독소루비신의 초음파 매개 표적 전달을 위한 생체적합성 키토산 나노버블

자료 및 방법

자료

이 연구에서 설명된 NB는 코어로 퍼플루오로프로판(C3F8, R&D Center for Physical and Chemical Engineering of Nuclear Industry, Beijing, China)과 키토산 코팅을 쉘로 사용하여 구성되었습니다. 또한 Epikuron 200(디팔미토일포스파티딜콜린 95% 함유 대두 레시틴, Lukas Meyer, Hamburg, Germany), 에탄올(analytical grade, Hushi, China), 독소루비신 염산염(Sigma-Aldrich, Missouri, USA), 키토산(100~300 ) , Bozhihuili, Qingdao, China) 및 팔미트산(JINDU, Shanghai, China)도 이 연구에서 사용되었습니다. Pluronic F68은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다.

세포주

MCF-7 인간 유방 암종 세포주는 American Type Culture Collection(Rockville, MD, USA)에서 얻었고 10% 열 불활성화 소태아혈청(FBS)이 보충된 Dulbecco의 변형된 이글 배지(DMEM)에서 배양했습니다(Gibco, Carlsbad). , 캘리포니아, 미국). 세포를 37 °C, 5% CO₂에서 배양했습니다. , 그리고 95% 습도. 대수 성장 단계의 세포는 실험을 위해 수확되었습니다.

DOX 로딩 키토산 NB의 준비

우리는 이전에 설명한 방법에 따라 NB를 만들었습니다[18, 19]. DOX-NB의 쉘에는 중분자량 키토산(100~300 kD)이 사용되었고 코어에는 퍼플루오로프로판이 사용되었습니다. DOX-키토산 용액을 제조하기 위해 DOX 적정량을 초순수에 녹이고 DOX 용액 2 ml(1 mg/mL)를 키토산 수용액에 첨가하여 vortex mixer로 5 s 동안 혼합하였다. DOX-키토산 용액을 65 °C에서 1 시간 동안 인큐베이션했습니다. 별도로 팔미트산 수용액에 에피쿠론 200이 함유된 에탄올 용액을 가하였다. 적당량의 초순수를 첨가한 후, 볼텍스 믹서를 이용하여 팔미트산-에피쿠론 200 시스템을 균질화하였다. 이어서, 팔미트산-Epikuron 200 시스템을 1.5mL Eppendorf 튜브(EP 튜브)로 나누고 튜브의 공기를 긴 가는 바늘이 있는 10mL 주사기를 사용하여 퍼플루오로프로판으로 교체했습니다. 각 튜브는 기계식 발진기(Ag and Hg mixer, Xi'an, China)에서 120 초 동안 진동되었습니다. 다음으로, 1.5mL EP 튜브의 모든 액체를 원심분리 튜브에 붓고 얼음 욕조에서 DOX-키토산 용액과 합했습니다. 이어서, 혼합물을 - 4 °C에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, Pluronic F68 수용액(0.01%, w /와 상기 혼합물에 안정화제인 )을 교반하면서 첨가하였다. 그런 다음 투석 정제 단계(한외여과 원심분리기 튜브, Millipore, 30 kDa)를 수행하여 잔류 유리 DOX를 제거했습니다.

NB의 물리적 특성 관찰

DOX-NB의 현탁액은 적절한 양의 PBS(phosphate-buffered saline)를 첨가하여 희석하였다. 그런 다음 DOX-NB의 모양을 관찰하고 × 100 오일 침지 대물 렌즈(OLYMPUS BX41, Olympus Corporation, Japan)가 장착된 형광 현미경으로 이미지화했습니다. 형광 이미지는 형광 현미경(Nikon TE2000-S, Japan)을 사용하여 평가하였다. DOX-NB의 형태는 투과전자현미경(TEM)으로도 관찰되었다(JEOL, Tokyo, Japan). 희석된 나노버블의 수성 현탁액을 Formvar 코팅된 구리 그리드에 분무하고 4% w로 염색했습니다. /v 10 분 동안 우라닐 아세테이트. 그런 다음 샘플을 TEM을 사용하여 시각화하고 이미지화했습니다. DOX-NB의 크기와 표면 제타 전위는 Delsa Nano C 입자 크기 및 제타 전위 분석기(Beckmann Instruments, USA)로 측정되었습니다. 모든 측정은 평균값을 계산하기 위해 세 번 수행되었습니다.

DOX-NB의 안정성

DOX-NB의 크기와 형태는 이러한 나노버블의 안정성을 관찰하기 위해 시간이 지남에 따라 측정되었습니다. DOX-NB의 일부는 4 °C에서 24 시간 또는 48 시간 동안 냉장고에 보관되었습니다. 나머지는 6 시간 동안 실온에서 보관하였다. 25 °C에서 나노버블의 안정성은 동결건조된 인간 혈청(Seronorm™ Human, 노르웨이)에서도 조사되었습니다. 이를 위해 1 ml의 DOX-NBs 수성 현탁액을 1 ml의 혈청에 첨가하고 25 °C에서 6 시간 동안 인큐베이션했습니다. 그런 다음, 모든 DOX-NB는 구조의 무결성을 평가하기 위해 광학 현미경을 사용한 형태 분석으로 측정되었습니다. NB의 크기는 Delsa Nano C 입자 크기 및 제타 전위 분석기(Beckmann Instruments, USA)로 측정되었습니다.

NB의 DOX 로딩 용량 결정

DOX 농도의 표준 곡선은 0.025, 0.05, 0.1 및 0.2 mg/mL 농도의 연속 DOX 희석액을 사용하여 작성하고 UV 분광 광도계(UV-2450, SHIMADZU)를 사용하여 측정했습니다. 이어서, DOX 로딩 효율은 대조군으로 블랭크 NB를 사용하여 480 nm에서 평가되었고, DOX-NB의 DOX 농도는 위에서 설정한 표준 곡선을 기반으로 계산되었습니다. 정제 및 측정 과정에서 DOX의 광분해를 방지하기 위해 모든 절차는 빛을 차단한 상태에서 수행되었습니다. 그 후, DOX-NB의 현탁액을 - 55 °C 및 0.080 mbar 미만에서 동결 건조기로 1.5 일 동안 동결 건조시켰다[20]. 동결 건조된 DOX-NB는 다음과 같이 약물 캡슐화 효율(EE) 측면에서 약물 로딩 용량을 계산하기 위해 칭량되었습니다. EE =A /나 × 100%, 여기서 A NB에 로드된 DOX의 양, B 용액에서 DOX의 초기 양입니다. 실험은 세 번 반복되었습니다.

초음파 매개 DOX 릴리스

DOX-NB에서 DOX의 체외 방출 역학은 37°C에서 투석 백 기술에 의해 초음파(US)의 존재 및 부재하에 결정되었습니다. DOX-NB는 투석막(Spectra/Por, 컷오프 12,000–14,000 Da)에 봉입되었으며, 이를 100 rpm에서 흔들면서 100 ml PBS 용기에 넣었습니다. US 그룹은 테스트 전에 US(VCX400, Sonics and Materials, USA, 전력 밀도, 1.0 W/cm2, 주파수, 20 kHz)에서 40 초 동안 초음파 처리되었습니다[21]. DOX 방출은 최대 24시간 동안 측정되었으며, 각 고정 시간에 1 ml를 빼내고 1 ml의 신선한 PBS로 교체했습니다. 외부 완충액의 DOX 농도는 UV 분광 광도계로 480 nm에서 측정되었습니다. 방출 실험은 3회 수행되었습니다.

체외 초음파 영상(시간-강도 곡선)

초음파에서 DOX-NB의 미국 영상화 및 안정성은 임상 초음파 스캐너 시스템(LOGIQ E9; GE, USA)에서 시험관 내에서 검증되었습니다. 실험은 특정 주파수, 전송 전력 및 초음파 노출 시간으로 수행되었습니다. DOX-NB는 이전에 개발된 방법[19](그림 5a)을 사용하여 초음파 향상을 달성했습니다. DOX-NB의 초음파 영상 안정성은 기계적 지수(MI)가 0.10이고 영상 깊이가 4.5 cm인 초음파 자극에 노출된 후 평가되었습니다. 모든 미국 이미지는 Image J를 사용하여 오프라인으로 분석했습니다. 이어서 LOGIQ E9에 내장된 소프트웨어를 사용하여 이미지 분석을 수행하여 샘플의 그레이 스케일 값을 계산했습니다. 0분부터 15분까지 획득한 60초 클립 각각에 대해 프레임별로 모션 보정을 먼저 수행하여 데시벨 값을 구하였다. 각 데시벨 값은 초음파 조사 전후의 대비 향상의 변화를 반영하기 위해 시간-강도 곡선에 표시되었습니다. 피크 강도와 강화 지속 시간은 시간-강도 곡선으로 표현되었습니다. 분석하는 동안 물 샘플에 해당하는 배경 신호를 빼서 범위 보정 후방 산란 값을 얻었습니다.

빈 NB에 대한 세포독성 분석

빈 키토산 NB의 생물학적 안전성은 Cell Counting Kit-8(CCK-8) 분석 키트(Sigma-Aldrich, USA)를 사용하여 테스트되었습니다. 분석 전에 MCF-7 세포를 2 × 10 ³ 의 밀도로 플레이팅했습니다. 96웰 플레이트의 세포/웰. 세포는 다양한 농도의 키토산 NB 및 초음파 조건에 의해 처리되었다. 키토산 NB의 생물학적 안전성은 0에서 30%까지의 NB의 연속 농도에서 MCF-7 세포를 배양함으로써 평가되었습니다. 저강도 초음파 자극 장비(US10, Cosmogamma Corporation, Italy)를 사용하여 1 MHz의 고정 주파수, 70% 듀티 사이클 및 100 Hz 펄스율로 초음파 자극을 수행하였다. 각 그룹은 다른 조사 시간과 다른 소리 강도로 처리했습니다. 안전을 위해 0.5 W/cm ² 강도의 초음파를 사용했습니다. 또는 1.0 W/cm ² 펄스 길이가 30 또는 60 s인 경우(표 1). 깊이, 주파수 및 기타 초음파 조건은 모든 초음파 실험 동안 일관되게 유지되었습니다[22]. 처리 후, 세포를 추가로 24시간 동안 96웰 플레이트에서 배양하였다. 이어서, 1% FCS를 포함하는 유지 배지를 사용하여 약물 함유 배지를 교체하고, 제조사의 지침에 따라 CCK-8 용액을 플레이트에 첨가하였다. 37°C에서 추가로 2.5시간 동안 배양한 후 각 웰의 분광광도계 흡광도는 450nm 파장에서 마이크로플레이트 판독기(Bio-Rad, USA)를 사용하여 결정되었습니다.

체외 세포내 약물 흡수

DOX의 세포내 흡수는 유세포 분석법(Beckman Coulter, Miami, USA)에 의해 결정되었습니다. 간단히 말해서, MCF-7 세포를 2.5 × 10 ⁵ 의 밀도로 6웰 플레이트에 플레이팅했습니다. 10% FBS가 보충된 DMEM 배지에서 세포/웰. 밤새 배양한 후, 동일한 농도의 DOX-NB 또는 유리 DOX를 함유하는 배양 배지로 배지를 교체하고, 세포를 초음파 처리 또는 없이 처리하였다. 세포 생존율과 높은 초음파 천공 효율을 고려하여 후속 실험에서는 DOX-NBs 농도 20%를 선택하고 초음파 처리는 0.5 W/cm ² 강도로 설정했습니다. 펄스 길이가 30 또는 60 s입니다. 이어서, 1시간 배양 후, 세포 배지를 제거하고, 세포를 신선한 PBS로 3회 세척하여 유리 및 비결합 DOX-NB 또는 DOX를 제거하였다. 그런 다음 세포를 원심분리(5분, 1000rpm)에 의해 수집하고, DOX의 세포내 흡수 전에 PBS 500μL에 재현탁하고, FACSCalibur 유세포 분석기에서 분석했습니다. 분석 시 적색형광 검출을 위해 gate를 임의로 설정하였으며, 각 샘플에 대해 10,000개의 세포를 분석하였다.

시험관 내 MCF-7 세포에 대한 DOX-NB의 효과

CCK-8 분석 및 유세포 분석을 사용하여 DOX 흡수 후 MCF-7 세포 증식 및 세포자멸사에 대한 정량적 평가를 수행했습니다. 간단히 말해서, MCF-7 세포를 플레이팅하고 96웰 플레이트 또는 6웰 플레이트에서 인큐베이션하고 상기 기재된 절차를 사용하여 처리하였다. 증식 분석을 위해 처리된 세포를 37°C에서 24시간 동안 배양한 다음, 2시간 동안 CCK-8 염색을 하고 마이크로플레이트 판독기에서 흡광도를 판독했습니다. DOX-유도 세포자멸사는 Annexin V-APC assay로 다음과 같이 측정하였다:6시간 처리 후 각 well에 0.5μL V-APC (Sungene Biotech, Tianjin, China)를 첨가하여 세포를 염색한 후 유세포분석을 하였다. (Beckman, Coulter, Fullerton, CA, USA)는 세포 사멸 세포를 정량화하는 데 사용되었습니다.

통계 분석

모든 실험은 삼중으로 수행되었고 데이터는 평균으로 표현되었습니다. 통계 분석은 SPSS 버전 18.0을 사용하여 수행되었습니다. p 값 <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

결과

DOX-NB의 물리화학적 특성화

준비된 NB는 구형 형태를 나타냅니다. 도립 현미경에서 NB의 이미징은 불연속적이고 온전한 구형 윤곽선을 보여주었으며(그림 1a), 이는 DOX-NB의 형광 현미경 이미징과 일치했습니다(그림 1b). DOX-NB 솔루션의 대표적인 TEM 이미지는 그림 1c에 나와 있습니다. NB의 물리적 특성은 입자 크기 및 제타 전위 분석기에 의해 결정되었습니다. 그림 2에서 볼 수 있듯이 DOX-NB의 평균 직경은 641 nm, P.I. 0.256. DOX-NB의 제타 전위는 + 67.12 ± 2.1 mV로 서로 반발할 정도로 충분히 높아 NB 응집을 방지하고 장기간 안정성을 지원합니다.

광학현미경으로 관찰한 NB(배율 × 1000) (a ) 및 DOX 로드 NB의 형광 현미경 이미지(b ) 및 DOX 로드 NB의 TEM 이미지(c )

DOX 로드 NB의 크기 분포

DOX-NB의 안정성 및 약물 로딩 효율성

DOX-NB는 4 °C에서 48 h 동안 현탁액에서 안정했습니다. 실온에서 보관한 후 DOX-NB의 크기는 PBS와 인간 혈청 모두에서 약간 더 큰 것으로 나타났습니다(그림 3). DOX-NB의 최종 로딩 용량은 64.12 mg DOX/g DOX-NB로 54.18%의 EE에 해당합니다.

DOX-NB의 광학 이미지 a 실온에서 b PBS에서 25 °C에서 6 시간 후 및 c 혈청 내 25 °C에서 6 시간 후

DOX-NB의 시험관 내 DOX 출시

그림 4는 초음파 처리가 DOX 방출에 미치는 영향을 평가하기 위해 미국 치료의 유무에 관계없이 PBS에서 DOX-NB로부터 DOX의 시험관 내 방출 프로필을 보여줍니다. DOX-NB에서 방출되는 DOX의 양은 미국 그룹과 비미국 그룹 간에 크게 다릅니다. 5 시간 후, 미국 그룹의 DOX-NB는 캡슐화된 DOX의 46.45%를 방출했으며 비미국 그룹의 DOX-NB는 9.3%만 방출했습니다. 미국 이외의 그룹은 24 시간 후에 19.4%의 DOX만을 방출했습니다. 대조적으로, DOX의 거의 80%가 미국 그룹에서 배출되었습니다. 결과는 미국 조사가 캐비테이션 효과로 인해 DOX-NB에서 DOX 방출을 촉진할 수 있음을 시사했습니다.

초음파 조사(2 kHz, 1.0 W/cm ² )가 있거나 없는 DOX-NB에서 독소루비신 방출 )

DOX-NB의 초음파 안정성

DOX-NB는 그림 5b에 표시된 것처럼 시험관 내에서 초음파 향상을 달성했습니다. 초음파 데시벨 값 감쇠는 그림 5c에 나와 있습니다. 결과는 DOX-NB가 우수한 초음파 향상을 달성했으며 부드러운 곡선은 NB 서스펜션의 초음파 감쇠 프로세스가 상대적으로 느렸다는 것을 보여줍니다. 이는 DOX-NB의 초음파 신호가 이미징 및 대비 향상을 위해 충분히 안정적일 수 있음을 나타냅니다.

시험관 내 실험 설정의 개략도(a ), 9.0MHz 프로브(b)를 사용한 DOX 로드 NB(0, 5, 10 및 15 min)의 초음파 이미지 ) 및 초음파 조영제 및 DOX 로드 NB의 시간-강도 측정(c )

빈 NB의 생물학적 안전성

MCF-7 세포 생존율은 초음파 후 24시간 동안 빈 NB(DOX 없음)로 배양하여 측정되었습니다. 그림 6에서 볼 수 있듯이 빈 NB는 특정 초음파 강도에서 세포 생존에 큰 영향을 미치지 않았습니다. 0.5 W/cm ² 의 초음파 강도를 사용하는 경우 조사 시간 30초, 99.53% 및 80% 초과인 MCF-7 세포는 각각 10% 및 30% NB 현탁액에서 살아 있었고(그룹 1), MCF-7 세포 생존율의 감소는 용량 의존적이었습니다. 또한 초음파 강도와 조사 시간은 MCF-7 세포의 생존에 영향을 미치는 두 가지 다른 요인이었습니다. 특히, 빈 NB의 농도가 30%일 때 MCF-7 세포는 0.5 W/cm ² 로 처리되었습니다. 30 s 동안 0.5 W/cm ² 에서 처리된 것보다 더 높은 생존력을 보였습니다. 60 s 또는 1 W/cm ² 용 30 s 동안(0.84% ​​대 0.75% 대 0.63%). 따라서 0.5 W/cm ² 의 초음파 강도 그리고 30 s/60 s의 조사 시간은 세포 흡수 실험에 사용되었습니다.

MCF-7 세포에서 다양한 NB 농도 및 음향 강도의 시험관 내 세포독성

DOX-NB 및 초음파 조사에 의해 매개되는 체외 DOX 전달 향상

DOX-NB 또는 유리 DOX(동일한 DOX 농도에서)로 처리된 MCF-7 세포를 고정하고, 이들의 형광 강도를 유세포 분석으로 측정하였다. DOX 처리를 받지 않은 세포를 블랭크 대조군으로 사용하였다. DOX-NB 그룹에서 DOX의 세포 흡수를 유리 DOX 및 대조군의 세포 흡수와 비교하였다. 그림 7에서 DOX-NB와 함께 배양된 MCF-7 세포의 평균 형광 강도는 유리 DOX와 함께 배양된 세포의 자가형광보다 훨씬 낮았으며, 이는 키토산 NB에 DOX를 캡슐화하면 DOX 흡수 및 DOX- 상해를 입었습니다.

DOX가 로드된 NB에 의한 MCF-7 세포의 DOX 전달 유세포 분석(US1 0.5 W/cm ² 30 s, US2 0.5 W/cm ² 60 s)

그러나 초음파 조사는 DOX-NB와 함께 배양된 MCF-7 세포에서 DOX 흡수의 현저한 증가를 가져왔습니다. DOX-NB는 초음파 조사의 도움으로 더 많은 DOX를 MCF-7 세포에 전달할 수 있습니다. 대조적으로, 유리 DOX와 함께 배양된 MCF-7 세포의 DOX 흡수는 초음파 조사 하에서 단지 약간만 증가했습니다. 결과는 DOX-NB와 함께 배양된 MCF-7 세포에서 DOX의 흡수가 초음파 조사 하에서 유리 DOX와 함께 배양된 세포보다 훨씬 더 높다는 것을 시사했습니다.

또한, DOX-NB와 함께 배양된 MCF-7 세포의 DOX 흡수는 조사 시간이 길수록 약간 증가했습니다. 이것은 DOX-NB의 파열이 증가하여 MCF-7 세포의 막에 일시적인 기공을 생성하기 때문일 수 있습니다.

초음파 조사에 의한 DOX 유도 종양 세포 증식 및 세포 사멸의 향상

초음파 보조 DOX-NB 전달의 항암 효과를 조사하기 위해 CCK-8 분석 및 유세포 분석을 사용하여 MCF-7 세포의 생존력을 측정했습니다. 결과는 DOX-NB 그룹에서 MCF-7 세포의 생존력이 초음파를 사용하지 않은 DOX 그룹에서보다 높았다는 것을 보여줍니다. 한편, DOX-NB 그룹에서 MCF-7 세포의 생존율은 국소 초음파 조사를 사용한 DOX 그룹보다 현저히 낮았습니다. DOX-NB 그룹에서 세포 생존율의 비율(21.0 ± 2.2%, p <0.01)은 초음파 조사가 없는 유리 DOX 그룹(6.4 ± 0.7%)보다 훨씬 높았으며, 이는 약물 전달 벡터로서 NB가 혈액 순환에서 DOX에 의한 세포 증식 감소를 개선함을 시사합니다.

또한, DOX-NB 단독 처리(21.0 ± 2.2%, p <0.01), 유리 DOX 단독(6.4 ± 0.7%), 유리 DOX + 초음파(4.1 ± 0.8%, 3.8 ± 0.6%)(그림 8). 데이터는 DOX-NB + US가 MCF-7 세포에서 DOX의 세포독성 효과를 유의하게 향상시켰다는 것을 나타내었다. DOX-NBs + US 그룹은 또한 유리 DOX 및 유리 DOX + 초음파 그룹보다 MCF-7 세포에서 더 큰 세포독성을 입증했습니다.

<그림>

다른 그룹의 세포 생존율 비교

세포생존율은 free DOX + 초음파군(4.1 ± 0.8%)이 free DOX군(6.4 ± 0.7%)보다 낮았다. 따라서 초음파는 유리 DOX로 처리된 MCF-7 세포의 생존력도 감소시켰습니다. 세포 생존율은 DOX-NB+초음파(60 s) 처리 시 2.2 ± 0.9%로 DOX-NB+초음파(30 s) 처리(3.1 ± 0.8%)보다 낮았다. 더 긴 펄스 길이(60 s)가 DOX-NB 전달에 더 효율적이라는 사실.

또한, MCF-7 세포의 아폽토시스는 초음파 조사의 유무에 관계없이 유리 DOX 또는 DOX-NB 처리 후 6 h에 Annexin V 염색에 의해 평가되었습니다. 유리 DOX 존재하에서 세포사멸 MCF-7 세포의 비율은 4.4 ± 0.9%인 반면, 유리 DOX와 초음파(30 s, 60 s)로 처리된 세포에서 유사한 비율이 관찰되었습니다. 초음파 보조 DOX-NB의 전달은 유리 DOX 그룹의 비율과 비교하여 세포사멸 세포의 비율을 유의하게 증가시켰습니다(45.7 ± 1.1% 대 4.4 ± 0.9%, p <0.01). 또한, 초음파 조사를 하지 않은 DOX-NBs 군에서 세포사멸 세포의 비율은 자유 DOX 처리군보다 낮았다(3.2 ± 0.9% vs. 4.4 ± 0.9%). 세포 생존력 분석과 일치하게, 이러한 데이터는 초음파 보조 DOX-NB 전달이 DOX의 항암 효과를 향상시켰음을 나타냅니다.

토론

유방암은 높은 발병률과 사망률로 인해 점점 더 많은 관심을 받고 있습니다. Globocan의 보고서에 따르면 유방암은 저개발 지역 여성의 암 사망 원인 중 가장 흔한 원인입니다[23]. DOX는 DNA 손상을 유발할 수 있어 인기 있는 항유방암제입니다[24]. 그러나 임상 적용에서 심장 독성과 같은 심각한 부작용을 일으킬 수도 있습니다[25]. 이러한 독성 효과를 극복하기 위해서는 암세포만을 표적으로 하는 효율적인 약물 전달 시스템이 필요하여 표적 부위의 약물 농도를 높이고 비표적 조직의 약물 농도를 감소시킨다[26]. 이 작업에서 DOX가 로딩된 생물학적 키토산 NB가 설계되었으며, 이는 초음파와 함께 사용될 때 DOX를 유방암 세포로 방향성 있게 전달할 수 있습니다.

레시틴과 팔미트산으로 구성된 생물학적 키토산 NB는 MRI/초음파 검출, 유전자 전달 및 산소 전달을 위해 공식화되어 사용되었습니다[13, 18, 27]. 그러나 생물학적 키토산 NB의 약물 로딩 용량과 전달 효율은 최적과는 거리가 멀다. Marano et al. DOX가 로드된 글리콜 키토산 NB와 체외 충격파(ESW)를 결합하여 DOX의 항종양 활성을 향상시킵니다[28]. 그러나 ESW는 종양 크기를 평가하고 위치를 정확하게 감지할 수 있는 이미징 기능을 가지고 있지 않습니다. 또한 ESW로 인한 심각한 부작용은 드물지만 일시적인 심장 부정맥을 유발할 수 있습니다[29]. 글리콜산을 포함한 글리콜의 대사산물과 옥살산칼슘의 침전도 심각한 대사성 산증을 유발할 수 있습니다[30]. 초음파는 ESW에 비해 이미징 능력, 비침습성 및 안전성으로 인해 더 큰 장점이 있습니다.

이 연구에서는 퍼플루오로프로판을 코어로, 키토산을 쉘로 사용하여 새로운 DOX-NB를 제조했습니다. 키토산은 대식세포를 활성화할 수 있으며 또한 그들의 전-염증 기능을 향상시킬 수 있습니다[31]. 양전하를 띤 DOX-NB는 혈액 성분과 강력하게 상호작용하여 혈액에서 빠르게 제거되고 종양 부위에서 최적이 아닌 표적화된 축적을 초래할 수 있다는 점에 유의해야 합니다[32]. To overcome this problem, the surface of DOX-NBs was coated with Pluronic F-68, an amphiphilic and non-ionic block copolymer formed by propylene oxide and ethylene units, which may also prevent the aggregation of nanobubbles by steric stabilization [13, 33].

Ensuring the biosafety of NBs is fundamental to their clinical application. In this study, the safety of chitosan NBs was monitored via cell viability, which showed no obvious effect on cell viability with a chitosan NB concentration of 10% and ultrasound treatment (0.5 W/cm ² , 30 s), suggesting low cytotoxicity of chitosan NBs. Indeed, even treatment with a high dosage (30%) of chitosan NBs resulted in less than 20% observable cell death. The results showed that cell viability in chitosan NBs was much higher than that in lipid-coated nanobubbles [19], indicating that chitosan NBs were highly biocompatible with MCF-7 cells and that the cell death observed in this study may be due to the energy released by ultrasound-induced NB disruption. The high safety profile of biocompatible chitosan NBs renders them suitable for loading other drugs in the future.

Our research shows that US irradiation can effectively promote the release of DOX from DOX-NBs and subsequent cellular uptake of DOX in vitro. Exposure of cells to DOX-NBs and ultrasound resulted in near instantaneous cellular entry of DOX. The reason for this is that sonoporation is a process by which ultrasonically activated ultrasound contrast agents pulsate near biological barriers (cell membranes or endothelial layers), increasing their permeability and thereby enhancing the extravasation of external substances. In this way, drugs and genes can be delivered inside individual cells [34]. Our data showed that the cellular uptake of DOX was significantly higher in the DOX-NBs group than in the free DOX group when ultrasound-assisted delivery was applied. Meanwhile, without ultrasound, MCF-7 cells in the free DOX group showed increased DOX uptake than those in the DOX-NBs group, indicating that the chitosan NBs could reduce cellular uptake of DOX in normal tissues and protect them in the absence of ultrasonic irradiation.

Chen et al. showed that the carrier-free HCPT/DOX nanoparticles enhanced synergistic cytotoxicity against breast cancer cells in vitro [35], but they could not reduce DOX cytotoxicity and its toxicity in the circulation. A biophysical research group from Vytautas Magnus University proposed combining DOX-liposomes with microbubbles and US to enhance targeting [36]. Their results showed that the cell survival rate of DOX-liposomes decreased by 60~70% when microbubbles and ultrasound were present. By comparison, the cell survival rate of the DOX-NBs + US group in our study was 85.3% or 89.5% ((21–3.1 or 21–2.2)/21) lower than that of the DOX-NBs group. This proves that the combination of DOX-NBs and US are more effective in transporting DOX than DOX-liposomes combined with microbubbles and US. We also found that the cells in the DOX-NBs + US group showed a higher rate of apoptosis than those in the free DOX and DOX-NBs only groups. This finding was not unexpected as greater accumulation of DOX in cancer cells can increase cell death, consistent with a previous report [37].

Conclusions

In summary, DOX-loaded biocompatible chitosan NBs were successfully prepared using a combination of biological surfactants. The prepared NBs possessed a good ability to achieve ultrasound enhancement and excellent biosafety. The in vitro results demonstrated that DOX­NBs are an innovative drug delivery system that may be useful in obtaining efficient ultrasound­assisted DOX delivery for the treatment of mammary cancer.

약어

CCK-8:

Cell Counting Kit-8

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

DOX:

Doxorubicin hydrochloride

EE:

Encapsulation efficiency

EP tubes:

Eppendorf tubes

ESWs:

Extracorporeal shock waves

MCF-7:

Human breast adenocarcinoma cell line

NBs:

Nanobubbles

US:

Ultrasound

UTN/MD:

Ultrasound-targeted nano/microbubble destruction

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