여기서, 엽산(FA) 접합된 폴리(d,l-락타이드-코-글리콜라이드)(PLGA)-지질 복합물(FA-PL)은 불용성 항암제 파클리탁셀(PTX)의 표적 전달을 위한 나노캐리어로서 개발되었으며, 생성된 FA-PLP 나노입자. 또한 131 I는 방사성 추적자로서 FA-PLP 나노 입자(FA-PLP- 131 I) 세포 흡수 활성, 생체 내 혈액 순환 및 생체 분포를 평가합니다. FA-PLP- 131 I 나노 입자는 안정성이 우수한 구형 형태, 좁은 크기 분포(165.6 및 181.2nm) 및 평균 제타 전위가 -22.1mV를 나타냈습니다. 공초점 레이저 스캐닝 현미경은 표적 분자 FA가 PLP- 131 을 촉진함을 나타냅니다. I uptake by melanoma B16F10 cells, 이는 131 을 통한 세포 혼입율에 의해 추가로 확인되었습니다. 감마 카운터로 측정한 활동 감지. FA-PLP- 131 PTX가 없는 I(FA-PL- 131 I) FA-PLP- 131 동안 약간의 세포독성, 우수한 생체적합성을 나타냄 나는 유리 PTX 및 PLP- 131 에 비해 효율적인 세포 생존 억제 능력이 있는 것으로 입증되었습니다. I. 정맥 주사 후 유리 PTX의 혈액 순환 반감기(t 1/2 =5.4 ± 0.23 h) FA-PLP- 131 에 의해 18.5 ± 0.5 h로 연장되었습니다. I. FA 표적화를 통한 FA-PLP- 131 의 종양 흡수 PLP- 131 에 비해 약 4.41배 및 12.8배 높았습니다. 나와 무료 PTX- 131 나, 각각. 또한 40일의 치료 후 FA-PLP- 131 유리 PTX 및 PLP- 131 에 비해 개선된 종양 억제 효과를 나타냈습니다. I, 재발 및 현저한 전신 생체내 독성 없음. 결과는 131 I-표지된 PLGA-지질 나노입자는 표적 약물 전달 및 생체 내 약물의 안정적인 추적을 위해 동시에 적용될 수 있습니다.
<섹션 데이터-제목="배경">가장 공격적인 피부암 중 하나인 흑색종은 멜라닌 세포의 악성 변형으로 인해 발생합니다[1, 2]. 재발이 쉽고 전이 가능성이 높기 때문에 전이된 흑색종 환자의 5년 생존율은 10%에 불과합니다. 현재까지 흑색종 환자에 대한 가장 일반적인 치료법은 바람직하지 않은 심각한 부작용, 낮은 생체이용률, 낮은 종양 선택성 및 용량 제한 전신 독성을 동반하는 화학요법이며, 이는 종양 화학요법의 주요 과제를 제시합니다[3, 4].
파클리탁셀(Paclitaxel, PTX)은 침엽수 속인 탁서스(taxus)[5, 6]의 건조된 뿌리, 가지, 잎 및 껍질에서 추출한 천연 식물 추출물로 난소암 및 폐를 비롯한 여러 종류의 종양에 효과적인 항종양 활성을 나타냅니다. 암 [7,8,9]. 또한 PTX는 인간 흑색종에 대해서도 효과적인 것으로 보고되었습니다[10, 11]. 그럼에도 불구하고 위에서 언급한 화학요법 약물의 단점 외에도 Cremophor EL 및 탈수 알코올(1:1, v /v ) 혼합물은 현재 임상 실습에서 PTX의 희석제로 사용되며, 이는 과민증을 비롯한 심각한 부작용을 유발할 수 있습니다[12, 13]. 따라서 화학요법제의 수용성과 종양 축적을 향상시켜 말초 노출을 줄이고 생체 내 독성을 최소화하는 새로운 전략의 개발이 가장 중요합니다. 최근 생체적합성 약물 나노캐리어의 개발은 PTX의 생리학적 안정성을 향상시킬 수 있는 가능성을 제공합니다[14,15,16]. 또한 이러한 나노운반체에 대한 표적 분자의 접합은 종양 세포 표면 수용체 매개 표적 효과를 통해 말초 노출을 감소시키면서 종양 부위에 화학요법제의 선택적 전달을 허용할 것이다[17,18,19].
여기에서 우리는 흑색종 치료를 위한 화학요법 약물로서 엽산(FA:종양 표적 분자)을 결합하고 PTX를 캡슐화하는 폴리(d,l-락타이드-코-글리콜라이드)(PLGA)-지질 복합체를 준비했습니다. 또한 131 방사성 마커인 I을 사용하여 PLGA-지질 나노입자를 방사성 표지하여 생체 내 거동을 명확하게 평가했습니다. 음의 베타 방출, 물리적 반감기 및 광범위한 붕괴 특성으로 인해 131 I는 일반적으로 임상에서 방사성 표지로 사용된다[20,21,22]. 131 의 형태, 안정성 및 분산 I-표지된 PLGA-지질 나노입자(FA-PLP- 131 I) 시험관 내에서 평가되었습니다. 또한 FA-PLP- 131 의 세포 흡수, 혈액 순환 및 생체 분포 131 의 방사능을 측정하여 조사를 받았습니다. I. 또한 FA-PLP- 131 의 표적 항암 효능 시험관 내 및 생체 내에서 연구했습니다. 결과는 FA-PLP- 131 나는 화학요법 약물을 위한 잠재적인 종양 약물 전달 나노캐리어로 사용하기 위한 다재다능한 나노플랫폼이 될 수 있습니다.
Poly(d,l-lactide-co-glycolide)(PLGA, MW:5000–15,000, lactide:glycolide(50:50)) 및 chloramine-T는 Sigma Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다. 나 131 저는 Atomic Hitech(Beijing, China)에서 입수했습니다. PTX(99%) 및 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)은 Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.(중국 상하이)에서 구입했습니다. 90-95% 포스파티딜콜린, 1,2-디스테아로일-sn-글리세롤-3-포스포에탄올아민-N으로 구성된 대두 레시틴 -[엽산(폴리에틸렌글리콜)-2000](DSPE-PEG2000 -FA), 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N -[카르복시(폴리에틸렌글리콜)-2000](DSPE-PEG2000 -COOH)는 Avanti(Alabaster, AL, USA)로부터 입수하였다. 모든 세포 배양 시약은 Sigma Aldrich에서 구입했습니다.
FA-PLP 나노입자는 자기조립 나노침전법에 의해 합성되었다[23]. 구체적으로, 10mg의 PTX를 1mL의 에탄올에 용해시키고 2mg의 PLGA를 1mL의 디클로로메탄에 용해시켰다. 혼합 후 레시틴/DSPE-PEG2000 -FA(4:1) 에탄올 수용액(4 중량%)을 25°C에서 4시간 동안 부드럽게 교반하면서 혼합물 용액에 적가했습니다. 혼합물을 여과하고 Millipore 한외여과 원심분리 튜브를 사용하여 탈이온수로 3회 세척하여 캡슐화되지 않은 약물 및 유기 용매를 제거하였다. 대조군으로 DSPE-PEG2000를 대체하여 동일한 방법으로 FA 분자가 그라프팅되지 않은 나노 입자를 제조했습니다. - DSPE-PEG2000를 사용한 FA -쿠. 정제된 FA-PLP 나노입자는 추가로 사용할 때까지 4°C에서 보관되었습니다.
방사성 FA-PLP(FA-PLP- 131 I) 클로라민-T 산화법을 통해 나노입자를 제조하였다[24]. 1mL FA-PLP(1mg/mL), 500μCi Na 131 의 혼합물 I(FA-PLP에 접목할 수 있는 최대 방사능)과 100μL의 5mg/mL 클로라민-T를 pH 7.5 인산 완충액에서 실온에서 10분 동안 반응시켰습니다. 그런 다음 200μL의 메타중아황산나트륨(5mg/mL)을 첨가하여 반응을 켄칭했습니다. 131 I-표지된 PLP 및 PTX는 동일한 절차에 따라 제조되었습니다. 원심분리관(Millipore)을 사용하여 정제하여 남은 유리 Na 131 를 제거했습니다. 여액에서 감마 활성이 감지되지 않을 때까지 I. 표지된 나노입자의 방사성 표지 수율 및 순도는 감마 계수기(LKB 감마 1261; LKB Instruments)를 사용하여 분석되었습니다.
UV-vis 흡수 스펙트럼은 UV-vis 분광 광도계(UV7502, Shanghai Advanced Photoelectric Technology Co., Ltd., Shanghai, China)를 사용하여 기록되었습니다. 투과 전자 현미경(TEM) 이미지는 Zeiss LIBRA 120 TEM에서 수집되었습니다. Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments)를 사용하여 동적 광산란(DLS) 분석을 통해 나노입자의 크기, 제타 전위 및 다분산 지수(PDI)를 검출했습니다. 광학 사진은 Nikon D3200 디지털 카메라로 촬영되었습니다.
마우스 흑색종 세포주 B16F10은 중국과학원(중국 상하이)의 Type Culture Collection의 Cell Bank에서 입수하여 10% 소태아혈청과 100U/mL의 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM에서 가습기에서 배양했습니다. 5% CO2 37°C의 대기
131 I-표지된 화합물[25]. B16F10 세포를 24웰 플레이트에 1 × 10 5 로 시딩했습니다. 웰당 세포 및 합류까지 배양. 방사성 요오드 샘플( 131 나, PL- 131 나, FA-PL- 131 나, PLP- 131 나, FA-PLP- 131 I) DMEM 배지에서 제조하고 별도로 세포 배양 웰에 첨가하였다. 0.5, 1, 2, 4 및 6시간 인큐베이션 후 세포를 PBS로 3회 세척하고 감마 계수기(중국 과학 기술 연구소, Jia Branch Innovation Co., Ltd.)로 방사능을 측정했습니다. 통합 값(%)은 이전 문헌[25]에 설명된 대로 계산되었습니다. 또한, 나노 입자를 형광 염료 fluorescein isothiocyanate(FITC, Sigma)로 표지한 다음 B16F10 세포와 함께 배양했습니다. 세포의 형광 이미지는 상용 공초점 레이저 스캐닝 현미경(FV1200, Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 캡처되었습니다.
MTT 세포 생존력 분석은 PL- 131 의 세포독성을 연구하는 데 사용되었습니다. 나와 FA-PL- 131 저와 마찬가지로 무료 PTX, PLP- 131 나와 FA-PLP- 131 I, B16F10 세포에 대해. 간단히 말해서, B16F10 세포를 96웰 플레이트에 24시간 동안 플레이팅하고 PL- 131 에 노출시켰습니다. 나와 FA-PL- 131 I(0–100μg/mL PLGA 지질 포함) 또는 유리 PTX, PLP- 131 나와 FA-PLP- 131 24시간 동안 I(0–40μg/mL의 다양한 농도에서). 실험은 삼중으로 수행되었다. 모든 데이터는 평균 ± SD로 표현되었습니다.
3-5주령 Balb/c 마우스는 Shanghai Slack Laboratory Animal Co., Ltd.(Shanghai, China)에서 구입했습니다. 모든 동물 실험은 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건원 지침을 준수하는 Fudan University의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.
B16F10 셀(1 × 10 6 ) PBS 중 마우스 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 성장하는 종양 부피는 캘리퍼스를 사용하여 측정하고 종양 부피는 다음 공식을 사용하여 계산했습니다. 부피 =(길이 × 너비 2 )/2. 종양 부피가 약 80mm에 도달한 경우 3 , 마우스를 실험 그룹으로 무작위 배정했습니다.
건강한 Balb/c 마우스에 PTX- 131 을 정맥 주사했습니다. 나와 FA-PLP- 131 I(마우스당 10μCi 100μL, 5mg/kg). 혈액 순환은 쥐의 꼬리에서 약 10μL의 혈액을 채취하여 측정했습니다. 혈액 내 방사능은 감마 카운터를 사용하여 측정되었습니다. 나노 입자의 생체 분포를 감지하기 위해 B16F10 종양이 있는 마우스에 PTX- 131 을 주사했습니다. 나, FA-PL- 131 나, PLP- 131 나와 FA-PLP- 131 같은 용량으로 주사 후 24시간에 희생했습니다. 주요 장기의 무게를 측정하고 감마 계수를 위해 수집했습니다.
B16F10 종양이 있는 Balb/c 마우스에 150μL의 염수, 유리 PTX, PLP- 131 을 주사했습니다. 나와 FA-PLP- 131 I(동일한 PTX 농도에서 5mg/kg). 종양 크기와 체중은 4일마다 캘리퍼스로 측정했습니다. 상대적 종양 부피는 V로 계산되었습니다. /V 0 (V 0 는 치료가 시작되었을 때의 종양 부피였습니다). 약 40일의 처리 후 마우스를 희생시키고 주요 장기를 수집하고 4% 포르말린에 고정하고 파라핀을 포매 및 슬라이스하고 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하고 디지털 현미경으로 검사했습니다.
FA-PLP- 131 의 합성 방식 I 나노입자는 그림 1과 같다. 간단히 말해서 FA-PLP 나노입자는 자기조립 나노침전법과 방사성 FA-PLP(FA-PLP- 131 I) chloramine-T 산화 방법을 사용하여 제조되었습니다[23, 24]. PTX는 PLGA-지질 복합체에 의해 캡슐화되었으며, PEG화를 통해 쉘 표면에 공유 결합된 FA와 접목되었습니다. 마지막으로 131 나는 외부 나노 입자 표면에 이식되었습니다. TEM 이미지는 FA-PLP- 131 I 나노 입자는 좁은 크기 분포(165.6~181.2nm)의 구형 형태를 가졌으며 이는 동적 광산란으로 확인되었습니다(그림 2a, b). 제타 전위의 범위는 -39.1~-3.2mV입니다(그림 2c). 유리 PTX 및 FA-PLP- 131 의 UV-vis 스펙트럼 I(동일한 PTX 농도 사용)은 233nm에서 동일한 기능 피크를 보여(그림 2d), PTX가 FA-PLP- 131 내에 캡슐화되었음을 나타냅니다. I과 그 캡슐화는 PTX의 흡광도에 영향을 미치지 않았습니다. 계산 후 FA-PLP- 131 에서 PTX의 캡슐화 효율 나는 56.35 ± 1.6%로 나타났다. PTX- 131 의 방사성 표지 수율 나, PL- 131 나, FA-PL- 131 나, PLP- 131 나와 FA-PLP- 131 나는 각각 45.6 ± 2.3, 52.1 ± 4.1, 48.9 ± 1.9, 56.3 ± 2.5, 54.8 ± 2.7이었다.
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FA-PLP- 131 합성 나 나노입자
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아 FA-PLP- 131 의 TEM 이미지 나. b 입자 크기 및 c FA-PLP- 131 의 제타 전위 동적 광산란으로 분석했습니다. d 유리 PTX 및 FA-PLP- 131 의 흡광도 스펙트럼 나
안정성은 나노입자의 생물의학적 응용에 필수적입니다[26]. 4주 보관 후 FA-PLP- 131 나는 물, 세포 배지, 태아 소 혈청 및 PBS에 용해되어 평균 크기, 제타 전위, PDI 지수에 변화가 없었으며(그림 3a-c) 안정성과 분산성이 우수함을 나타냅니다. 또한 FA-PLP- 131 의 방사성 표지 안정성 나는 37°C의 마우스 혈장에서 검출되었으며(그림 3d), 7일 이내에 15% 미만의 탈요오드화를 보였습니다.
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아 , b 콜로이드 안정성 및 c FA-PLP- 131 의 PDI 테스트 물, DMEM, PBS 및 소태아혈청(FBS)을 포함한 다양한 배지에서 I. d FA-PLP- 131 의 방사성 표지 안정성 곡선 I 보관 후 2주 이내에 37°C의 마우스 혈장
그림 4는 131 의 시험관 내 시간 종속 통합을 보여줍니다. 나, PL- 131 나, FA-PL- 131 나, PLP- 131 나와 FA-PLP- 131 감마 카운터로 측정한 B16F10 세포의 I. FA-PLP- 131 나 뿐만 아니라 FA-PL- 131 I는 시간이 지남에 따라 모든 시험 시점보다 높은 혼입 값을 나타내었다. FA-PLP- 131 의 통합 값 6시간의 I는 131 보다 3.12배 및 23.4배 높았습니다. 나와 PLP- 131 I, fluorescein isothiocyanate-labeled FA-PLP- 131 과 배양된 B16F10 세포의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 이미지 결과와 일치 나와 PLP- 131 I 나노 입자(추가 파일 1:그림 S1). 이 결과는 FA-PLP- 131 의 높은 세포 흡수를 보여줍니다 I, 아마도 B16F10 세포에 대한 FA 매개 표적화 효과 때문일 것입니다.
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131 의 시간 종속적 통합 나, PL- 131 나, FA-PL- 131 나, PLP- 131 나와 FA-PLP- 131 B16F10 세포의 I
대조군 나노운반체의 세포독성, PL- 131 나와 FA-PL- 131 MTT assay로 검사를 받았습니다. PL- 131 으로 처리된 세포 나와 FA-PL- 131 24시간 동안 I은 대조군과 유사한 생존력을 가졌으며(그림 5a), 우수한 생체 적합성을 나타냅니다. 또한 FA-PLP- 131 나는 유리 PTX와 PLP- 131 보다 B16F10 세포 증식을 억제하는 데 훨씬 효과적이었습니다. 동일한 농도의 PTX에서 I(그림 5b)은 우수한 세포 표적 화학 요법을 나타냅니다. 결과는 FA-PLP- 131 방사선독성과 세포독성이 없는 높은 화학요법 효과를 가지고 있습니다.
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아 PL- 131 처리 후 B16F10 세포의 세포 생존율 나와 FA-PL- 131 나는 24시간 동안 ㄴ 다양한 농도의 유리 PTX, PLP- 131 과 함께 배양 후 B16F10 세포의 세포 생존율 나와 FA-PLP- 131 나는 24시간 동안
방사성 표지는 나노 입자의 정량적이고 정확한 생체 내 추적을 위해 형광 이미징보다 더 신뢰할 수 있는 것으로 보고되었습니다[27, 28]. 131 I-표지된 FA-PLP 나노입자는 감마 카운터로 측정한 혈액 순환 및 생체 분포를 포함한 생체 내 거동을 조사하기 위해 준비되었습니다. 유리 PTX의 혈액 순환 반감기(t 1/2 =5.4 ± 0.23 h) FA-PLP- 131 에 의해 18.5 ± 0.5 h로 연장되었습니다. I(그림 6a)은 나노 입자 캡슐화로 인해 종양 표적화 축적에 유리했습니다[29,30,31]. 다음으로 무료 PTX- 131 의 생체 분포 나, PLP- 131 나와 FA-PLP- 131 주사 후 1일에 B16F10 종양 보유 마우스의 I을 조사했습니다(그림 6b). FA-PLP- 131 나 뿐만 아니라 FA-PL- 131 I는 PLP- 131 보다 4.41배 및 12.8배 높은 종양 흡수의 명백한 향상을 나타냈습니다. 나와 무료 PTX- 131 나는 각각 FA-PLP- 131 의 장기간 혈액 순환으로 인한 것 같습니다. 나, FA-PL- 131 나, 그리고 그것의 FA 표적화 효과. 또한 간과 비장 역시 정상적인 대사기관인 나노입자 대사로 인해 상대적으로 높은 흡수율을 보였다[32, 33].
<그림>
아 FA-PLP- 131 의 혈액 순환 곡선 정맥 주사 후 나. ㄴ PTX의 생체분포- 131 나, FA-PL- 131 나, FA-PLP- 131 나와 PLP- 131 B16F10 종양 보유 마우스의 I
무료 PTX-, PLP- 131 I- 및 FA-PLP- 131 I 처리된 마우스는 식염수 대조군과 비교하여 종양 성장 억제를 나타냈다(그림 7a). 전체적으로 FA-PLP- 131 나는 약 40일의 치료 후 모든 치료군에 비해 재발 없이 종양 성장 억제에 가장 효과적이었습니다. 이러한 결과는 FA-PLP- 131 의 혈액순환이 현저히 연장된 점을 고려할 때 예상한 바와 같습니다. I 및 따라서 FA-매개 종양 표적화된 축적을 촉진하는 능력. 또한, 종양 표적 축적은 PTX의 말초 노출을 감소시켜 전신 독성을 최소화했습니다. 예상대로 전체 치료 과정에서 눈에 띄는 체중 감소는 없었고(그림 7b), 심장, 간, 비장, 폐, 신장을 포함한 주요 장기는 어느 그룹에서도 명백한 조직학적 병변을 보이지 않았습니다( 그림 7c).
<그림>
아 상대적 종양 부피 및 b 식염수(대조군), 유리 PTX, PLP- 131 을 꼬리 정맥에 주입한 후 종양이 있는 쥐의 체중 나와 FA-PLP- 131 나. b 식염수(대조군), 유리 PTX, PLP- 131 을 꼬리 정맥에 주입한 후 종양이 있는 쥐의 체중 나와 FA-PLP- 131 나. c 심장, 간, 비장, 폐, 신장 등 주요 장기의 대표적인 헤마톡실린 및 에오신 염색 이미지. 축척 막대 =100μm
요약하면 131 을 합성했습니다. 흑색종 표적 화학요법을 위한 약물 전달 운반체로서의 I-표지된 PLGA-지질 나노입자. 131 의 방사능을 측정하여 I, FA-PLP- 131 의 시험관 내 및 생체 내 거동 I 나노 입자를 연구했습니다. 획득한 FA-PLP- 131 우수한 분산성과 콜로이드성 및 방사성 표지 안정성을 나타냈습니다. 제어 나노운반체, PL- 131 나와 FA-PL- 131 좋은 생체적합성도 보였다. PTX 캡슐화 후, FA-PLP- 131 나는 FA 표적화 효과에 기인하여 세포독성 없이 B16F10 세포 증식을 억제하는 데 가장 효과적이었다. 또한 FA-PLP- 131 나는 PTX의 혈액 순환을 유의하게 연장하고 표적 종양 영역 내에 효과적으로 축적하는 것으로 입증되었습니다. 따라서 FA-PLP- 131 나는 우수한 종양 성장 억제와 뛰어난 생체 내 생체 적합성을 가지고 있었습니다. 결과는 이러한 다재다능한 FA-PLP- 131 의 유망한 잠재력을 강조합니다. I nanocarriers는 신뢰할 수 있는 약물 추적 에이전트이자 종양 표적 치료에 적용됩니다.
나노물질
초록 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA) 기반 나노의약품의 임상 번역은 부분적으로는 식세포에 의한 비특이적 식세포 작용으로 인한 낮은 전달 효율로 인해 제한적입니다. 암세포와 면역 세포 사이의 나노입자 상호작용을 이해하는 것은 여전히 어려운 일입니다. 이 연구에서는 단일 배양 또는 공동 배양 시스템에서 단핵구/대식세포가 있거나 없는 후두 암종 세포에 대한 형광 PLGA 입자(100 nm, 500 nm 및 1 µm)의 세포 내재화에 대한 정량적 조사가 먼저 수행되었습니다. 5~20µg/mL 농도의 PLGA 입자는 500nm 및
초록 빠르고 통제할 수 없는 세포 성장이 합병증과 조직 기능 장애를 일으키는 질병인 암의 유병률 증가는 과학자와 의사의 심각하고 긴장된 우려 중 하나입니다. 오늘날 암 진단과 특히 그 효과적인 치료는 지난 세기 건강과 의학의 가장 큰 과제 중 하나로 여겨져 왔습니다. 약물 발견 및 전달의 상당한 발전에도 불구하고 일반적으로 건강한 조직 및 기관에 손상을 일으키는 많은 부작용과 부적절한 특이성 및 민감도가 약물 사용에 큰 장벽이 되어 왔습니다. 이들 치료제의 투여 기간과 양에 대한 제한도 도전적이다. 반면에, 화학 요법 및 방사선
