하이드록시아파타이트 나노입자, 내피세포 매개로 MSC 골형성 촉진
요약
나노 하이드록시아파타이트(nano-HA)는 재생의학 분야에서 큰 주목을 받아왔습니다. 내피세포(EC)-중간엽줄기세포(MSC) 상호작용은 골 재생에 필수적이지만, 나노-HA가 이 과정에서 어떻게 작용하는지는 불분명합니다. 본 연구에서는 EC 매개 간접 공배양 모델을 이용해 하이드록시아파타이트 나노입자(HANPs)의 세포독성과 골유도 효과를 MSC에서 조사하고 기전을 규명했습니다. 아세포독성 용량에서 HANPs는 MSC 생존율, 골아세포 유전자 발현, 광물화 결절 및 알칼리 포스파타제 생성을 증가시켰습니다. 이러한 현상은 EC가 분비한 HIF-1α에 의존하며, 이는 ERK1/2 신호 전달 캐스케이드를 촉발했습니다. 또한 2단계 세포 계통 수학적 모델을 수립해 HIF-1α가 MSC 골형성 분화에 미치는 영향을 정량 분석했습니다. 모델은 HIF-1α가 1500 pg/mL까지 용량 의존적으로 MSC 골형성 분화율을 자극함을 보여주며, 이는 위 실험 결과와 일치합니다. 데이터는 HANPs, EC, MSC 간 협력적 상호작용이 골 재생을 자극할 가능성을 시사합니다. 또한 2단계 세포 계통 모델은 골 조직공학에서 효과 분자의 잠재적 영향을 평가하는 유용한 in vitro 시스템입니다.
서론
외상, 선천 기형, 수술적 절제로 인한 골 결손 재건은 정형외과에 큰 도전입니다. 대표적 생체활성 세라믹인 하이드록시아파타이트(HA)는 골 대체재로 사용되어 왔으나, 바람직하지 않은 기계적·골유도 특성이 임상 적용을 제한합니다. 최근 나노-HA는 독특한 생체모방 특성으로 더 우수한 생체활성과 향상된 기계적 성능을 보여 재생의학 관련 생물의학 분야에서 큰 관심을 끌고 있습니다. 나노-HA가 골 결손에 이식되면 골 복구에 관여하는 다양한 세포가 이에 노출됩니다. 따라서 나노-HA의 생물학적 거동 평가가 필요합니다. 여러 증거가 HA 나노입자(HANPs)가 인간 제대 와튼 젤리 유래 중간엽줄기세포(hWJ-MSCs)와 골아세포에 섭취돼 골형성 분화를 촉진함을 직접 입증했습니다. Dua 등은 HANPs가 공학적 연골의 신생 연골 통합을 촉진함을 보고한 반면, HANPs가 인간 제대정맥 내피세포(HUVECs) 혈관신생 능력을 억제함도 보고되었습니다. 인간 건강 측면에서 나노-HA의 골 재생 영향에 대한 더 포괄적 이해가 필요하며, 공학적 나노 기반 인공 뼈의 지속적 적용은 이러한 연구의 시급성을 더합니다.
골 재생은 필연적으로 신생 혈관 침투를 동반합니다. EC는 혈관계 내벽 세포로 혈액 수동 전달뿐 아니라 장기 재생 유도, 특정화, 유도, 항상성 및 대사 유지 역할도 합니다. MSC는 주위내피 틈새의 일부로 특정 생리·생화학적 미세환경 하에서 자기갱신 및 다중분화 능력을 가집니다. Tsai 등은 EC가 엔도텔린-1을 분비해 MSC를 골·연골 계통 분화로 유도함을 발견했습니다. 또한 Saleh 등은 마이크로어레이 데이터 분석으로 HUVEC 분비 단백질과 관련 크로스토크 신호전달 경로를 식별해 MSC 막수용체와 상호작용해 증식과 골형성 분화를 촉진함을 보였습니다. 골 조직공학에서 HANPs는 신생 혈관과 접촉하고 EC에 의해 내포될 수 있으며, 이는 이들 세포 생리 기능을 변화시킵니다. 이는 주변 골전구세포에도 영향을 미쳐 파라크린 신호 변화를 통해 골 복구에 영향을 줄 수 있습니다. HANPs의 MSC 직접 영향은 탐구됐으나, HANPs가 EC를 통해 MSC 골형성 분화를 간접 유도할 수 있는지 여부는 여전히 불분명하며, 이는 골 복구에서 HANPs 효과 이해에 필수적입니다.
본 연구에서는 HANPs가 EC와 MSC 상호작용에 미치는 생물학적 효과를 더 깊이 이해하기 위해 HUVECs와 hWJ-MSCs를 이용한 간접 공배양 모델을 수립했습니다. 이 시스템으로 HUVEC 매개 파라크린 신호전달을 통한 HANPs의 hWJ-MSCs 세포독성 및 골유도 효과를 평가했습니다. HANPs로 자극된 HUVECs 상청액 내 용해성 인자를 평가해 HANP 유도 EC-MSC 상호작용에 영향을 주는 핵심 인자를 유전자 및 단백질 수준에서 규명했습니다. 결과는 저산소증 유도 인자(HIF)-1α가 이 상호작용에서 결정적 역할을 함을 보여주었습니다.
HIF-1α가 골형성 과정에 미치는 영향을 정량 관찰하고 예측하기 위해 HIF-1α와 결합된 2단계 세포 계통 수학적 모델을 수립했습니다. 여기에서 경험적 데이터 분석을 통해 정의된 초기 세포 파종 밀도와 HIF-1α 농도 기반으로 임의 시점의 MSC 수와 분화도를 예측하는 데 2단계 세포 계통 모델을 사용했으며, 이는 초기 배양 조건과 배양 시간 제안에 도움을 줄 수 있습니다. 본 연구 결과는 나노 기반 골 대체재와 생물계 간 상호작용을 밝혀 재생의학용 혁신적 생체소재 개발을 촉진할 것입니다.
재료 및 방법
입자 제조 및 특성 분석
20 nm(np20), 20×80 nm(np80) HANPs와 ≥99.0% 순도의 미세 HA 입자(m-HAP)를 Nanjing Emperor Nano Material Company Ltd(중국 난징)에서 구입했습니다. 입자 크기와 모양은 투과전자현미경(TEM; FEI Tecnai G2 Spirit Bio-Twin, FEI, 미국)과 주사전자현미경(SEM; LEO1530VP, 독일)으로 관찰했습니다. HA 입자(HAPs)의 동역학적 크기와 제타 전위는 Zetasizer Nano ZS90과 Mastersizer 3000(Malvern Instruments, 영국)으로 측정했습니다.
세포 제조 및 배양
모든 실험 프로토콜은 난징의대 윤리위원회 승인을 받았습니다. HUVECs와 hWJ-MSCs는 기증자 서면 동의 후 신선한 제대에서 채취했습니다(기존 방법 참조). 제대와 제대정맥을 1% 페니실린-스트렙토마이신(PS; Hyclone, GE Healthcare, 오스트리아) 함유 인산완충생리식염수(PBS)로 세척했습니다. 제대정맥을 0.1% 콜라게나아제 I(Sigma, 미국)로 채워 37 °C에서 15분 배양했습니다. 수집 후 HUVECs를 EC 배지(ECM; Sciencell, 미국)에서 배양했습니다.
이후 혈관을 제거하고 와튼 젤리를 1 mm² 조각으로 잘라 25 cm² 조직 배양 플라스크(Corning, 미국)에 놓았습니다. 이 세포들을 10% 태아우혈청(GIBCO)과 1% PS 첨가 L-DMEM(GIBCO Life Technology, 미국)에서 배양했습니다.
hWJ-MSCs는 CD13, CD29, CD34, CD44, CD45, CD51, CD105 단일클론항체(BD Biosciences, 미국)로 표현형 확인했습니다. HUVECs는 폰 빌레브란트 인자(vWF; Shanghai ChangDao Biotech, 중국)로 확인했습니다. 3~7회 계대 HUVECs와 3~5회 계대 hWJ-MSCs를 실험에 사용했습니다.
입자 현탁액을 PBS에서 1 mg/mL로 만든 후 L-DMEM으로 희석해 최종 농도 조절. 도 1과 같이 HUVECs를 표시된 HAPs 농도에서 18시간 배양했습니다. 배양 배지를 4 °C에서 15,000 rpm, 15분 원심분리해 상청액을 10% FBS 보충 후 hWJ-MSCs용 조절 배지(CM)로 사용했습니다. CM은 골형성 유도액(10 mM β-글리세로포스페이트, 50 μg/mL L-아스코르브산-2-인산, 0.1 μM 덱사메타손; Sigma-Aldrich, 미국) 보충 골형성 배지로 구성했습니다. 또한 2-메톡시에스트라디올(2-MeOE2; Selleck Chemicals, 미국)을 특정 HIF-1α 억제제로, PD98059를 특정 MEK 억제제로 사용했습니다. 2-MeOE2(+) 그룹에서는 HAP 첨가 전 HUVECs를 5 μM 2-MeOE2로 40분 전처리한 CM으로 hWJ-MSCs를 배양했습니다. PD98059 그룹에서는 5 μM PD98059 함유 CM으로 hWJ-MSCs를 배양했습니다.
세포 생존율 및 수 측정
세포 생존율은 MTS Assay Kit(MTS; Bestbio, Beyotime Biotechnology, 중국)로 평가했습니다. hWJ-MSCs를 24시간 부착시킨 후 CM으로 24시간과 72시간 배양했습니다. 포르마잔 흡광도를 490 nm에서 마이크로플레이트 리더(SpectraMax M2; Molecular Devices, 미국)로 측정했습니다. 흡광도를 동일 조건 표준 보정곡선으로 세포 수로 변환했습니다.
정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)
TRIzol 시약(Invitrogen, 미국)으로 CM에서 배양된 hWJ-MSCs 세포에서 총 RNA 분리. 1.0 µg RNA에서 PrimeScript First Strand cDNA Synthesis kit(TaKaRa, 일본)로 상보적 DNA 전사. 지정된 유전자 발현 수준을 FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) kit(Roche, 스위스)로 7900HT Fast 실시간 증폭 시스템(Applied Biosystems, 미국)에서 분석. 표적 유전자 상대적 mRNA 발현을 GAPDH로 정규화 후 2-ΔΔCt 법으로 결정. 표적 유전자 프라이머 서열은 표 1에 정리.
알리자린 레드 S(ARS) 염색 및 정량 분석
hWJ-MSCs를 12웰 플레이트에서 골형성 배지로 최대 14일 배양 후 세포외 기질 광물화 관찰. 시료를 무수 에탄올로 15분 고정 후 1%(w/v) ARS(pH 4.2) 상온 5분 염색. 염색 세포를 이중 증류수로 2회 세척 후 촬영. 광물화 과정 정량 분석을 위해 10%(w/v) 세틸피리디늄 클로라이드 일수화물(BOMEI, 중국) 300 μL을 각 웰에 첨가해 30분 배양. 각 시료 90 μL을 96웰 플레이트로 옮겨 405 nm에서 흡광도 측정(삼중).
알칼리 포스파타제(ALP) 염색 및 정량 분석
hWJ-MSCs를 12웰 플레이트에서 골형성 배지로 최대 14일 배양 후 ALP 염색 수행(BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit; Beyotime). 4% 파라포름알데히드로 고정 후 니트로블루 테트라졸륨과 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-포스페이트 혼합물로 4시간 염색 후 촬영. ALP 합성 정량화를 위해 세포를 얼음 RIPA lysis buffer(Beyotime)로 30분 용해. 세포 용해액을 4 °C에서 12,000 rpm, 10분 원심분리 후 상청액을 ALP Assay kit(Beyotime)로 정량 분석. 405 nm에서 삼중 측정 흡광도를 표준곡선으로 ALP 활성 변환.
효소결합면역흡착분석(ELISA)
HUVECs를 2 × 10⁵ cells/well로 파종. HAPs로 18시간 배양한 HUVECs에서 CM 수집(추가 파일 1), 상청액을 ELISA 분석(도 1). 인간 HIF-1α ELISA kit(Anhui Joyee Biotechnics, 중국) 사용.
면역형광
HUVECs를 12웰 플레이트 슬라이드(7.6 × 10⁴ cells/well)에 파종. CM 18시간 노출 후 4% 파라포름알데히드(Biosharp, 중국)로 고정, 0.1% 트리톤 X-100(Beyotime) PBS로 투과화 후 1% 항-HIF-1α 항체[EPR16897](ab179483, Abcam, 영국)로 4 ℃ overnight 배양. 이후 1% CoraLite594-접합 Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(Proteintech, 미국)로 암실 1시간 배양. 핵을 DAPI(Beyotime, 중국)로 30초 염색. 레이저 공초점 현미경(Olympus, 일본)으로 관찰. ImageJ v1.4(NIH, 미국)로 형광 강도 정량화.
웨스턴 블롯 분석
hWJ-MSCs를 CM에서 24시간(ERK1/2, p-ERK1/2) 또는 골형성 배지에서 7일(RUNX-2, COL I) 배양. 세포를 RIPA lysis buffer로 30분 용해. 원심분리 후 상청액 -20 °C 보관. 12% SDS-PAGE 후 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막으로 전이. 1차 항체: anti-p-ERK1/2, anti-ERK1/2, anti-RUNX-2, anti-COL I, GAPDH(1:1000, 토끼 폴리클로날; Cell Signaling Technology, 미국). 비결합 항체 제거 후 2차 항체 1시간 배양. 화학발광 젤 이미징 시스템(LAS4000M; GE Healthcare, 스웨덴)으로 신호 검출. ImageJ v1.4로 p-ERK/ERK 비율, RUNX-2/COL I/GAPDH 정량화.
세포 아폽토시스 평가
hWJ-MSCs를 6웰 플레이트 10⁵ cells/well 밀도로 파종. 부착 세포를 표시된 HIF-1α 농도와 시간 처리. FITC-Annexin V와 PI(Fcmacs, 중국)로 15분 암실 표지. FACScan 유세포분석기(BD Bioscience, 미국)로 분석. FlowJo v10(BD Biosciences)로 데이터 분석.
2단계 세포 계통 모델
HAPs의 엄청난 잠재력과 공배양 시스템 분석 난이도를 고려해, HIF-1α가 hWJ-MSCs 골형성 분화에서 하는 역할을 이해하기 위한 정량 분석과 신뢰할 수 있는 예측이 가능한 수학적 모델이 필요했습니다.
hWJ-MSCs를 0, 300, 500, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000 pg/mL HIF-1α와 골형성 유도액으로 배양. 이 농도들에서 데이터 피팅 후, 대조군, m-HAP, np80, np20 그룹에서 HUVECs가 생성한 HIF-1α 농도(각각 240, 300, 325, 375 pg/mL)로 MATLAB(MathWorks, 미국)에서 피팅 방정식 검증. 모델 단순화를 위해 서로 다른 HIF-1α 농도에서 유사한 성장 패턴을 동일시했습니다. 평균 분화도를 사용해 분화도-시간 방정식 피팅. hWJ-MSCs의 증식률, 아폽토시스율, 골형성 분화도를 정해진 시점에서 측정했습니다.
실험 데이터에 기반해 다단계 세포 계통 모델과 유사한 단순화된 2단계 세포 계통 모델을 수립했습니다. C0와 C1은 각각 hWJ-MSCs와 말단 세포 수를 나타냅니다. C0와 C1은 다음으로 지배됩니다:
dC0/dt = [(K - C0 - C1)/K × p - (p - 1)]υ0C0
dC1/dt = (2 - (K - C0 - C1)/K × p - p)υ0C0 - AC1
여기서 p는 HIF-1α와 시간에 영향받는 hWJ-MSCs 복제 확률. d = 1 - p는 분화율로 추정 및 실험 세포 수 데이터 피팅으로 얻음. υ0은 각 계통 단계에서 세포 분열 속도(υ = ln2/c, c=세포 주기 지속시간). 말단 세포 아폽토시스율은 A로 표시. 단순화를 위해 아폽토시스율이 시간에 따라 약간 변하는 것 무시, A = 4.5% 상수. K는 환경 수용력(세포 무한 증식 불가). HIF-1α는 hWJ-MSCs 분화율 증가시켜 분화율을 다음과 같이 모델링:
d = d0 / (1 + (r×H)m)
p = 1 - d
여기서 H는 HIF-1α 농도, d0는 0 pg/mL HIF-1α에서 분화율, r은 조절 강도(HIF-1α가 MSCs에 미치는 조절 강도), m은 힐 계수(MSC 분화율과 HIF-1α 농도 관계).
통계 분석
정규성과 등분산성 만족 데이터는 3회 이상 독립 실험 평균 ± 표준편차(SD)로 표현. SPSS 24.0(SPSS Inc., 미국)으로 일원분산분석(ANOVA) 또는 이원분산분석(TWO-WAY ANOVA) 수행. P < 0.05 통계적 유의. GraphPad Prism 5(GraphPad Software, 미국)로 통계 분석 제시.
결과
HAPs 특성 분석
도 2와 같이 HAPs는 특정 크기와 모양으로 제조됐습니다. 구형에 가까운 np20 직경 평균 20 nm, np80은 막대형으로 평균 길이 80 nm, 폭 20 nm. m-HAPs도 구형에 가까우며 약 12 μm 직경. 모든 입자는 L-DMEM에서 음성 표면 전하. 제타 전위 음성 값이 골세포 부착·증식, 직접적 골 결합, 신생 골 형성에 유의미한 긍정적 효과가 있음이 제안됨. 입자들은 L-DMEM에서 관찰 시 수용액에서 응집 경향. 동역학적 크기도 테스트했으며 생물학적 거동에 중요한 인자일 수 있음.
HAPs의 hWJ-MSCs 간접 독성
HAPs의 hWJ-MSCs 간접 독성 평가를 위해 MTS assay로 세포 생존율 측정. 50 µg/mL HANPs 함유 CM은 24시간과 72시간 후 hWJ-MSCs 생존율을 유의미하게 자극, 특히 24시간에 두드러짐. 그러나 100 µg/mL HANPs 함유 CM은 72시간 후 대조군 대비 15~20% 생존율 감소. 또한 25 µg/mL np20 함유 CM은 24시간 후 생존율 자극했으나 np80은 그렇지 않음. 이 현상들로 50 µg/mL HANPs가 아세포독성 농도로 확인돼 후속 모든 실험에 사용(도 3).
HAPs의 hWJ-MSCs 간접 골유도 효과
HANPs의 hWJ-MSCs 간접 골유도 효과 확인 위해 정량 RT-PCR로 골형성 유전자 발현 평가. RUNX-2 전사 수준이 HANP 그룹들, 특히 np20에서 7일부터 21일까지 현저히 증가(도 4a). 제1형 콜라겐(Col I) 유전자 발현은 np20 그룹에서 7~21일 증가, np80 그룹에서 7~14일 지속 증가(도 4b). 골칼신(OCN) mRNA가 HANP 그룹들에서 14일 명확히 상향조절돼 골형성 가속화 나타냄(도 4c). 알칼리 포스파타제(ALP) mRNA 수준이 HANP 그룹들에서 명백히 증가해 hWJ-MSCs 골형성 분화 나타냄(도 4d). 그러나 m-HAP 그룹은 대조군 대비 이 세 골형성 유전자 수준에서 제한적 변화만 보임(도 4). 또한 다능성 마커 NANOG, OCT3/4, SOX2 발현이 HANP 그룹들에서 대조군 대비 감소해 HANP 그룹 hWJ-MSCs가 분화했음, 특히 np20 그룹에서 뚜렷함을 시사(도 4e-g). 웨스턴 블롯 분석에서도 유사 결과(도 5c, d)로 np20 그룹이 hWJ-MSCs에서 RUNX-2와 COL I 발현을 간접적으로 향상시킬 수 있음을 확인.
HANPs의 hWJ-MSCs 간접 골유도 효과 시각적 관찰 위해 지시된 골형성 배지로 14일 배양 후 ARS, ALP 염색 수행. 도 5a, b에서 HANP 그룹들이 m-HAP, 대조군 대비 광물화 결절 수 증가와 hWJ-MSCs ALP 활성 증가 보임. m-HAP는 대조군과 유사하게 hWJ-MSCs 골형성 분화에 제한적 효과만 보임.
HUVECs와 간접 공배양한 hWJ-MSCs에서 HAPs에 의한 ERK1/2 신호 활성화
HAPs에 의한 HUVECs 파라크린 기능 효과 조사 위해 면역형광과 ELISA로 hWJ-MSCs 골형성 분화 촉진 가능 단백질 식별. 도 6a-c에서 세포내외 HIF-1α 생성이 HANPs(특히 np20)에 의해 유의미하게 촉진됨, m-HAP는 제한적 효과만 보임.
HIF-1α에 의해 활성화된 hWJ-MSCs 분화 신호전달 경로 더 정확히 이해 위해 웨스턴 블롯으로 ERK1/2 경로 핵심 조절 인자 검사. 도 6d, e에서 총 ERK1/2 단백질 수준은 변화 없으나 p-ERK1/2 수준이 HANPs 배양 hWJ-MSCs에서 뚜렷이 증가, 특히 np20 그룹. m-HAP는 HUVECs HIF-1α 생성에 대한 효과와 유사하게 hWJ-MSCs p-ERK1/2 수준에 거의 영향 없음. 중요하게, HIF-1α에 의해 활성화된 hWJ-MSCs p-ERK1/2 증가가 특정 HIF-1α 억제제 2-MeOE2로 차단돼 HIF-1α가 hWJ-MSCs에서 ERK1/2 신호전달 경로 상류에 작용함 입증.
HIF-1α가 ERK1/2 경로 통해 hWJ-MSCs 골형성 분화 촉진
HIF-1α가 관찰된 hWJ-MSCs 골형성 분화 자극에 필요한지 확인 위해 특정 HIF-1α 억제제(2-MeOE2) 적용. 도 7에서 2-MeOE2(+) 처리 그룹 hWJ-MSCs의 골형성 배양 시 광물화 기질 침착과 ALP 활성이 약화돼 HIF-1α가 hWJ-MSCs 골형성 분화에 필수적임 나타냄. 이 결과 바탕으로 HIF-1α에 의해 활성화된 hWJ-MSCs 골형성 분화에서 ERK1/2 경로 역할 추가 탐구. 특정 MEK 억제제 PD98059 투여 후 골형성 배양 hWJ-MSCs에서 광물화 기질 침착과 ALP 활성 억제됨.
2단계 세포 계통 모델
HIF 농도와 hWJ-MSCs 골형성 분화 내재적 연결 정량 규명 위해 0~4000 pg/mL HIF-1α로 8개 그룹 hWJ-MSCs 처리. 2단계 세포 계통 수학 모델로 이 hWJ-MSCs의 증식, 아폽토시스, 골형성 분화율 분석. 도 8a에서 피팅 데이터로 시뮬레이션 공식(d/d0 = 1/(0.14H² - 0.43H + 1))과 곡선(파란 곡선) 얻음. 분화율이 HIF 농도 증가에 따라 처음 증가하다 감소함 보임. 구체적으로 1500 pg/mL HIF-1α에서 분화율 피크.
본 연구에서 HUVECs가 대조군, m-HAP, np80, np20 그룹에서 생성한 HIF-1α 농도는 각각 240, 300, 325, 375 pg/mL. 검은 사각형은 240, 300, 325, 375 pg/mL HIF-1α가 촉진한 분화율로 시뮬레이션 곡선과 잘 일치. 또한 서로 다른 HIF-1α 농도 처리 hWJ-MSCs 분화도(상대적 ALP 활성)가 시간과 함께 유사하게 증가. 따라서 모델 단순화를 위해 성장 패턴을 유사/동일시. 0일부터 7일까지 ALP 활성 증가가 골아세포 수에 비례하고, 골아세포 수가 평탄기에 도달함 발견. 따라서 ALP 활성을 상대적 골아세포 수 곡선(골아세포 수/최대 골아세포 수)으로 피팅해 최대 ALP 활성 예측, 상대적 ALP 활성(ALP 활성/최대 ALP 활성)으로 분화도 획득(도 8b). 이 두 연구 결합해 시간과 HIF-1α에 따른 분화도 변화 3차원 표면 얻음(도 8c).
최적 배양 시간 추정 위해 세포 수 시뮬레이션 필요. 서로 다른 HIF-1α 농도에서 분화율 규명 후 각 집단 크기 시뮬레이션. 96웰 플레이트 웰당 1500 cells 초기 파종 밀도로 서로 다른 HIF-1α 농도 사용해 시뮬레이션. 도 8d-f에서 실험 데이터(검은 사각형)가 시뮬레이션 총 세포 수(파란 곡선, hWJ-MSCs + 골아세포 수 합)와 잘 일치해 이 모델이 임의 시점 hWJ-MSCs와 골아세포 수 예측 능력 입증. 또한 골아세포 수가 0, 375, 1500 pg/mL HIF-1α에서 각각 21, 18, 15일 평탄기 도달. 이 모델은 조직공학 지침용 최적 배양 시간 제공, HIF-1α가 hWJ-MSCs 골형성 분화 가속화 직접 증거 제공.
고찰
최근 나노생체소재 발전으로 나노 기반 인공 골 대체재가 집중 연구 대상. 축적된 증거는 나노생체소재가 세포막 투과와 내부 잔류 시간 증가 능력으로 세포와 복잡한 상호작용 가짐 시사. 이전 연구에서 콜라겐/알긴산 나노필름이 MSC 막에 흡착돼 세포내 신호전달 캐스케이드 활성화, 골형성 분화 촉진함 보고. Wu 동료들의 우아한 실험은 TiO₂ 나노튜브가 EC-MSC 상호작용 통해 파라크린 효과와 세포 접합 촉진으로 혈관신생과 골형성 분화 개선함 입증. 우수한 골 조직공학 후보 개발 위해 나노 기반 골 대체재와 골 복구 연관 세포 간 직접 크로스토크뿐 아니라 간접 상호작용 규명 필요. 그러나 현재 이해는 여전히 제한적. 본 연구에서는 간접 공배양 모델로 EC 매개 HANPs의 MSCs 생물학적 효과 추가 규명.
세포독성은 나노생체소재 생체적합성 평가 주요 이슈. 이전 연구에서 HANPs가 hWJ-MSCs 생존율이나 아폽토시스에 직접 영향 없음 발견했으나, 다른 세포 매개로 다른 영향 줄 수 있음. 따라서 HUVECs 매개 HANPs의 hWJ-MSCs 세포독성 효과 평가 필요. 흥미롭게도 CM 24시간, 72시간 배양 후 hWJ-MSCs 생존율이 0~50 µg/mL HANP 그룹들, 특히 np20 그룹에서 유지 및 증가해 CM 내 효과 분자 존재 시사. HANPs 농도 100 µg/mL 도달 시 hWJ-MSCs에 세포독성. 그러나 0~100 µg/mL m-HAP는 hWJ-MSCs 생존율에 영향 없음(도 3). Jiang 등은 특정 크기 공학적 나노입자가 구별되는 내포 경로와 동역학으로 표적 세포 기능 조절 관련 하류 신호전달 변화시킬 수 있음 보임. 이전 연구에서 np20, np80이 HUVECs에 내포돼 형태 변화와 큰 소포 출현으로 HUVECs 활성화 상태 나타남 보임. np20이 더 빠른 섭취 속도와 증가된 축적으로 HUVECs 더 강한 활성화 유도 가능, 파라크린 신호전달로 hWJ-MSCs 생존율 증가 가능성. 반면 적은 m-HAP만 HUVECs에 내포돼 hWJ-MSCs 대사 영향 제한적일 수 있음.
활성화된 HUVECs 잠재적 골유도 효과 추가 탐구 위해 아세포독성 용량 50 µg/mL HAPs 후속 연구 사용. 활성화된 HUVECs 수집 CM이 hWJ-MSCs에서 세포외 칼슘 침착, ALP 활성, 골형성 단백질 발현, 골형성 유전자 mRNA 발현 촉진(도 4, 5). 골아세포 계통 특정화 필수 전사인자 Runx2가 np20 그룹에서 실질적 향상 보여 hWJ-MSCs 강한 골유도 효과 나타냄(도 4a, 5c, d). np20 그룹에서 COLI 발현이 7일 1.5배, 14일 2배 개선돼 HANP 처리 그룹에 추가 분화 골아세포 존재 시사(도 4b). OCN은 성숙 골 마커로 HANP 그룹들에서 14일 유의미 증가해 np20, np80이 m-HAP 대비 골 성숙 가속화 나타냄(도 4c). ALP는 골아세포 분화 초기 마커로 각 그룹에서 배양 시간 따라 명백히 증가, 특히 np20 그룹에서 추가적 MSC→골아세포 전환 나타냄(도 4d). 다능성 마커 NANOG, OCT3/4, SOX2는 분화 능력 의미. 도 4e-g에서 HAP 그룹들 유전자 발현 감소로 HAP 그룹 대부분 hWJ-MSCs가 골아세포로 전환됨 암시.
데이터는 HUVECs에 의한 HANPs 내포가 hWJ-MSCs 골형성 분화 개선과 연관됨 입증. 그러나 이 결과 원인은 현재 불분명. HUVECs 파라크린 기능 측면에서 활성화된 HUVECs 상청액 내 용해성 분화 유도 단백질에 초점. HIF-1α 신호전달은 골 재생 중 골화와 혈관신생 결합에 필수적. Heikal 등은 손상된 EC가 정상산소 조건에서도 더 많은 HIF-1α 분비함 보고. HANPs 노출이 HUVECs 혈관신생 능력 억제함도 보임. 따라서 CM 내 HIF-1α 농도 측정, 결과 HANP 처리 그룹들에서 m-HAP, 대조군 대비 HIF-1α 함량 증가(도 6a). hWJ-MSCs 골형성 분화에서 HIF-1α 역할 확인 위해 특정 HIF-1α 억제제 2-MeOE2 사용. 감소된 HIF-1α 농도가 이 hWJ-MSCs에서 광물화 기질 침착과 ALP 활성 손상과 병행돼 HANPs가 HUVECs HIF-1α 생성을 촉진해 hWJ-MSCs 골형성 촉진함 나타냄(도 7).
HANPs를 골 조직공학용으로 적절히 적용하기 위해 HUVECs 매개 hWJ-MSCs 골형성 분화 촉진 기전 추가 이해 필요. ERK1/2 경로는 HIF-1α 하류에 있으며 MSC 분화에 근본적. 본 연구에서 CM 내 HIF-1α 농도가 hWJ-MSCs p-ERK1/2 수준과 잘 일치(도 6b, c). 2-MeOE2 적용 시 hWJ-MSCs p-ERK1/2 발현 활성화 실패로 HIF-1α가 ERK1/2 신호전달 상류 작용함 입증. hWJ-MSCs 골형성 분화에서 ERK1/2 신호전달 역할 직접 다루기 위해 특정 MEK 억제제 PD98059 사용. ERK1/2 신호전달 억제 시 hWJ-MSCs 골형성 분화 최저치. 발생 가능 이유: ERK1/2 경로가 HIF-1α 신호전달과 아폽토시스/증식 신호전달 경로 핵심 역할로 관찰된 골형성 분화 변화 책임질 수 있음. 또한 혈관내피성장인자(VEGF) 존재와 관련될 수 있음. VEGF는 HIF-1α 신호전달 하류 효과자 중 하나며, ERK1/2 경로 활성화로 MSC 골형성 분화 촉진 가능. 이전 연구에서 np20이 HUVECs VEGF 생성 유도함 발견. 따라서 ERK1/2 경로 억제가 VEGF 억제 결과, hWJ-MSCs 골형성 분화 감소 유도 가능. 가용 실험 결과 종합: HANPs는 m-HAPs보다 더 최적의 직접적, 간접적 골유도 효과 처리 가능. 자가골 이식편, 동종골 이식편 대비 HANPs 광범위한 공급원, 이차 손상 및 잠재적 면역원성 없음. 그러나 m-HAPs 대비 HANPs는 HUVECs 혈관신생 능력 억제, 시간·용량 의존적 약한 세포독성 나타냄.
최근 HIF-1α가 골 재생에서 중요함 입증 증거 증가. 그러나 특정 초기 조건(HIF-1α 농도 등)에서 MSC 분화율 정량 예측 연구 드묾. 세포 증식, 아폽토시스, 골형성 분화 고려해 HIF-1α와 결합된 2단계 세포 계통 수학 모델 제시, 실험 데이터와 높은 상관관계. 0~4000 pg/mL HIF-1α에서 hWJ-MSCs 분화율 피팅으로 분화율, HIF-1α 농도, 시간 기술 방정식 획득. 도 8d에서 이 모델이 서로 다른 HIF-1α 농도 하 세포 수 맵 묘사 가능해 2단계 시스템 내재 역학 탐구 가능. 또한 이 모델이 HIF-1α가 hWJ-MSCs 골형성 분화에 미치는 효과 수학적으로 검증. 다단계 세포 계통 모델과 로지스틱 모델 기반으로 모델 충분히 안정해 장기 예측 시 인구 무한 폭주 함정 회피.
기존 실험 데이터로 정의된 초기 세포 파종 밀도와 HIF-1α 농도로 세포 수와 분화율 모두 예측 가능. 따라서 최적 배양 시간도 획득. 결과적으로 최적 HIF-1α 농도 예측, 골형성 위해 가장 최적 시간 결정 가능, 효율적 조직공학에 중요. 2단계 세포 계통 모델은 두 세포 계통 가진 줄기세포 증식·분화 예측 적용 가능. 이 기반으로 초기 조건과 기존 실험 데이터 바탕 모델 수립해 in vitro 최적 배양 조건 식별 가능, 이는 in vivo 골 복구 최적화 지원.
결론
본 연구에서 HUVECs 매개 HANPs의 hWJ-MSCs 특이적 생물학적 효과 탐구. m-HAPs 대비 np20, np80 모두 시간·용량 의존적 약한 세포독성 보임. 중요하게 HANPs 크기가 이 세포독성에 유의미한 영향 없음. 데이터는 HANPs, 특히 np20이 HUVECs의 HIF-1α 분비 증가 촉진 가능함 보임. 이는 ERK1/2 경로 활성화를 통해 hWJ-MSCs 골형성 분화 향상과 직접적 상관관계(도 9). 더 주목할 점은 2단계 세포 계통 모델 결과가 HIF-1α가 hWJ-MSCs 골형성 분화율에 용량 의존적 자극 효과 가짐 시사. 또한 초기 조건 기반 in vitro 모델로 최적 HIF-1α 농도와 배양 시간 추정 가능, 향후 조직공학 응용에 귀중할 것. 종합적으로 이 관찰들은 HANPs가 세포-세포 상호작용 조절로 골 재생 개선 가능성 증거 제공.
