세포 사멸 및 괴사가 감지되었습니다. 및 ZrO₂ 48시간에 NP 노출(그림 4). 3사분면에 위치한 빨간 점들은 정상 세포를 나타내고, 1사분면과 4사분면에 위치한 빨간 점들은 각각 초기 세포사멸 세포와 후기 세포사멸 또는 괴사 세포를 나타냅니다. 흥미롭게도 우리의 결과는 TiO₂ 및 ZrO₂ NP는 농도 및 시간 의존적 방식으로 세포자멸사를 유도할 수 있습니다. TiO₂에 이어 48시간 동안 NP 노출, 10μg/mL 농도에서 유의미한 세포 사멸이 감지되지 않았습니다. 그러나 50 및 100μg/mL 농도에서 후기 세포자살 또는 괴사 세포의 비율이 높은 수준에 도달했습니다. ZrO₂ 따라가기 48시간 동안 NP 노출, 10μg/mL 농도에서도 세포 사멸을 발견하지 못했지만 후기 세포자살 또는 괴사 세포의 비율은 50μg/mL 그룹에서 43.7%였습니다. 가장 흥미롭게도 48시간 처리 후 100μg/mL 농도에서 유의한 조기 세포자멸사(34.1%)가 관찰되었습니다. 우리는 TiO₂의 초기 세포자살 수준이 NP는 ZrO₂보다 상당히 높았습니다. NP; 그러나 후기 apoptotic 또는 necrotic 수준은 verse에 있었습니다.

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TiO₂ 및 ZrO₂ 3T3-E1 세포에서 NP-유도된 세포자멸사. 아 3T3-E1 세포를 TiO₂로 처리한 후 및 ZrO₂ 48시간 동안 다양한 농도의 NP에서 세포 사멸 수준이 감지되었습니다. ㄴ Early apoptosis와 late apoptosis를 포함한 apoptosis 수준을 계산한 후 통계를 수행하였다. 결과는 평균 ± SEM을 나타냅니다. *p <0.05; **p <0.01; ***p <0.001, 대조군과 비교

TiO₂ 및 ZrO₂ 3T3-E1 세포의 NP 유도 형태 변화

TiO₂ 노출 후 3T3-E1 세포의 형태학적 변화 연구 및 ZrO₂ NPs, 우리는 형광 염색 후 공초점 현미경 검사를 수행했습니다(그림 5 및 6). 미처리 대조군 세포와 비교하여 10μg/mL의 TiO₂ 후 형태적 변화가 없었습니다. 및 ZrO₂ 24시간에 NP 처리, 100μg/mL의 TiO₂ 후에 세포가 둥글고 작아지는 동안 및 ZrO₂ NP 처리. 가장 흥미롭게도 50μg/mL의 TiO₂ 후에 약간의 세포 면적 감소가 관찰되었습니다. 및 ZrO₂ NP 처리, 여기서 TiO₂ 더 강력한 세포 면적 감소를 보였다. 일관되게, 정량적 결과는 100μg/mL의 TiO₂ 후 세포 면적의 상당한 감소를 확인했습니다. 및 ZrO₂ NP 처리(그림 5).

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TiO₂ 및 ZrO₂ 3T3-E1 세포에서 NP 유도 세포 면적 변화. 3T3-E1 세포를 TiO₂로 처리한 후 (아 ) 및 ZrO₂ (b ) 24시간 동안 10 및 100μg/mL 농도의 NP, 세포에 튜불린(녹색), 액틴(빨간색) 및 Hoechst 33342(파란색)가 로드되었습니다. 액틴(적색)과 튜불린계(녹색)의 변화에 따라 세포 형태를 관찰하고, 세포 면적 분포 변화를 계산하였다

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TiO₂ 및 ZrO₂ 3T3 세포에서 NP-유도된 세포골격 변화. 3T3-E1 세포를 TiO₂로 처리한 후 (아 ) 및 ZrO₂ (b ) 24시간 동안 10 및 100μg/mL 농도의 NP, 액틴(빨간색) 및 튜불린 시스템(녹색)의 변경을 기반으로 세포골격 변화를 평가했습니다.

우리는 액틴 필라멘트와 미세소관 수준 모두에서 세포골격 변화를 추가로 연구했습니다(그림 6). 유사하게, 대조군과 10μg/mL의 TiO₂ 간에는 유의한 차이가 나타나지 않았습니다. 및 ZrO₂ NP 처리 및 두 그룹의 세포는 액틴 필라멘트와 미세소관 시스템의 명백한 구조를 드러냈습니다. 대조적으로, 100μg/mL의 ZrO₂ NP 처리는 pyknosis와 같은 핵 및 응축된 불분명한 액틴 필라멘트 및 미세소관 구조와 함께 3T3-E1 세포의 수축을 유도했습니다. TiO₂의 경우 NPs는 많은 액틴 점이 관찰되었고 세포막에 위치한 액틴 필라멘트는 안개가 자욱하고 거칠었습니다. ZrO₂용 NPs, 더 강력한 세포골격 파괴가 감지되었으며 액틴 및 미세소관 구조가 거칠고 결함이 있습니다.

TiO₂ 및 ZrO₂ 3T3 세포에서 NP 유도 광물화

다음으로 우리는 alizarin red 염색을 통해 3T3 세포의 광물화 상태를 확인하고 광학현미경으로 광물화된 결절의 형성을 관찰했습니다(그림 7). 다양한 농도의 TiO₂ 존재 하에 7일, 14일 및 21일 동안 골형성 유도 후 세포를 염색했습니다. 및 ZrO₂ NP. 우리는 유도 14일과 21일 후에 광물화된 결절이 눈에 띄게 된 것을 발견했습니다. 대조군과 TiO₂ 사이에 유도 14일 및 21일 후 광물화에 큰 차이가 없었습니다. 및 ZrO₂ 10μg/mL의 NP 처리 그러나 TiO₂ 후에 광물화의 감소가 관찰되었을 것입니다. 및 ZrO₂ 100μg/mL의 NP 처리, 작아지고 흐릿해진 광물성 결절로 인해

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TiO₂ 및 ZrO₂ 3T3 세포에서 NP 유도 광물화 효과. 3T3-E1 세포가 TiO₂와 함께 7일, 14일 및 21일 동안 광물화된 용액을 사용하여 분화된 후 (아 ) 및 ZrO₂ NP(b ) 다양한 농도에서. alizarin red 염색을 사용하여 광물성 결절(검은색 화살표)을 검출했습니다.

TiO₂ 및 ZrO₂ 3T3 세포에서 골형성 관련 유전자의 NP 유도 발현

TiO₂의 메커니즘을 조사하기 위해 및 ZrO₂ 3T3 세포에서 NP 유도 골형성, TiO₂ 후 3T3 세포에서 골형성 관련 유전자의 수준을 검출했습니다. 및 ZrO₂ 초기에 우선적으로 상향조절되는 유전자를 포함한 NP 처리(Runx2 , Col1α1 , 및 알프 ) 및 늦은(개방 , 10월 , 및 Bsp ) 골형성 단계(그림 8). 10μg/mL의 TiO₂ 및 ZrO₂ NP는 Runx2의 최고 발현 수준을 유도했습니다. 치료 3일 후, 7일째에 Runx ZrO₂ 이후 최저 수준으로 감소 100μg/mL의 NP 처리 Col1α1 TiO₂ 10μg/mL 후 증가 및 ZrO₂ 3일과 7일에 NP 처리, 100μg/mL의 TiO₂로 처리된 세포의 경우 및 ZrO₂ NP, Col1α1 처음에는 3일째에 크게 상향 조절되었지만 7일 후에는 급격히 감소했습니다. 우리는 또한 Alp의 상당한 감소를 감지했습니다. TiO₂ 이후의 표현 및 ZrO₂ 3일 동안 100μg/mL의 NP 처리

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TiO₂ 및 ZrO₂ NP-유도된 골형성 관련 유전자는 3T3 세포에서 변화합니다. 3T3-E1 세포를 TiO₂와 함께 3, 7, 14 및 21일 동안 광물화된 용액을 사용하여 분화한 후 및 ZrO₂ 다양한 농도의 NP. 골형성 관련 유전자 변화는 RT-PCR을 사용하여 감지되었습니다. 결과는 세 가지 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 나타냅니다. *p <0.05; **p <0.01; ***p <0.001, 대조군과 비교

골형성 유도 후기에 상향조절된 유전자의 경우 Opn , 10월 , 및 Bsp TiO₂ 10μg/mL 후 크게 증가 및 ZrO₂ 14일 동안 NP 치료 및 개방 21일째에 더 높은 수준으로 지속적으로 상향 조절되었습니다. 이러한 결과는 Ocn 및 Bsp , 열기 TiO₂의 후기 단계 마커였습니다. 및 ZrO₂ NP 유도 골형성. 흥미롭게도 100μg/mL의 TiO₂ 및 ZrO₂ NP가 Opn의 표현을 향상시키지 못했습니다. , 10월 , 또는 Bsp 14일째; 게다가, 이들 유전자는 21일째에 유의한 하향조절을 보였다.

토론

ZrO₂ 나노입자는 내화물, 세라믹 및 임플란트, 관절 관내인공삽입물 및 치과용 재료를 포함한 생체 의료 기기의 중요한 구성 요소였습니다. 지금까지 TiO₂ NP는 유사한 물리화학적 특성을 갖는 다른 NP 중 하나로, 많은 연구에서 독성 데이터에 초점을 맞추었습니다. 그들은 TiO₂ NP는 세포 내로 이동할 수 있고 다른 물리화학적 특성으로 인해 잠재적인 세포 손상을 보였다[20, 21]. 한편, ZrO2 나노입자에 대한 독성학적 데이터는 부족했다. 우리 연구에서는 TiO₂를 고려했습니다. NP를 대조군으로 하여 TiO₂의 독성 효과를 조사했습니다. 및 ZrO₂ 3T3-E1 세포의 NP. 나노입자의 물리화학적 특성, 특히 크기와 형태는 생물안전성에 효과적으로 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다. 일부 연구에서는 나노크기 입자가 마이크로크기 입자보다 훨씬 더 독성이 강한 것으로 나타났습니다[22, 23]. 대부분의 경우 입자 형태도 독성에 영향을 미치는 것으로 보고되었습니다[24,25,26]. 우리 연구에서 TiO₂ 및 ZrO₂ NP는 막대 모양의 구체였습니다. 이전 보고서 [5, 27, 28]와 비교하여 TiO₂ 및 ZrO₂ NP는 입자 크기가 81.2 및 93.1nm로 확대된 물에서 상대적으로 약한 응집 효과를 나타냈지만 농도 의존적으로 나노입자 노출 후 배양 배지에서 일부 마이크로스케일 물질을 관찰할 수 있어 본 연구에서도 응집 효과를 확인했습니다. 초음파 분산 기술을 사용한 후. 그러나 응집 효과는 세포내 소포에서 강력한 NP가 검출되었기 때문에 NP가 세포질로 이동하는 것을 억제할 수 없었다. 미토콘드리아와 같은 세포 소기관이 아마도 하나의 주요 표적이었을 것입니다.

다양한 농도의 TiO₂에서 3T3-E1 세포의 생존 가능성을 감지했습니다. 및 ZrO₂ NP 처리. 우리의 결과는 10μg/mL의 TiO₂ 및 ZrO₂ NP는 3T3-E1 세포에 대한 생물학적 안전성 농도입니다. 세포 생존율은 시간 및 농도 의존적으로 감소하여 TiO₂ 및 ZrO₂ 나노입자는 이산화규소 및 ZnO와 같은 다른 산화물 금속 나노입자에 비해 더 높은 용량에 장기간 노출된 후 잠재적으로 세포독성을 나타냈습니다[4, 28, 29]. 또한 ZrO₂ NPs showed more potent toxic effects than TiO₂ NPs in our study at high toxic concentrations.

Oxidative stress, a byproduct of outpaced ROS generation and decreased antioxidant factors, is known as one crucial factor in nanomaterial-induced cytotoxicity, and it is reported to trigger cell apoptosis through distinct mechanism [30, 31]. Furthermore, Kozelskaya et al. [12] observed that ZrO₂ NPs induced the increase of membrane microviscosity, cell morphology changes, and surface cracks on the red blood cells due to the oxidative stress. In agreement with these studies, we detected the ROS levels in 3T3-E1 cells after TiO₂ and ZrO₂ NP treatment and found that TiO₂ and ZrO₂ NPs could induce significant ROS generation in concentration-dependent manners, and ZrO₂ NPs induced more potent oxidative stress effects. Moreover, the elevated ROS levels could be eliminated by NAC which is a ROS scavenger. These results suggested the important role of ROS in TiO₂ and ZrO₂ NP-induced cell cytotoxicity.

Apoptosis is a type of cell death which clears the senescent and abnormal cells, so as to sustain the cell biological functions [32]. Some studies have reported that apoptosis was one of the main toxic responses after treating with oxide metal nanomaterials, such as TiO₂ , ZnO, Si, and Ag [33,34,35,36]. In our study, we found that TiO₂ and ZrO₂ NPs could induce apoptotic/necrotic body formation in 3T3-E1 cells in time/concentration-dependent manners, which was correlated with the decreased cell viability shown previously. Moreover, we found that when large parts of late apoptotic or necrotic cells were observed after ZrO₂ NP treatment, the cell status for TiO₂ NPs largely was early apoptosis. These phenomena applied that ZrO₂ NPs induced more rapid and potent apoptosis effects. Similarly, other studies also showed that ZrO₂ NPs induced significant apoptotic and necrotic processes in MSTO cells [4, 11].

The cytoskeleton metabolism is a dynamic biological process involving polymerization and depolymerization, which could sustain cell morphology and promote cell function. Some studies have shown that nanomaterials could affect the cell morphology and cytoskeleton system [37,38,39]. We found 3T3-E1 cells became smaller and rounded in the high-dose group of TiO₂ and ZrO₂ NPs (100 μg/mL), along with decreased cell area due to cytoskeleton disruptions. These findings were also supported by previous reports that ZrO₂ NP treatment could induce cell morphology changes in MSTO cells at higher concentration [4]. Another study showed the disrupted blood cell morphology after ZrO₂ NP treatment [12].

Alizarin red staining is a key indicator of osteogenic responses. In our study, no impact on osteogenic induction has been shown by TiO₂ and ZrO₂ NP treatment (10 μg/mL), except that cells treated with a cytotoxic dose of TiO₂ and ZrO₂ NPs (100 μg/mL) had a significant decrease of mineralized nodules due to the potential inhibition of osteoinductive properties. In addition, the expression level of osteogenesis-related genes was important biomarkers. Our results showed that lower concentration (10 μg/mL) of TiO₂ and ZrO₂ NPs promoted the expression of osteogenesis-related genes; however, TiO₂ and ZrO₂ NPs at high concentrations (100 μg/mL) could significantly inhibit gene expression for both early- and late phases of mineralization, indicating that TiO₂ and ZrO₂ NPs at high concentrations indeed inhibited osteoinductive properties. Other studies also obtained similar results; they claimed that TiO₂ NPs inhibited the osteogenesis of osteoblasts in a size-dependent manner while potentially promoted osteoclastogenic process [33]. Sengstock et al. [40] found that sub-toxic concentrations of Ag NPs and Ag ions could significantly impair the osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. More ongoing or newly initiated researches are focused on developing nanoparticles with acceptable biosafety and osteogenic potential to promote osseointegration for in vivo application [18, 41].

Conclusion

In conclusion, our data indicated that ZrO₂ NPs were nanoparticles with good biocompatibility, just like TiO₂ NPs, while they could induce toxic effects at high toxic concentrations on 3T3-E1 cells. ROS played a key role on TiO₂ and ZrO₂ NP-induced cytotoxicity, including cell viability, apoptosis and necrosis, and changes in cell morphology. Moreover, TiO₂ and ZrO2 NPs at high concentrations showed inhibitory effects on osteogenic differentiation of 3T3-E1 cells. Our findings could provide deep insights into the biocompatibility and potential application of ZrO2 NPs.