단파 적외선 영역에서 방출하는 나노프로브의 초분광 다중화 생물학적 이미징

방법

나노제형 준비 및 특성화

유기 형광 NIR-SWIR 염료가 장착된 고분자 코어-쉘 나노입자 합성

폴리스티렌(PS)-폴리-N -이소프로필아크릴아미드(PNIPAM) 코어-쉘 나노입자는 이전에 설명한 방법을 수정하여 마이크로에멀젼 중합에 의해 합성되었습니다[44, 45]. 먼저, PS-co-PNIPAM(PNIPAM의 10 wt.%) 코어 나노입자를 다음과 같이 제조하였다. NIPAM(0.1 g), 나트륨 도데실 설페이트 SDS(0.1 g) 및 0.005 g의 NaH₂ PO₄ × H₂ O는 45 ml의 H₂에 용해되었습니다. O. 스티렌(1 g)은 온도가 60 °C로 증가했을 때 격렬하게 교반하면서 적가했습니다. 다음 단계인 Ar이 혼합물에 30분 동안 버블링됨에 따라 온도는 70°C로 상승하고 0.08 g의 K₂ S₂ O₈ 1 ml의 H₂에 용해 중합을 개시하기 위해 O를 주입하였다. 둘째, PNIPAM 쉘은 PS-co-PNIPAM 코어에 계층화되었습니다. 이를 위해 반응기에 단량체 NIPAM(1.8 g)과 가교제 N의 수용액을 첨가했습니다. ,N '-메틸렌비스아크릴아미드(BIS)(0.18 g) in 4 ml H₂ O 주사기를 사용합니다. 반응을 70 ℃에서 4 시간 동안 계속하였다. 혼합물을 실온으로 냉각하고 MWCO 3500 Da가 포함된 셀룰로오스 막을 사용하여 74시간 동안 투석했습니다. 그 결과 PS-PNIPAM 나노입자의 현탁액이 제작되었다. 나노입자의 코어-쉘 구조는 투과전자현미경(TEM) 이미지에 의해 명확하게 드러납니다(그림 3a). NIR-SWIR 형광성 PNP를 얻기 위해, 2-부틸-6-[5-(2-부틸-1,3-디메틸시클로-헵타[c]피롤-6(2H)-일리덴)펜타-1,3-디엔 -1-yl]-1,3-dimethylcyclohepta[c]pyrrolium tetra-fluoroborate(JB9-08로 표시) 형광 염료[46]는 PS-PNIPAM 나노입자에 포스트로딩[47]되었습니다. DMF에 녹인 1 mM JB9-08 염료 용액 8마이크로리터를 0.25 wt% PNPs 물 현탁액 2 mL에 첨가하고 사용하기 전에 24시간 동안 보관했습니다.

Core-Shell RENP의 합성

RENP는 다른 곳에서 보고된 수정된 프로토콜에 따라 합성되었습니다[48]. 먼저 α-NaYF₄ :10%Yb ³⁺ , 30% Nd ³⁺ 코어 나노입자는 고온에서 금속 트리플루오로아세테이트의 분해를 통해 제조되었다. 일반적인 절차에서 0.05 mmol Yb₂ O₃ , 0.15 mmol Nd₂ O_3, 및 0.25 mmol Y₂ O₃ 5 ml의 탈이온수와 5 ml의 TFA가 들어있는 250 ml 플라스크에 넣고 1 시간 동안 90 ℃로 가열하여 투명한 용액을 얻었다. 생성된 투명한 용액을 아르곤 퍼지 하에 이 온도에서 증발시켜 탁한 분말 RE(TFA)₃를 얻었습니다. . 이어서, 8 ml OA, 8 ml OM, 12 ml ODE 및 2 mmol NaTFA를 플라스크에 첨가하였다. 용액을 120 °C로 가열하고 그 온도에서 30분 동안 유지한 다음 300°C까지 30분 동안 가열한 후 실온으로 자연 냉각시켰다. 전체 합성 과정에서 아르곤 환경이 적용되었습니다. 냉각된 반응 플라스크에 20mL 에탄올을 첨가하여 생성된 나노입자를 침전시켰다. 에탄올로 3회 원심 세척한 후 수집된 백색 분말을 최종적으로 추가 사용을 위해 10 ml 헥산에 분산시켰다.

둘째, α-NaYF₄ :10%Yb ³⁺ , 30% Nd ³⁺ @CaF₂ 코어-쉘 RENP는 α-NaYF₄의 사용을 포함하는 종자 매개 에피택시 성장 과정을 통해 준비되었습니다. :10% Yb ³⁺ , x% Nd ³⁺ 시드로 코어 및 쉘 전구체 용액에서 상응하는 성장. 쉘 전구체를 준비하기 위해 먼저 250ml 플라스크에 5ml의 탈이온수와 5ml의 TFA가 포함된 2mmol의 CaO를 첨가하고 90℃에서 1시간 동안 가열하여 투명한 용액을 생성했습니다. 그런 다음 이 용액을 이 온도에서 증발시켜 칼슘 트리플루오로아세테이트의 쉘 전구체(Ca(TFA)₂ ). 다음으로 0.5 mmol NaYF₄ :10% Yb ³⁺ , 30% Nd ³⁺ 코어 나노입자, 7 ml OA 및 7 ml ODE를 모두 플라스크에 첨가했습니다. 그런 다음 용액을 30분 동안 120°C로 가열한 다음 자연 냉각되기 전에 60분 동안 300°C까지 가열합니다. 모든 과정은 아르곤 환경에서 진행되었습니다. 생성된 코어-쉘 나노입자는 냉각된 반응 플라스크에 20 mL 에탄올을 첨가하여 침전시켰다. 에탄올로 3회 원심 세척한 후, 수집된 코어-쉘 나노입자를 최종적으로 추가 사용을 위해 10 ml 헥산에 분산시켰다. 수분산액의 제조를 위해 제조된 α-NaYF₄ :10%Yb ³⁺ , 30% Nd ³⁺ @CaF₂ 코어-쉘 RENP(5 mL 헥산 분산액)를 먼저 5 mL N과 혼합했습니다. ,N -니트로소늄 테트라플루오로보레이트(NOBF₄)의 디메틸포름아미드(DMF) 용액 ) (0.1 M) 실온에서. RENP 침전이 관찰될 때까지 혼합물에 부드러운 진탕을 가하였다. 이어서, 톨루엔 및 헥산(1:1, 부피)을 혼합물에 첨가한 후, 이를 10000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 침전물을 수집하고 5 mL DMF에 분산시켰다. 두 번째로, 250 mg 폴리(아크릴산)(PAA, MW =18,000)을 NOBF₄의 5 mL DMF 용액에 첨가했습니다. -처리된 RENP를 80°C로 가열하고 격렬한 교반 하에 이 온도에서 30분 동안 유지합니다. 그 후, 아세톤을 첨가하여 나노입자를 침전시키고, 에탄올로 세척하고, 최종적으로 증류수에 분산시켰다.

투과 전자 현미경

PNP와 RENP의 형태는 투과전자현미경(TEM)을 사용하여 평가되었습니다. TEM으로 이미지화하기 위해 10 μL의 나노입자 현탁액을 formvar로 안정화된 탄소 지지 필름에 떨어뜨렸습니다. PNP의 코어-쉘 구조를 시각화하기 위해 지지 필름에 떨어뜨리기 전에 1% 인텅스텐산 수용액으로 음성으로 염색했습니다. 탄소 지지 필름을 공기 건조하고 5 μL의 순수한 물로 세척했습니다. 이미지는 TEM(JEM-1230, JEOL)에서 100 kV의 가속 전압에서 작동하여 얻은 것입니다.

광발광 분광법

두 가지 유형의 나노입자에 대한 PL 스펙트럼은 NIR-SWIR 범위용 iHR320 분광계(Horiba)가 장착된 Fluorolog-3 분광형광계를 사용하여 NIR 및 SWIR 범위에서 측정되었습니다. 808 nm에서 방출하는 광섬유 결합 레이저 다이오드(QSP-808-4, QPhotonics)를 사용하여 PNP 및 RENP에서 PL을 여기했습니다.

초분광 이미징 시스템

자체 제작한 SWIR HSI 시스템은 대역 순차 획득 방법(그림 2)을 활용하며 NIR 카메라(Xeva-1.7-320, Xenics, Belgium), 집속 광학 장치(TEC-M55MPW, Computar, USA) 및 액정 가변 필터(Varispec LNIR)를 포함합니다. 20-HC-20, PerkinElmer, USA)를 분산 요소로 사용합니다. 이 시스템은 340 × 258 픽셀 해상도를 가지며 900–1700 nm 스펙트럼 범위에서 작동합니다. 시스템의 조명 소스에는 백열 램프(이미지 정렬, 포커싱 및 명시야 이미징용) 및 레이저 전원(Laser Source 4308)으로 구동되는 808nm 파이버 결합 레이저 다이오드(QSP-808-4, QPhotonics, USA)가 포함됩니다. , Arroyo Instruments, USA), PL 이미징에서 PL 여기용. 스펙트럼 데이터 큐브 획득은 900~1200 nm 범위에서 20nm 스펙트럼 폭의 LCTF 투과율을 10nm 단계로 순차적으로 조정하고 해당 이미지를 캡처하여 수행되었습니다. HSI 획득 중 NIR 카메라의 노출 시간은 200 ms로 설정되었습니다. 샘플의 레이저 출력 밀도는 ~ 100 mW/cm ² 로 고정되었습니다. . 전체 NIR-SWIR 범위에서 PL 이미지를 획득하기 위해 LCTF는 850nm 길이의 통과 필터(Edmund Optics, USA)로 대체되었습니다.

NIR-SWIR 초분광 이미징 시스템의 개략도

스펙트럼 혼합 해제 소프트웨어

획득한 스펙트럼 데이터 큐브의 분석을 위해 MATLAB 환경을 사용하여 스펙트럼 언믹싱 알고리즘을 개발했습니다. 모든 픽셀의 스펙트럼은 알려진 최종 멤버의 선형 혼합으로 간주됩니다. \( F\left(\lambda \right)=\sum \limits_i{a}_i{G}_i\left(\lambda \right) \), 여기서 F (λ ) - 픽셀 스펙트럼, G _나 — 최종 멤버 스펙트럼 및 a _나 수많은 엔드멤버들입니다. 혼합 해제 소프트웨어의 목적은 획득한 스펙트럼 데이터 큐브의 모든 픽셀에서 LSMA(선형 스펙트럼 혼합 분석) 문제를 해결하여 알려진 엔드멤버의 풍부함을 추정하는 것입니다. L 스펙트럼 대역의 수, p 혼합물에 존재하는 말단 구성원의 수입니다. 그러면 LSMA 문제는 F로 나타낼 수 있습니다. =가 + n , 여기서 F L입니다. 픽셀 강도의 × 1 벡터, G L입니다. × p 모든 endmembers 벡터를 포함하는 행렬, a p입니다 × 1 미지의 존재 벡터 및 n L입니다. × 1 오류 벡터. LSMA 문제를 해결하기 위한 LSE(Least Squares Error) 기반 방법은 다음과 같은 최적화 작업으로 구성할 수 있습니다. min_a {(F − 가 ) ^T (F − 가 )}이고 고전적인 솔루션은 a입니다. (r ) =(G ^T G ) ⁻¹ G ^T F . 그러나 그러한 솔루션은 물리적 의미가 없는 풍부에 대해 음수 값을 포함할 수 있습니다. 이 장애물을 해결하려면 LSE 최적화 작업을 수정해야 합니다. min_a {(F − 가 ) ^T (F − 가 )}, a에 따라 ≥ 0. 이 작업을 해결하기 위해 [49, 50]에 자세히 설명된 비음성 제약 선형 스펙트럼 혼합 분석(NC-LSMA)을 기반으로 하는 반복 알고리즘을 사용합니다. 모든 구성 요소에 대한 풍부함을 계산한 후 2D 컬러맵 그래프로 매핑됩니다. 마지막으로, 혼합 해제 소프트웨어는 얻은 풍부함을 기반으로 해당 구성 요소의 강도 이미지를 생성합니다. \( {I}_i\left(x,y\right)={a}_i\left(x,y\right)\sum \limits_ {\lambda }{G}_i\left(\lambda \right) \), 여기서 I _나 (x , y ) - i의 적분 강도 -픽셀 단위의 마지막 멤버 및 a _나 (x , y )—나 -번째 풍요.

동물 실험

BALB/c 누드 마우스(출처:The Jackson Laboratory, USA)는 작은 동물 시설에서 어둡고 무균 조건에서 사육되었습니다. 모든 동물 실험은 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 중국 국가 규정의 기준에 따라 수행되었습니다. 영상화 전에, 수컷 누드 마우스(6주령, 20 ± 2 g)를 복강내 주사에 의해 5% 클로랄 수화물(마우스 체중 그램당 0.06 ml)로 마취시켰다. 생체 내 SWIR PL 이미징을 위해 나노입자를 10x 인산염 완충 식염수(PBS)에 현탁시키고 PNP, RENP 또는 이들의 혼합물의 각 PBS 현탁액 100μL를 마우스에 피하 주사했습니다.

결과 및 토론

HSI에 사용하기 위해 두 가지 유형의 SWIR-광발광 NP가 준비되었습니다. PNP의 고분자 매트릭스(그림 3a 및 b) 및 (2) PAA 코팅된 NaYF₄ :10%Yb ³⁺ ,30%Nd ³⁺ @CaF₂ 코어 쉘 희토류 이온 도핑 나노입자(RENP, 그림 3c 및 d). Nd ³⁺ RENP의 코어에 있는 이온은 ~ 808 nm 빛으로 여기될 수 있습니다( ⁴ 나_9/2 → ⁴ F_5/2 전환) 및 Yb ³⁺ 로 에너지 전송 950–1100 nm 범위에서 방출하는 이온, ~ 975 nm에서 피크( ² F_5/2 → ² F_7/2 이행). RENPs 코어는 불활성 CaF₂로 코팅되었습니다. 표면 결함 및 주변 환경과의 상호 작용을 통해 비방사 손실을 줄이기 위한 쉘 [48]. 두 나노 제형은 808 nm 여기에서 900–1200 범위에서 광발광을 나타냅니다(그림 3e).

<그림>

PNP 및 RENP의 특성화. TEM 이미지(a ) 및 도식 구조(b ) JB9-08 염료가 로딩된 PNP의 경우. TEM 이미지(c ) 및 도식 구조(d )의 RENP. 이 808 nm 여기에서 PNPs-JB9-08 및 RENPs 현탁액의 정규화된 PL 방출 스펙트럼. 스케일 바, 100 nm

분광 형광계로 얻은 나노 입자의 PL 방출 스펙트럼은 두 가지 이유로 스펙트럼 혼합 해제 소프트웨어에서 최종 멤버로 사용할 수 없습니다. 첫째, HSI 시스템의 감도는 기존 분광 형광계와 달리 분광 보정되지 않으므로 획득한 방출 스펙트럼 프로파일은 두 가지 획득 방법에 대해 다릅니다. 둘째, LCTF의 스펙트럼 대역폭이 20 nm이지만 HSI 프레임은 10 nm 단계로 수집됩니다. 그 결과 인접 프레임에서 신호가 중첩되어 분광 형광계로 측정한 스펙트럼 프로파일과 비교하여 얻은 스펙트럼 프로파일이 왜곡됩니다. 이러한 장애물을 극복하기 위해 HSI 시스템을 사용하여 최종 멤버(PNP 및 RENP 샘플의 스펙트럼 프로파일)를 획득했습니다. 이를 위해 두 가지 유형의 나노 프로브를 PBS에 현탁시키고 PBS 현탁액을 미세 원심 분리기 튜브에 넣었습니다 (그림 4a). PL 방출 스펙트럼이 겹치기 때문에 기존의 PL 이미징으로 두 샘플을 구별하는 것은 거의 불가능합니다(그림 4b 및 3e). HSI 시스템을 사용하여 900~1200 nm의 스펙트럼 범위에서 10nm 단계로 31개의 PL 이미지를 수집했습니다(그림 4c). PNP, RENP 및 배경(BG)의 스펙트럼 프로파일은 빨간색, 파란색 및 녹색 사각형으로 표시된 영역의 신호를 평균화하여 스펙트럼 데이터 큐브의 스펙트럼 차원을 통해 계산했습니다(그림 4b). PNP 및 RENP에 대해 얻은 스펙트럼 프로파일(그림 4d)은 분광 형광계로 측정한 것과 유사한 것으로 밝혀졌으며 나중에 스펙트럼 비혼합을 위한 최종 멤버로 사용되었습니다. 그 후, PNP, RENP 및 BG 스펙트럼 프로파일을 최종 구성원으로 사용하여 해당 구성 요소의 존재비가 계산되고 2D 컬러맵 플롯으로 매핑됩니다(그림 4e). 풍부함은 하이퍼큐브의 모든 공간 픽셀에 대해 계산되었으며 0에서 1 사이의 값으로 표시되었으며, 0과 1은 각각 구성 요소의 완전한 부재와 완전한 풍부함을 나타냅니다. 모든 픽셀에 있는 모든 구성 요소의 풍부함의 합은 1과 같습니다. 혼합 해제 소프트웨어는 저휘도 픽셀로 인한 오류를 제거하기 위해 신호 강도에 따른 임계값을 사용했습니다. 스펙트럼 차원에 따른 픽셀의 최대 강도가 ​​전체 하이퍼큐브 최대값의 5% 미만인 경우 이러한 픽셀은 노이즈 성분이 충분히 풍부한 것으로 간주됩니다. 또한, PNP 및 RENP의 적분 강도 이미지는 해당 존재비를 고려하고 배경 성분을 제거하여 계산되었습니다(그림 4f). 예상했던 대로 풍부도 매핑과 적분 강도 이미지는 모두 오른쪽 튜브에 PNP가 풍부하고 왼쪽 튜브에 RENP가 풍부함을 보여주지만 PL 방출 산란과 혼합 해제 알고리즘의 불완전성으로 인한 약간의 오류가 있습니다.

<그림>

RENP와 PNP를 포함하는 미세원심분리 튜브의 HSI. 아 PBS에 현탁된 PNP 및 RENP가 있는 미세원심분리기 튜브의 명시야 이미지. ㄴ 808 nm로 여기된 PNP 및 RENP 샘플의 PL 이미지(이미지 획득을 위해 850nm 길이의 통과 필터가 사용됨). ㄷ HSI 프레임으로 구성된 하이퍼큐브를 보여주는 스킴. d b에 표시된 ROI에서 평균한 PNP, RENP 및 배경(BG)의 스펙트럼 프로필 빨간색, 파란색 및 녹색 사각형으로 해당합니다. 이 구성 요소 풍부도의 컬러 맵. 에 PL 구성요소의 재구성된 강도 이미지 및 PL/명시야 병합 이미지

스펙트럼 unmixing은 또한 PNP, RENP의 혼합물을 구별할 수 있습니다. 이를 입증하기 위해 3개의 미세원심분리기 튜브에 PNP, RENP 및 이들의 혼합물 용액을 채웠습니다. 하이퍼큐브 및 스펙트럼 비혼합 절차를 획득한 후 존재비 매핑은 첫 번째 미세 원심 분리기 튜브에 PNP가 완전히 존재하고 두 번째 튜브에는 RENP가, 세 번째 튜브에는 두 가지의 혼합물이 있음을 나타냅니다(그림 5a). 강도 이미지의 재구성은 표본에서 PNP 및 RENPs PL 신호의 강도 분포를 나타내기 위해 추가로 수행되었습니다(그림 5b).

<그림>

(왼쪽에서 오른쪽으로) RENP, PNP 및 이 둘의 혼합물을 포함하는 미세원심분리기 튜브의 HSI. 아 PNP, RENP 및 배경(BG)이 풍부합니다. ㄴ 재구성된 PL 강도 이미지 및 PL/명시야 병합 이미지

우리는 생체 내 SWIR PL 이미징에서 스펙트럼 적으로 겹친 나노 프로브를 다중화하는 HIS 방법의 적용 가능성을 추가로 입증했습니다. 누드 마우스를 마취하고 PNP, RENP 및 이 둘의 혼합물을 피하 주사했습니다. 850nm 길이의 통과 필터를 사용한 NIR 이미징은 3개의 구별할 수 없는 광발광 스폿을 보여줍니다(그림 6a). HSI 및 분석을 수행한 후 풍부도 매핑은 상단 및 하단 주입 부위에서 각각 PNP와 RENP의 완전한 풍부함을 보여주지만, 왼쪽 주입 부위에서는 둘의 혼합물이 확인되었습니다(그림 6b). 또한 PL 강도 분포를 얻기 위해 강도 재구성을 수행했습니다(그림 6c). 혼합 해제 소프트웨어의 임계값을 15%(경험적으로 추정)로 조정하여 배출 지점에 인접한 영역에서 노이즈를 제거할 수 있게 되었습니다(그림 6d). 이러한 결과는 긴 또는 대역통과 광학 필터를 사용하는 기존의 PL 이미징 방식과 달리 HSI가 시편의 강도 분포를 매핑할 수 있을 뿐만 아니라 강도의 스펙트럼 프로파일을 식별하여 혼합물에 존재하는 성분을 다중화할 수 있음을 나타냅니다. 이미지의 모든 픽셀.

<그림>

PNP(오른쪽 상단 주입 부위), RENP(오른쪽 하단) 및 RENP/PNP 혼합물(왼쪽)을 피하 주사한 마우스의 HSI. 아 명시야(SWIR), SWIR PL 및 850nm 길이의 통과 방출 필터로 획득한 병합 이미지. ㄴ PNP, RENP 및 배경(BG)이 풍부합니다. ㄷ 재구성된 강도 이미지에 해당합니다. d 15%의 임계값 수준과 PL/명시야 병합 이미지로 풍부함에서 재구성된 PL 강도 이미지.

따라서 HSI 획득 및 스펙트럼 비혼합 처리의 조합이 스펙트럼 중첩 SWIR PL 나노프로브의 다중 이미징을 얻기 위해 이 작업에 적용되었습니다. 그러나 HSI 양식의 적용 가능성과 관련하여 몇 가지 문제를 고려해야 합니다. First, due to the spectrally narrow acquisition, every HSI frame deals with relatively low signal intensity (especially in the case of the spectrally broad PL emission form the organic moieties). In addition, an increase in the PL exciting laser power in biological imaging is limited by danger of tissue damage (or phototoxicity). This results in higher requirements for the brightness of the PL probes and their photostability, as HSI can require order of magnitude longer acquisition time in comparison with conventional PL imaging. It should also be noted that the linear mixture analysis and spectral unmixing algorithm can work satisfactorily for multiplexed PL imaging of biological tissues in the spectral range where tissue transmittance does not change much. In contrast, if tissue transmittance has distinctive features in the spectral range of HSI, linear spectral mixture model may be hardly applicable (especially in case of deeper tissues) and nonlinear models can be considered.

결론

In conclusion, we developed a hyperspectral SWIR bioimaging technique and applied it for multiplexing of nanoparticles emitting in SWIR spectral range. Two types of nanoparticles with overlapping PL spectra, which are undistinguishable in conventional imaging, were successfully multiplexed by their PL spectral profiles using hyperspectral acquisition along with the linear spectral mixture analysis algorithm. The developed method was successfully employed for multiplexed imaging of SWIR PL nanoparticles both in sample suspensions and injected in small animals. With SWIR bioimaging having superior resolution at higher imaging depth, SWIR HSI approach holds a great potential for use in various applications requiring multiplexed imaging with NIR-SWIR PL nanoprobes. Furthermore, as SWIR bioimaging is at a very early stage, there is plenty of room for the development of biomedical applications of PL probes in a combination with HSI.

데이터 및 자료의 가용성

이 연구 동안 생성되거나 분석된 모든 데이터는 이 출판된 기사에 포함됩니다.

약어

BG:

Background

HSI:

Hyperspectral imaging

LCTF:

Liquid crystal tunable filter

NIR:

근적외선

NP:

나노입자

PL:

광발광

PNIPAM:

Poly-N -isopropylacrylamide

PNPs:

Polymeric nanoparticles

추신:

폴리스티렌

RENPs:

Rare-earth doped fluoride nanoparticles

SWIR:

Short-wave infrared

TEM:

투과전자현미경

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