Cs_0.33WO₃ 나노입자로 NIR 유도 고열요법 최적화: HepG2 간암 세포 치료

요약

고열요법은 비침습적, 최소한의 부작용 및 독성, 쉬운 구현으로 암 치료에 가장 환자 친화적인 방법 중 하나이며, 광열학적 약물 전달 시스템 같은 새로운 치료법 개발을 촉진했습니다. 본 연구는 Cs_0.33WO₃ 나노입자(NPs)의 광열 효과 변수인 조사 지속시간, 광 파워 밀도, NP 농도가 HepG2 간암 세포주에 미치는 영향을 in vitro에서 조사해 근적외선(NIR) 조사 열선량을 도출했습니다. 구체적으로, 입자 크기 120nm의 NPs를 일련의 산화-환원(REDOX) 반응, 열 어닐링, 습식 분쇄 공정으로 합성했으며, 이후 물리적, 조성적, 광학적, 광열적 특성을 동적 광산란(DLS), 에너지 분산형 X선 분광법(EDS), 주사 및 터널링 전자 현미경(SEM, TEM), X선 회절(XRD), 가시광-근적외선(VIS-NIR) 분광광도법으로 분석했습니다. NPs의 세포독성과 조사 파라미터에 대한 세포독성을 HepG2 세포에서 평가했습니다. 세포를 NPs와 배양해 세포내 섭취 상태를 확인하고, 세포 배양 접시의 배지 온도를 인체 온도인 36.5°C 근처로 유지하면서 광열 선량의 가변 파라미터에 따른 세포 생존율 의존성을 결정했습니다.

서론

2018년 한 해에만 전 세계적으로 암 질환으로 약 1,000만 명이 사망하고 약 1,800만 명의 신규 환자가 발생했습니다[1]. 현재 화학요법, 방사선, 수술적 제거 또는 이 세 가지의 맞춤형 조합으로 치료받은 암 환자의 5년 생존율이 40%를 약간 넘게 개선되었습니다[2,3]. 그러나 화학물질과 이온 폭격의 독성과 유해한 본질은 탈모, 심장독성, 불임, 염색체 이상 등 수많은 부작용을 필연적으로 초래합니다[4,5]. 이러한 생명에 해를 끼치는 결과는 NPs 함유 화합물을 포함한 환자 친화적 치료 의학 개발을 강력히 촉구했습니다.

100nm 이하 크기 규모에서 독특한 물질 시스템, 구조, 모양, 원자 화학양론에 기반한 나노기술은 양자화 현상에 의해 강화된 전례 없는 화학적, 물리적, 생화학적 특성을 산출하며, 이미 생물의학 과학의 많은 분야에서 전임상 및 in vitro 응용을 찾았습니다[6,7]. 화학요법의 단점에도 불구하고, NPs가 전달 운반체 역할을 하면 병든 종양에서 약물 방출의 선택성을 개선하고, 종양 세포의 약물 흡수를 촉진하며, 건강한 조직의 누적 독성을 크게 줄입니다[8,9]. 또한 NP 기반 영상 양식 배열로 생성되는 영상 품질은 더 높은 감도, 더 미세한 공간 분해능, 더 나은 심도 침투로 생체 분포를 드러내고, 약물 흡수를 모니터링하며, 종양을 국소화하고, 치료 효능을 평가하는 데 크게 향상됩니다[10]. 진단 기능 외에도, NPs가 고유한 물리적 특성(예: 고주파(RF) 절제 또는 광열적 고열요법)을 활용할 때, 원하는 위치에 손상을 유도하는 효율을 더욱 높일 수 있습니다[11,12,13]. 이 중 두 번째가 부위별 투여, 낮은 통증, 적은 부작용, 조직 화상 위험 감소로 더 선호됩니다.

현재까지 광조사 시 고열요법을 유도할 수 있는 NP 물질 시스템에는 금(Au), 세슘 텅스테이트(CsWO₃), 산화철, 황화구리, 그래핀, 탄소나노튜브가 있으며, 세포외 또는 세포내 온도를 in situ에서 상승시켜 암세포에 치명적 손상을 가하는 적용 가능성을 입증했습니다[14,15,16,17,18]. NP 강화 RF 절제와 마찬가지로, 광원의 입사 파워 밀도 수준은 임상 안전과 환자 편의에 중요한 문제입니다[11]. 2013년 국제비전리방사선보호위원회(ICNIRP) 발표에 따르면, 400~980nm 가시광 및 NIR 파장 범위에서 인간 피부의 최대 노출 한계는 0.2~0.726 W/cm²입니다[19]. 그러나 이전 in vitro 암세포 연구에서 보고된 대부분의 광 파워 밀도는 피부 조직의 안전 한계를 훨씬 초과했으며, 이는 광조사에 대한 낮은 임계값을 가진 내부 생물 조직 치료 시 심각한 문제가 될 수 있습니다. 예를 들어, 암세포를 효과적으로 파괴하는 금(Au) NPs의 NIR 광 파워 밀도는 10분 이하 조사 시 2~80 W/cm² 범위였습니다[13,14,20,21,22]. 마찬가지로 그래핀 산화물[18], 철 백금(FePt)[23], NaYF₄:Yb,Er 나노결정[24] 등 다양한 물질 시스템도 최소 150 mW/cm² 이상을 필요로 했습니다.

in vitro 실험에 비교적 덜 탐색된 물질인 CsWO₃ NP로 자궁경부암 세포(HeLa)를 NIR 조사로 소멸시키는 몇 연구에서 최소 0.72 W/cm²가 필요하다고 보고했는데[15,25,26], 이는 ICNIRP가 설정한 피부 조직의 NIR 파장 노출 한계 부근이며 장시간 노출 시 건강한 조직에 유해한 영향을 줄 수 있습니다[19]. 또한 과거 연구에서 NP 농도, 광노출 지속시간, 광강도 조합으로 생성된 배양 배지 온도가 40°C를 훨씬 초과해 건강한 인간 세포가 견디기 힘들었고, 암세포 사망률도 상세히 규명되지 않았습니다.

CsWO₃ NP는 800nm에서 2400nm NIR 파장 범위에서 예외적으로 높은 흡수율을 보이며[27] 생물의학 응용에 기능적으로 적합합니다. 암세포 제거에 탁월한 효능을 입증했음에도 불구하고, 세포독성은 여전히 크게 알려지지 않았으며, 피부 조직의 안전 광노출 한계 내에 있는 광 파워 밀도, 짧은 조사 지속시간, 낮은 세포독성 NP 농도의 투여 공식 제공이 여전히 부족합니다.

본 연구는 직경 5.2cm 페트리 접시에서 배양된 HepG2 간암 세포를, 피부 조직의 광노출 한계 내에 있는 광 파워 밀도와 무세포독성 NP 농도를 이용하면서 세포 배양 배지 온도를 정상 인체 온도인 36.5°C로 유지하며 NIR 조사 Cs_0.33WO₃ NP로 소멸시키는 실행 가능성을 in vitro에서 평가하고자 합니다. 구체적으로, 평균 특성 크기 120nm 중심의 Cs_0.33WO₃ NPs를 산화환원 반응, 열 어닐링, 습식 분쇄 공정 시퀀스로 합성하고, 표면 형태, 결정성, 광학적 및 시간적 광열 특성으로 특성화했습니다. 또한 중앙 파장 980nm에서 동작하는 NIR 조사의 조사 지속시간, NP 농도, 광 파워 밀도 등 가변 선량 파라미터의 광열 효과가 HepG2 암세포 생존율에 미치는 영향을 조사하고 판단해 안전 치료 선량 조합을 고안했습니다.

실험 방법

본 연구에서는 인간 원발 종양에서 유래한 102세대 HepG2 간암 세포주를 실험 모델로 배양해, NIR 조사된 자체 제작 Cs_0.33WO₃ NPs에 의한 세포독성과 피부 조직 노출 안전 한계 내 및 무독성 NP 농도에서의 다양한 열선량 치료 효능을 평가했습니다.

Cs_0.33WO₃ NPs 합성

그림 1 좌측 패널은 세슘 텅스텐 산화물(Cs_0.33WO₃) NP 물질 합성 절차의 개략적 흐름도를 보여줍니다. 간단히 말해, 전구체 화학물질인 ((NH₄)₂WO₄)(Alfa Aesar, 99.9% 순도)와 CsCl(Alfa Aesar, 99.9% 순도)을 각각 100mL DI 물에 녹인 후 25°C에서 자석 교반기(250rpm)로 1시간 동안 일정 교반하며 혼합했습니다. 교반 후 혼합 용액 비커 온도를 180°C로 조절해 용액의 수분이 완전히 증발할 때까지 구웠습니다. 그 결과 얻은 건조 백색 분말이 Cs_0.33WO₃ 물질의 최종 전구체입니다. 칠러를 켠 상태에서 전구체 분말을 담은 석영 보트를 고온로 튜브 중앙에 넣고, 튜브 내 압력을 0.08 torr로 낮췄습니다. 이후 전구체를 500°C에서 H₂와 N₂ 가스를 90:10 표준 입방센티미터/분(SCCM) 비율로 유입하며 산화환원 반응을 촉진해 1시간 가열했습니다. 1시간 후 H₂ 가스 유입을 중단하고 N₂ 가스 유량을 100 SCCM으로 조절한 후, 로 온도를 800°C로 올려 1시간 동안 열 어닐링했습니다. 공정 완료 후 칠러와 온도 제어로를 끄고, 석영 보트가 실온으로 냉각될 때까지 기다린 후 로 튜브에서 꺼냈습니다. 석영 보트에서 얻은 짙은 파란색 분말이 미크론(µ) 크기 Cs_0.33WO₃ 분말입니다. 분말 입자의 특성 크기를 더 줄이기 위해, 0.1mm ZrO₂ 비드로 4시간, 0.05mm ZrO₂ 비드로 추가 4시간 동안 나노그라인더 장비(Justnanotech Co., Taiwan)에서 µ분말을 분쇄해 NPs를 생산했습니다. 각 분쇄 공정의 총 지속시간은 4시간을 초과하지 않아 과도한 유체 점도와 물질 물리적 크기의 돌발적 변화를 방지했습니다. 분쇄 공정 후 최종 용액을 0.22μm 공극 필터로 여과해 후속 모든 특성화 및 실험에 사용했습니다. 형광 버전 Cs_0.33WO₃ NPs(fNPs)는 다음 프로토콜로 제작했습니다. 28mg/ml 농도의 플루오레세인 2ml와 1.5mg/ml 농도의 Cs_0.33WO₃ NP 용액 2ml를 비커에 준비해 초음파 셰이커 볼에 넣고 15분간 처리했습니다. 이후 NP 용액과 분산제를 1:1.25 비율로 혼합하고 15분간 초음파 진동했습니다. 결과 용액을 DI 물로 세척하고 10,000rpm으로 15원심분리했으며, 이를 사용 전 2회 반복했습니다.

물질 특성화

이후 Cs_0.33WO₃ NPs의 통계적 특성 크기, 결정 구조, 구조 형태, 윤곽 모양, VIS-NIR 광흡수 등을 제타 전위 분석(ZS90, Malvern, UK), XRD(D2 Phaser, Bruker AXS GmbH, Germany), 내장 EDS를 갖춘 SEM(SU-5000, Hitachi, Japan), TEM(JEM-2100F, JEOL, Japan), 동적 광산란(DLS)(Delsa Nano C, Beckman Coulter, USA), UV-VIS-NIR 분광광도계(V-750, Jasco, Japan)로 각각 수행했습니다. XRD 스펙트럼은 20°~80° 각도 범위에서 분당 4° 속도로 X선을 시편에 조사해 획득했습니다. 시편으로부터의 회절각 의존적 회절 신호를 결정하고, JCPDS 카드 No. 83-1334의 표준 Cs_0.32WO₃ XRD 스펙트럼과 비교했습니다. NP의 광열 특성 시간 의존성을 확인하기 위해 980nm 파장 NIR 레이저와 온도 측정 프로브로 구성된 간단한 실험 장치를 구축해 NIR 조사 용액에 의한 온도 상태를 탐구했습니다. 검사 용액에는 DI 물로 희석한 NP 용액과 세포 배양 배지와의 NP 용액 혼합물이 포함되었습니다. 페트리 접시 내 시료용 광학 빔 직경은 페트리 접시 전체 표면을 덮도록 확장해 0.05 W/cm²의 추정 광 파워 밀도를 생성했으며, 그렇지 않은 경우 2 W/cm²로 유지했습니다. 그림 1 우측 패널에 표시된 광학 장치를 사용해 NIR 조사를 수행했습니다. 광학 시스템의 핵심은 NIR 레이저 빔이 양오목 렌즈를 향해 빔 직경을 4mm에서 5.2cm(페트리 접시 표면 직경과 동일)로 확장하고, 세포 성장을 위한 생리학적 온도인 36.8°C로 설정된 핫플레이트 위에 페트리 접시를 놓았으며, 페트리 접시를 플라스틱 원통형 인클로저로 둘러싸 주변 환경과 배지 온도 평형을 도왔습니다. 추가 파일 1: Fig. S1은 그림 1의 레이저 빔 옆 빨간 화살표로 표시된 빔 조리개 출구에서 측정된 NIR 레이저 빔의 광학 강도 매핑을 보여줍니다. 빔 프로파일은 광학 강도의 3D 분포를 나타내며 페트리 접시 전체 개구부에 걸친 광장의 균일성을 검증합니다.

세포독성 및 광열 분석

세포 배양 주기를 시작하기 위해, 440ml Ham's 영양 혼합물 F-12와 Dulbecco 변형 Eagle 필수 배지(HDMEM), 50ml 태아 소 혈청(FBS), 5ml L-글루타민, 5ml P/S(페니실린-스트렙토마이신)로 구성된 500ml 배지 용액을 0.22μm 공극 크기의 메쉬 필터로 멸균해 준비했습니다. 10cm 또는 5.2cm 직경의 세포 함유 페트리 접시에 각각 8ml, 2ml 배지를 채워 1차 및 아배양용으로 사용하고, 5% CO₂, 37°C 조건의 인큐베이터에서 배양했습니다. 세포 성장 관찰과 배지 갱신은 이틀마다 수행했습니다.

(1) 외부 입력 없는 대조군, (2) 단독 NIR 조사, (3) NPs 배양, (4) NPs 배양 후 NIR 조사 등 세포 분석 사례의 생존율을 얻기 위해 배양 접시의 배지를 흡입 제거하고 0.4ml 트립신을 첨가해 인큐베이터에서 약 10분간 두었습니다. 접시 벽에서 세포 분리가 확인되면, 세포 함유 배지 10μl를 채취해 트립산 블루 용액 10μl와 마이크로원심분리관에 혼합하고, 인산염 완충액(PBS)으로 여러 번 세척해 잔류 부유 NPs를 제거했습니다. 이후 계수판에 염색된 세포 용액 10μl를 주입구로 채워 입체현미경 초점면에서 세포를 관찰하고 수동 카운터로 계수했습니다. 세포 생존율 관련 모든 그림의 각 데이터 포인트는 3회 실험 시험(N=3)의 평균과 표준편차입니다.

NP 세포독성과 세포 생존율에 대한 광열 효과 평가를 위해, 5.2cm 접시의 배지를 제거하고 적절한 양의 NP 용액을 새 배지에 재충전해 2, 1.5, 1, 0.5mg/ml 농도 배열을 만든 후 실험 전 하루 동안 배양했습니다.

광열 분석 전, 세포독성 평가를 수행해 NP 농도 배열에 대한 세포 반응을 조사했습니다. 세포와 NPs 함유 배지를 인큐베이터에서 꺼내 흡입 제거했습니다. 1ml 예열된 PBS로 암세포를 세척하고 내포작용을 거치지 않은 잔류 부유 CsWO₃ NPs를 흡입 제거했으며, 이 절차를 여러 번 반복해 새로운 배지에서 NP 유도 온도 상승으로 인한 잠재적 세포 사망이 없음을 확인했습니다. 광열 처리 후 세포독성 및 광열 분석을 위한 계수 절차를 시행했습니다.

결과

Cs_0.33WO₃ 나노물질의 광학 흡수와 광열 특성은 결정 구조, 어닐링 후 온도, 원자 화학양론, 입자 특성 크기에 크게 의존합니다[28,29].

Cs_0.33WO₃ µ분말의 표면 형태를 특성화하기 위해 10,000배율 SEM 이미지를 획득해 그림 2a 빨간 화살표로 표시된 기둥형 육각형의 상징적 구조를 시각적으로 확인했습니다. 또한 TEM 이미지에서 µ분말 입자의 윤곽 모양과 특성 크기가 약 1μm 이하임을 확인했습니다(그림 2b). NPs의 막대 모양 기하학과 나노급 특성 크기 분포 히스토그램(중심 120nm)도 검증되어 그림 2c와 해당 인셋 TEM 이미지에 제시되었습니다. µ분말과 NPs의 XRD 결정 특성화는 그림 2d에 제시되었습니다. µ분말 XRD 스펙트럼 상단 패널에서 (002), (102), (200), (112), (202), (212), (004), (220), (222), (204), (400), (224)면의 상징적 결정화 평면이 JCPDS 카드 No. 83-1334의 표준 Cs_0.32WO₃ 스펙트럼과 잘 일치함을 관찰할 수 있습니다. µ분말 특성 크기가 120nm로 줄어들면 모든 회절 피크 강도가 단조롭게 감소하고, (102), (220)면 등 강한 NIR 흡수를 나타내는 특성 피크들이 스펙트럼에서 보이지 않게 작아집니다. 마찬가지로 그림 2e의 원자 성분인 세슘(Cs), 텅스텐(W), 산소(O) 식별은 원자 존재를 확인할 뿐만 아니라 Cs 대 W 원자 비율 백분율 0.315가 초기 설계 화학양론과 매우 유사함을 인증합니다.

물질 특성화에 이어 NPs의 광학 흡수 스펙트럼과 시간 경과에 따른 광열 온도 조절을 측정해 그림 3에 제시했습니다. (a, b)에서 NIR 흡광도와 NIR 조사 NP 용액에 의한 온도 상승 프로파일의 NP 농도 의존성을 묘사했는데, 예를 들어 1mg/ml의 시간 경과 온도 플롯이 40°C를 넘어서고 최소 1시간 동안 안정적으로 유지돼 물질의 광열 안정성과 내구성을 확인했습니다. 마찬가지로 그림 3c의 시간 경과 온도 프로파일은 190분 내 5회 반복 주기를 보여주며 NP 물질의 광열 반응성을 검증합니다. 그림 3d에서 인큐베이터에서 꺼내 핫플레이트에 올려 NIR 조사한 배양 배지와 NP 함유 배양 배지의 시간적 온도 프로파일이 10분 동안 약 37°C에서 안정화되고, 순수 NP 용액의 온도가 10분 후 24.6°C에서 33.6°C로 상승합니다. 이로써 NP의 광열 기능성을 고려해 후속 실험에서 NIR 조사를 10분, 30분, 60분 동안 수행했으며, 실험 세션 동안 NPs의 견고성을 유지하고 전임상 연구에 잠재적으로 적용 가능합니다.

이후 NIR 조사 지속시간과 NP 농도 등 무독성 실험 파라미터 선량을 결정하기 위해 50mW/cm²에서 1시간, 2시간 조사하고 0.5, 1, 1.5, 2mg/ml 농도 NPs와 직접 상호작용시켰습니다(그림 4a, b). 2시간 NIR 조사 동안 세포 생존율이 95% 이상으로 유지돼 980nm 광자에 대한 장기 노출에 대한 세포 무독성을 확인했고, 1.5mg/ml 이하가 무독성 NP 농도임을 결정했습니다.

HepG2 세포에 거의 손상 효과가 없는 1.5mg/ml 이하 농도로 투여한 목적은 NP 고유 독성의 함의 없이 암세포에 대한 광열 선량 효과를 조사하기 위함입니다. NIR 조사 NPs가 암세포 제거의 실행 가능한 해결책인지 검토하기 위해, 1.5mg/ml NPs로 하루 배양 후 1시간 NIR 조사를 가했습니다. 그림 5d~f의 밝은 시야(BF) 광학 이미지에서 노출 시간이 1시간(e), 2시간(f) 지속될 때 세포 수가 명확히 줄어듦을 볼 수 있습니다. 정량적으로 생존율은 조사 지속시간이 10분에서 1시간으로 증가함에 따라 84.2%에서 58.4%로 단조롭게 감소하며, 산포 데이터 포인트 사이에 선형 추세선이 잘 맞아 조사 2시간 시 20% 생존율을 예측합니다. 또한 그림 5h에서 1시간 조사 시 광 파워 밀도가 12.5에서 50mW/cm²로 증가함에 따라 생존율이 73%에서 58%로 감소해, NIR 조사 NPs가 암세포 파괴에 광열 트리거로 기능함을 확인했습니다.

또한 이러한 광열 작용이 세포내적 또는 세포외적 방식으로 발생하는지 불확실성을 해소하기 위해 fNPs를 제조해 동일한 세척 및 배양 절차를 수행하고 fNPs의 세포내 존재를 관찰했습니다. 그림 6은 fNPs 배양 유무에 따른 HepG2 세포의 공초점 BF(b, e), 형광(a, d), 중첩 합성(c, f) 이미지입니다. 대조군인 fNPs 미배양 세포는 주로 세포 자가형광에 기인한 무시할 만한 녹색 형광을 보인 반면, 실험군에서는 이미지에서 발견된 모든 세포질 내에 녹색 형광 분포가 편재합니다. 대조군과 실험군 이미지의 평균 형광 강도도 정량화해 그림 6g 히스토그램에 제시했는데, 내포작용된 fNPs 형광이 대조군보다 최소 9배 강했습니다.

논의

전자기파를 이용한 치료적 고열요법 개념은 1900년대 초로 거슬러 올라가 일부 악성 종양 후퇴에 성공했으나, 열 유도 항균제의 유용성과 관심 종양에 대한 정밀한 in situ 접근성 부족으로 쇠퇴했습니다[30]. 1980년대에 이르러 고열요법 치료 후 대사 변화, 종양 미세순환 변화, 산분해 등 암세포에 치명적인 영향을 주는 많은 측면을 발견한 여러 in vitro 연구로 관심이 되살아났습니다[31]. 기전적으로, 적용 온도 >42°C에서 암세포가 괴사하고 세포사멸이 감소하는 직접적 세포독성 외에도, 낮은 냉각 능력과 연관된 혈류 감소 및 낮은 pH(<6.8)가 암세포를 가열에 더 취약하게 만들어 결과적으로 더 높은 세포 사멸률을 초래합니다[32,33]. 그러나 임상적으로는 세기 오래된 부정확한 비특이적 국소화 단점으로 인해 고열요법은 화학요법 또는 방사선요법과 병행할 때만 향상된 치료 효능을 보였습니다[34,35].

정밀 표적화 및 모니터링을 가능하게 하고 표면 전하, 형광, 광열 변환 등 다양한 물리적 특성을 가진 NP 기반 물질은 고열요법 적용의 이러한 부정확함 틈새에 잘 들어맞습니다. 그러나 많은 NIR 조사 NP 물질이 암세포 연구에서 입증된 유용성에도 불구하고, CsWO₃ NPs의 경우처럼 광노출 안전 한계가 잘 검토되지 않는 경우가 많습니다. CsWO₃ NPs는 그림 4b에서 1.5mg/ml에서 상대적으로 낮은 세포독성을 보이며 Ag, Au, 그래핀 등 소수 인기 NP 물질(임계값 ~1μg/ml)[18,36,37]과 비교되지만, 800nm~2400nm 파장 범위에서 강한 NIR 흡수에도 불구하고 HeLa 세포 효과적 파괴에 0.7W/cm²가 필요합니다[15,25,26].

본 연구는 피부 조직의 NIR 노출 한계 내에 있는 NP 농도, 조사 지속시간, 광 파워 밀도 함수로서 in vitro HepG2 암세포용 효과적인 NIR 조사 유도 Cs_0.33WO₃ NP 기반 열선량 공식을 고안하고자 합니다.

실험은 NP 합성으로 시작되며, 산화환원 반응, 어닐링 공정, 습식 분쇄 방법을 포함한 단계별 합성 절차가 그림 1에 개략되어 있습니다. 산화환원 반응은 Cs 같은 큰 삼원소 원소를 WO₆ 팔면체 구조 고리에 적절한 물리적 환경에서 결합시켜 독특한 결정 구조 형성과 자유 전자를 금속 분자 화합물에 결합시키는데, 이는 NIR 흡수 시 강한 광열 변환의 내재적 이유입니다[26,27]. 이후 어닐링과 습식 분쇄 공정은 결정 형성을 정제하고 입자 특성 크기를 줄여 NIR 광열 변환을 추가로 향상시킵니다. 이후 합성된 NP 용액은 일련의 물리적, 물질적 특성화를 거쳐 평균 특성 크기 120nm(중요한 NIR 흡수 최적화)를 검증하고 원자 조성을 인증했습니다(그림 2). 또한 0.5, 1, 1.5mg/ml에 대한 제타 전위 측정값은 각각 -53.2mV, -54.3mV, -60.1mV였습니다. 일반적으로 내포작용이 대부분의 NP 유형 주 진입 경로이며, 비식세포에서 양이온성 및 이온성 NPs 흡수율이 중성 개체보다 높고 전자가 후자보다 우수합니다[38]. 또한 많은 선행 보고에서 음전하 NPs가 비식세포에 덜 독성임을 발견했습니다[39,40], 이는 광열 선량을 위한 과도한 세포내 NP 축적 시 낮은 독성이 고려될 때 유익한 장점입니다.

HepG2 세포 광열 분석을 위한 분위기를 조성하기 위해, NPs의 광열 히터로서 견고성, 주변 환경과 평형 상태에서 포화 온도에서 1시간 이상 장기 안정성, 3시간 내 5회 연속 주기 반복성을 입증했습니다(그림 3b, c). 또한 주변 온도(공칭 25°C) 영향을 배제해 NP 고유 고열요법의 암세포 투여 효과를 정량화하기 위해, 핫플레이트를 37°C로 설정해 모든 세포 분석을 수행하고 순수 배양 배지와 NP 함유 배양 배지의 시간적 광열 특성이 37.1°C를 유지하도록 실험 장치를 보정했습니다(그림 3d). 이후 조사 지속시간과 NP 농도에 대한 세포독성 의존성을 별도로 조사했는데(그림 4), 2시간 이상 NIR 조사와 1.5mg/ml에서 5% 미만의 세포 사멸로, 1.5mg/ml이 치사 농도로 향하는 분기점임을 나타냈습니다. NP 농도를 1.5mg/ml로 고정해(이후 광열 분석 전반에 사용), 의학적 고열요법 열선량을 가변 투여 지속시간과 광 파워 밀도 함수로 정의했습니다. 그림 5는 NIR 조사 0h, 1h, 2h 시행 시 저배율(a~c)과 고배율(d~f)에서 세포 사멸 작용을 보여주며, 세포 수 감소가 그림 5g의 세포 생존율 정량 분석과 잘 일치하고 선형 추세선이 2시간 조사 시 80% 세포 사멸을 예측합니다. 마찬가지로 점진적 광 파워 밀도 증가에 따른 생존율 감소도 그림 5h에 입증되었습니다. 마지막으로 그림 6의 BF, 형광, 중첩 합성 이미지와 형광 분석 히스토그램에서 fNPs 내포작용이 명확히 검증되었습니다.

결론

요약하자면, 본 연구는 Cs_0.33WO₃ NPs 물질 합성 및 특성화, 직접 NPs 상호작용 및 NIR 조사와 별개로 in vitro 세포독성 분석, NPs 내포작용 검증 및 NIR 조사 NPs의 HepG2 암세포 파괴 효능 입증을 제시합니다. 또한 본 연구는 HepG2 암세포용 NIR 조사 Cs_0.33WO₃ NPs 용액의 조합 선량을 제안합니다: NP 농도 1.5mg/ml, 조사 지속시간 30분~1시간, NIR 조사 광 파워 밀도 50mW/cm² 미만으로, 피부 조직 NIR 노출 안전 한계보다 훨씬 낮으면서 암세포 사망률 40%에 근접하며, 환자 친화적 맞춤형 의약품 개발에 잠재적으로 적용 가능합니다. 임상 환경에서의 이러한 연구는 특정 암세포 유형 표면 수용체를 인식하는 분자로 표면 수정 등 추가 조치가 필요할 것입니다.