생물학적 시스템에서 단파 적외선 나노프로브의 다중 검출을 위한 고급 초분광 이미징

초록

외부 발광체가 단파 적외선(SWIR, ~1000~1700 nm) 영역에서 발광하는 광학 바이오이미징은 급속히 발전하는 분야이며, 최근 여러 종류의 SWIR 광발광 나노프로브 개발이 보고되었습니다. 이와 관련하여 초분광 이미징(HSI)과 언믹싱 알고리즘의 결합은 광발광(PL) 스펙트럴 프로파일을 기반으로 SWIR 발광 나노제제를 효율적으로 다중화할 수 있는 유망한 도구입니다. 본 연구에서 보고된 SWIR HSI 기술은 두 종류의 나노프로브, 즉 유기 염료로 도핑된 폴리머 나노입자(PNPs)와 희토류 도핑 불화물 나노입자(RENPs)의 다중화를 위해 개발되었습니다. 두 나노프로브 모두 동일한 스펙트럴 범위(~900~1200 nm)에서 PL을 나타내므로, 광학 필터로는 스펙트럴 분리가 어려워 생체 조직 내 다중 영상화가 제한됩니다. SWIR HSI를 적용하여 PL 스펙트럴 프로파일의 차이를 활용함으로써, 각 나노입자 유형으로부터의 PL 신호를 스펙트럴 선택적으로 민감하게 영상화하는 데 성공했습니다. 획득 데이터의 언믹싱을 통해 스펙트럴 중첩 나노프로브를 PL 프로파일별로 다중화할 수 있었습니다. 혼합 현탁액에서 각 나노입자 유형의 정량적 및 공간적 분포를 모두 얻었습니다. 마지막으로, SWIR HSI 기술과 언믹싱 프로토콜을 PNPs와 RENPs를 피하 주입한 생쥐의 생체 내 영상화에 적용하여, 생체 내 영상화에서 초분광 기술이 SWIR PL 나노프로브를 다중화하는 데 적용 가능함을 성공적으로 입증했습니다.

서론

생체의료 영상 기술은 최근 수십 년간 급속히 발전하여 다양한 질병과 병리의 조기 발견 및 평가를 가능하게 했습니다. 여러 영상 양식 중 광학 영상은 높은 공간 및 시간 해상도와 상대적으로 저렴한 비용으로 독보적인 위치를 차지합니다. 광발광(또는 구체적으로 형광) 기반의 다양한 광학 영상 접근법이 개발되고 임상적으로 전환되고 있습니다. 예를 들어, 림프계 영상과 수술 중 형광 영상 유도 수술은 의료 발전에 유망한 결과를 보여주었습니다[1, 2]. 한편, 관심 영역(예: 종양)을 표적하는 외부 광발광 프로브가 생체 내 및 생체 외 영상화를 위해 활발히 개발되고 있습니다. 광발광(PL) 프로브의 일반적인 요구 사항(높은 흡광도, 발광 양자 수율, 광안정성) 외에도 PL 발광의 스펙트럴 위치와 형태도 중요한 매개변수입니다. 생체 조직에 의한 빛의 감쇠가 근적외선(NIR) 스펙트럴 범위(~700~950 nm)에서 가시광선보다 낮다는 것이 알려지면서, 생체 조직의 NIR 투명 윈도우(~700~950 nm) 개념이 도입되었고 NIR 발광 프로브 개발에 많은 노력이 기울여졌습니다[3-6]. 또한 최근 발전으로 제2 및 제3 NIR 윈도우(NIR-II, NIR-III)가 ~1000~1700 nm 스펙트럴 범위에서 도입되었으며, 이는 적외선 영상 분야의 급속한 발전과 함께 단파 적외선(SWIR)이라고 불리기도 합니다[7-9]. SWIR 범위에서 물 흡수가 기존 NIR 윈도우보다 높음에도 불구하고, 생체 조직의 낮은 자가형광과 산란으로 인해 SWIR PL 바이오이미징에서 더 우수한 영상 해상도와 더 깊은 영상 깊이를 얻을 수 있습니다[10-12]. 예를 들어, 새로운 SWIR 형광 염료 CH1055-PEG를 사용한 림프 및 뇌 혈관의 SWIR PL 영상에서, 기존 NIR-I 형광 염료인 인디아닌 그린을 사용한 기존 NIR PL 영상에 비해 해상도와 신호 대 배경 비율이 우수함이 입증되었습니다[13]. 또한 Dai 그룹은 SWIR 발광 나노프로브(단일벽 탄소 나노튜브)와 SWIR 영상 카메라를 사용하여 두개골 절개 없이 생쥐 뇌혈관을 비침습적으로 영상화할 때, 가시광선이나 NIR-I 범위에서는 접근 불가능한 >2 mm 깊이에서 10 μm 미만의 혈관을 시각화했습니다[8].

제1 NIR 윈도우에서 강한 흡수를 보이고 NIR-II 윈도우에서 형광을 내는 유기 염료 및 염료 복합체는 유망한 NIR-SWIR 프로브로 간주되며, 혈관 및 림프절 영상, 종양 경계 설정, 영상 유도 수술에서 탁월한 조영제로 입증되었습니다[13-16]. 현재 미국 FDA가 인체 사용을 승인한 유일한 NIR 형광 조영제는 인디아닌 그린(ICG)뿐입니다[17]. 한편, 분자 영상 프로브(염료 또는 염료 복합체)는 생체 프로브 특성(수용성, 세포 투과성 등)을 변경하거나 다른 영상 또는 표적 양식을 부여하기 위해 분자 구조를 수정해야 하는 한계가 있습니다. 반면, PL 중심을 포함하는 나노입자(NPs)는 표면을 다양한 작용기로 공유 결합 수정하여 수분 분산성 및 안정성 향상, 표면 전하 제어, 표적화 목적 등에 활용할 수 있습니다. 또한 NIR-SWIR PL 나노플랫폼의 도입은 PL 영상을 다른 영상, 진단 또는 치료 양식과 결합할 수 있게 합니다. 최근 연구들은 SWIR 발광 나노제형을 이용한 깊은 조직, 전신, 종양, 두개골 투과 영상을 통해 다양한 생체 내 과정을 모니터링한다고 보고합니다[14, 18-21]. 생체 내 영상용으로 보고된 다양한 NIR-SWIR 발광 나노프로브 중 두 가지 유형을 구별할 수 있습니다: 유기 물질(공액 고분자) 또는 세라믹(예: 불화물) 나노결정에서 NIR-SWIR 형광이 발생하는 경우입니다. 폴리머 기반 나노입자(PNPs)는 합성과 화학적 기능화가 상대적으로 쉽고, 우수한 생체적합성과 생분해성으로 인해 임상 전환에 가장 성공적인 나노의약품 중 하나입니다[22]. NIR-SWIR 형광체로 적재될 때 PNPs는 유망한 영상 프로브 또는 영상 유도 약물 전달 수단이 될 수 있습니다[23, 24]. 반면, 희토류 이온 도핑 나노입자(RENPs)는 업컨버전(반스토크스 천이)과 다운컨버전(스토크스 천이) 과정을 통해 접근 가능한 독특한 광발광 특성을 가진 잘 알려진 나노프로브 클래스입니다[25-30]. 최근 RENPs는 NIR-SWIR 영상에 적용되었습니다. 유기 물질 기반 NIR-SWIR 프로브와 달리 높은 양자 수율, 뛰어난 광안정성, 전체 NIR-SWIR 스펙트럴 영역에서 조절 가능한 좁은 방출 대역을 가집니다[20, 31, 32]. RENPs는 소동물 혈관 및 장기 영상, 종양 검출, 다중 및 다중 스펙트럴 영상에 적용되었습니다[3, 19, 20, 33-35].

PL 바이오이미징의 발전과 함께, 생체 내에서 여러 PL 물질을 동시에 추적하는 능력이 다양한 목적(예: 선택된 세포 또는 장기 표적 영상과 영상 유도 약물 전달의 결합)을 위해 요구될 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 다중 영상 방법이 개발되었습니다. 다중 영상은 영상화된 생물학적 시스템에서 해부학적 및 기능적 정보의 상호 보완성을 의미하며, 영상 바이오마커, 조영제, 양식의 결합을 통해 연구 및 임상 응용에서 영상의 유용성을 높일 수 있습니다[36]. 다중 PL 영상은 여러 PL 영상 조영제와 치료 양식을 도입할 수 있게 하여 나노의학의 테라노스틱 차원을 강화합니다. 가장 일반적인 다중 영상 방법은 적절한 광학 필터를 사용하여 PL 발광의 스펙트럴 위치로 PL 프로브를 구별합니다[37-39]. 그러나 이러한 접근법에서 적절한 다중화에는 스펙트럴로 좁고 중첩되지 않는 PL 스펙트럼을 가진 나노프로브의 활용이 필요합니다. 이와 관련하여 초분광 이미징(HSI)과 스펙트럴 혼합 분석 알고리즘의 결합은 PL 다중화를 위한 유망한 도구입니다. 그러나 PL HSI의 생물의학적 응용은 주로 형광 현미경에 국한되어 다양한 나노프로브 유형을 다중화하고 배경 및 자가형광을 제거하는 데 사용됩니다[40, 41]. 생체 내 HSI와 관련하여, 조직 반사 스펙트럼의 획득 및 순차 분석을 통한 반사 영상 모드에서 가장 자주 사용되지만[42], 생체 내 HSI 영상(다중 스펙트럴 영상이라고도 함)이 가시광선 및 NIR 범위에서 PL에 대해 보고된 바 있습니다[3, 5]. 그러나 SWIR 발광 나노프로브의 HSI에 대한 문헌 보고는 찾을 수 없었습니다.

최근 우리는 밴드 시퀀셜 HSI 시스템과 스펙트럴 언믹싱 소프트웨어를 결합한 SWIR PL 영상 기술을 개발했습니다[43]. 밴드 시퀀셜 HSI 절차는 스펙트럴 투과율이 변하는 요소(액정 가변 필터, LCTF)를 통해 2D 이미지를 연속적으로 획득하는 기반입니다. RENPs 현탁액에서 얻은 SWIR PL 데이터는 두 공간 차원과 한 스펙트럴 차원으로 구성된 3차원 스펙트럴 데이터 큐브(하이퍼큐브)로 제시되었습니다. 획득한 하이퍼큐브의 모든 공간 픽셀에 스펙트럴 언믹싱 절차를 추가로 적용하여 PL 혼합물 내 성분의 풍부도를 계산했습니다. 본 연구에서는 생체 내 SWIR PL 바이오이미징을 위한 나노프로브 다중화 문제 해결에 HSI를 적용했습니다. 스펙트럴로 중첩되는 방출을 가지며 기존 광학 필터를 사용한 통상적 PL 영상에서는 쉽게 구별할 수 없는 두 종류의 SWIR 발광 나노입자를 사용했습니다. Figure 1은 이들 나노입자의 PL 스펙트럴 혼합 문제와 밴드 시퀀셜 언믹싱 HSI를 이용한 해결 방식을 보여줍니다.

방법

나노제형 제조 및 특성 분석

유기 형광 NIR-SWIR 염료로 적재된 폴리머 코어-쉘 나노입자 합성

폴리스티렌(PS)-폴리-N-이소프로필아크릴아미드(PNIPAM) 코어-쉘 나노입자는 이전에 보고된 방법[44, 45]을 변형한 마이크로에멀젼 중합으로 합성했습니다. 먼저 PS-co-PNIPAM(PNIPAM 10 wt.%) 코어 나노입자를 제조했습니다. NIPAM(0.1 g), SDS(0.1 g), NaH₂PO₄·H₂O(0.005 g)를 45 ml 물에 용해시켰습니다. 60 °C에서 격렬히 교반하며 스티렌(1 g)을 방울방울 첨가했습니다. Ar을 30분간 버블링한 후 온도를 70 °C로 올리고, 1 ml 물에 녹인 K₂S₂O₈(0.08 g)을 주입하여 중합을 개시했습니다. 다음으로 PNIPAM 쉘을 PS-co-PNIPAM 코어 위에 층상 성장시켰습니다. 모노머 NIPAM(1.8 g)과 가교제 BIS(0.18 g)를 4 ml 물에 녹인 수용액을 주사기로 반응기에 주입했습니다. 반응을 70 °C에서 4시간 계속 진행했습니다. 혼합물을 실온으로 식히고 MWCO 3500 Da 셀룰로오스 막으로 74시간 투석했습니다. 그 결과 PS-PNIPAM 나노입자 현탁액이 제조되었으며, 코어-쉘 구조는 투과전자현미경(TEM) 이미지에서 명확히 확인됩니다(Fig. 3a). NIR-SWIR 형광 PNPs를 얻기 위해 JB9-08 형광 염료[46]를 PS-PNIPAM 나노입자에 후속 적재[47]했습니다. 1 mM JB9-08 염료 DMF 용액 8 μl를 0.25 wt% PNPs 수성 현탁액 2 mL에 첨가하고 사용 전 24시간 방치했습니다.

코어-쉘 RENPs 합성

RENPs는 다른 곳에서 보고된 변형 프로토콜[48]을 따라 합성했습니다. 먼저 고온에서 금속 트리플루오로아세테이트 분해를 통해 α-NaYF₄: 10%Yb³⁺, 30% Nd³⁺ 코어 나노입자를 제조했습니다. 일반적인 절차에서 Yb₂O₃(0.05 mmol), Nd₂O₃(0.15 mmol), Y₂O₃(0.25 mmol)을 250 ml 플라스크에 넣고 5 ml 탈수와 5 ml TFA를 가한 후 90 °C에서 1시간 가열하여 맑은 용액을 얻었습니다. 이 용액을 같은 온도에서 아르곤 퍼지 하에 증발시켜 진흙 같은 RE(TFA)₃ 분말을 얻었습니다. 이후 OA 8 ml, OM 8 ml, ODE 12 ml, NaTFA 2 mmol을 플라스크에 첨가했습니다. 용액을 120 °C로 가열하여 30분 유지한 후 300 °C로 올려 30분간 유지한 뒤 자연 냉각했습니다. 전체 합성 과정은 아르곤 분위기에서 진행되었습니다. 결과 나노입자는 냉각된 반응 플라스크에 에탄올 20 mL를 첨가하여 침전시켰습니다. 에탄올로 3회 원심 세척 후 수집된 백색 분말을 10 ml 헥산에 분산시켜 추후 사용했습니다.

둘째, 씨드 매개 에피택셜 성장 공정을 통해 α-NaYF₄: 10%Yb³⁺, 30% Nd³⁺@CaF₂ 코어-쉘 RENPs를 제조했습니다. α-NaYF₄: 10% Yb³⁺, x% Nd³⁺ 코어를 씨드로 사용하여 쉘 전구체 용액에서 성장을 진행했습니다. 쉘 전구체 제조를 위해 CaO 2 mmol에 5 ml 탈수와 5 ml TFA를 250-ml 플라스크에 넣고 90 °C에서 1시간 가열하여 맑은 용액을 얻었습니다. 이 용액을 같은 온도에서 증발시켜 칼슘 트리플루오로아세테이트(Ca(TFA)₂) 쉘 전구체를 얻었습니다. 다음으로 0.5 mmol NaYF₄: 10% Yb³⁺, 30% Nd³⁺ 코어 나노입자, OA 7 ml, ODE 7 ml를 플라스크에 모두 첨가했습니다. 용액을 120 °C에서 30분 가열한 후 300 °C로 올려 60분간 유지한 뒤 자연 냉각했습니다. 전체 과정은 아르곤 분위기에서 수행되었습니다. 결과 코어-쉘 나노입자는 냉각된 반응 플라스크에 에탄올 20 mL를 첨가하여 침전시켰습니다. 에탄올로 3회 원심 세척 후 수집된 코어-쉘 NPs를 10 ml 헥산에 분산시켜 추후 사용했습니다. 수용액 분산을 위해 제조된 α-NaYF₄: 10%Yb³⁺, 30% Nd³⁺@CaF₂ 코어-쉘 RENPs(헥산 분산액 5 mL)를 먼저 0.1 M 니트로늄 테트라플루오로보레이트(NOBF₄) DMF 용액 5 mL와 실온에서 혼합했습니다. RENP 침전이 관찰될 때까지 부드럽게 흔들었습니다. 이후 톨루엔과 헥산(1:1 부피비)을 혼합물에 첨가하고 10000 rpm으로 10분간 원심분리했습니다. 침전물을 수집하여 5 mL DMF에 분산시켰습니다. 둘째, NOBF₄ 처리된 RENPs의 5 mL DMF 용액에 폴리아크릴산(PAA, MW = 18,000) 250 mg을 첨가하고 80 °C에서 30분간 격렬히 교반하며 가열했습니다. 이후 아세톤을 첨가하여 NPs를 침전시키고 에탄올로 세척한 후 최종적으로 증류수에 분산시켰습니다.

투과전자현미경

PNPs와 RENPs의 형태는 투과전자현미경(TEM)으로 평가했습니다. TEM 영상화를 위해 나노입자 현탁액 10 μl를 포름바르로 안정화된 탄소 지지막 위에 떨어뜨렸습니다. PNPs의 코어-쉘 구조를 시각화하기 위해 지지막 위에 떨어뜨리기 전에 1% 인산텅스텐산 수용액으로 음성 염색했습니다. 탄소 지지막을 공기 건조시키고 순수 5 μl로 세척했습니다. 이미지는 TEM(JEM-1230, JEOL)에서 100 kV 가속 전압으로 작동하여 얻었습니다.

광발광 분광법

두 나노입자 유형의 PL 스펙트럼은 NIR 및 SWIR 범위에서 Fluorolog-3 분광형광도계(iHR320 분광기 장착, Horiba)로 측정했습니다. 808 nm 파장의 파이버 결합 레이저 다이오드(QSP-808-4, QPhotonics)를 사용하여 PNPs와 RENPs의 PL을 여기시켰습니다.

초분광 이미징 시스템

자체 제작한 SWIR HSI 시스템은 밴드 시퀀셜 획득 방식(Fig. 2)을 활용하며, NIR 카메라(Xeva-1.7-320, Xenics, 벨기에), 포커싱 광학계(TEC-M55MPW, Computar, 미국), 액정 가변 필터(Varispec LNIR 20-HC-20, PerkinElmer, 미국)를 분산 요소로 포함합니다. 시스템 해상도는 340 × 258 픽셀이며 900~1700 nm 스펙트럴 범위에서 작동합니다. 시스템의 조명 소스에는 이미지 정렬, 포커싱, 밝은 필드 영상용 할로겐 램프와 PL 영상용 PL 여기용 808-nm 파이버 결합 레이저 다이오드(QSP-808-4, QPhotonics, 미국)가 포함되며, 레이저 전원(Laser Source 4308, Arroyo Instruments, 미국)으로 구동됩니다. 스펙트럴 데이터 큐브 획득은 LCTF 투과율을 900~1200 nm 범위에서 20-nm 스펙트럴 폭으로 10-nm 간격으로 순차 조절하며 해당 이미지를 캡처하여 수행했습니다. HSI 획득 중 NIR 카메라 노출 시간은 200 ms로 설정했습니다. 샘플의 레이저 전력 밀도는 ~100 mW/cm²로 고정했습니다. 전체 NIR-SWIR 범위에서 PL 이미지 획득을 위해 LCTF를 850-nm 롱패스 필터(Edmund Optics, 미국)로 교체했습니다.

스펙트럴 언믹싱 소프트웨어

획득한 스펙트럴 데이터 큐브 분석을 위해 MATLAB 환경에서 스펙트럴 언믹싱 알고리즘을 개발했습니다. 모든 픽셀의 스펙트럼은 알려진 엔드멤버의 선형 혼합으로 간주됩니다: \( F(\lambda) = \sum_i a_i G_i(\lambda) \), 여기서 \( F(\lambda) \)는 픽셀 스펙트럼, \( G_i \)는 엔드멤버 스펙트럼, \( a_i \)는 엔드멤버의 풍부도입니다. 언믹싱 소프트웨어의 목적은 획득한 스펙트럴 데이터 큐브의 모든 픽셀에서 선형 스펙트럴 혼합 분석(LSMA) 문제를 풀어 알려진 엔드멤버의 풍부도를 추정하는 것입니다. \( L \)을 스펙트럴 밴드 수, \( p \)를 혼합물에 존재하는 엔드멤버 수라고 하면, LSMA 문제는 \( \mathbf{F} = \mathbf{Ga} + \mathbf{n} \)으로 표현됩니다. 여기서 \( \mathbf{F} \)는 \( L \times 1 \) 픽셀 강도 벡터, \( \mathbf{G} \)는 모든 엔드멤버 벡터를 포함하는 \( L \times p \) 행렬, \( \mathbf{a} \)는 미지 풍부도 \( p \times 1 \) 벡터, \( \mathbf{n} \)은 \( L \times 1 \) 오차 벡터입니다. 최소제곱오차(LSE) 기반 LSMA 문제 해결 방법은 다음과 같은 최적화 과제로 구성됩니다: min\(_{\mathbf{a}}\){\((\mathbf{F} - \mathbf{Ga})^T(\mathbf{F} - \mathbf{Ga})\)}, 고전적 해는 \( \mathbf{a}(\mathbf{r}) = (\mathbf{G}^T\mathbf{G})^{-1}\mathbf{G}^T\mathbf{F} \)입니다. 그러나 이 해는 물리적 의미가 없는 풍부도의 음수 값을 포함할 수 있습니다. 이 장애를 해결하기 위해 LSE 최적화 과제를 수정했습니다: min\(_{\mathbf{a}}\){\((\mathbf{F} - \mathbf{Ga})^T(\mathbf{F} - \mathbf{Ga})\)}, subject to \( \mathbf{a} \ge 0 \). 이 과제를 풀기 위해 비음제약 선형 스펙트럴 혼합 분석(NC-LSMA) 기반 반복 알고리즘을 사용했으며, 이는 [49, 50]에 자세히 설명되어 있습니다. 모든 성분의 풍부도를 계산한 후 2D 컬러맵 그래프로 매핑했습니다. 마지막으로 언믹싱 소프트웨어는 획득한 풍부도를 기반으로 해당 성분의 강도 이미지를 산출합니다: \( I_i(x,y) = a_i(x,y)\sum_\lambda G_i(\lambda) \), 여기서 \( I_i(x,y) \)는 픽셀 내 i번째 엔드멤버의 적분 강도, \( a_i(x,y) \)는 i번째 풍부도입니다.

동물 실험

BALB/c 누드 마우스(출처: The Jackson Laboratory, 미국)를 소동물 시설에서 암소 및 무균 조건에서 사육했습니다. 모든 동물 실험은 중국 국가 실험동물 관리 규정에 따라 수행되었습니다. 영상화 전, 6주령 수컷 누드 마우스(20 ± 2 g)를 5% 클로랄 하이드레이트(마우스 체중 1g당 0.06 ml)로 복강 주사하여 마취했습니다. 생체 내 SWIR PL 영상화를 위해 나노입자를 10x 인산염 완충 식염수(PBS)에 현탁시키고, PNPs, RENPs 또는 그 혼합물의 PBS 현탁액 100 μl를 생쥐에 피하 주사했습니다.

결과 및 논의

HSI용 두 종류의 SWIR 광발광 NPs를 제조했습니다: (1) JB9-08 염료로 후속 적재된 PNPs(수용액에서는 사실상 비형광[46]이나, 폴리머 매트릭스에 후속 적재 시 수중에서 형광이 회복됨[51], Fig. 3a, b) 및 (2) PAA 코팅 NaYF₄:10%Yb³⁺,30%Nd³⁺@CaF₂ 코어-쉘 희토류 이온 도핑 나노입자(RENPs, Fig. 3c, d). RENPs 코어의 Nd³⁺ 이온은 ~808 nm 빛(⁴I_9/2 → ⁴F_5/2 전이)으로 여기될 수 있으며 Yb³⁺ 이온에 에너지를 전달하여 ~975 nm 피크로 950~1100 nm 범위에서 발광합니다(²F_5/2 → ²F_7/2 전이). RENPs 코어는 불활성 CaF₂ 쉘로 코팅되어 표면 결함과 주변 환경과의 상호작용을 통한 비복사 손실을 줄였습니다[48]. 두 나노제형 모두 808 nm 여기에서 900~1200 nm 범위에서 광발광을 나타냅니다(Fig. 3e).

분광형광도계로 얻은 나노입자의 PL 방출 스펙트럼은 두 가지 이유로 스펙트럴 언믹싱 소프트웨어의 엔드멤버로 사용할 수 없습니다. 첫째, HSI 시스템의 감도는 기존 분광형광도계와 달리 스펙트럴 보정되지 않아 두 획득 방법에서 방출 스펙트럴 프로파일이 다릅니다. 둘째, HSI 프레임은 10 nm 간격으로 수집되지만 LCTF의 스펙트럴 대역폭은 20 nm입니다. 이로 인해 인접 프레임에서 신호 중첩이 발생하여 분광형광도계로 측정된 스펙트럴 프로파일과 비교하여 획득된 스펙트럴 프로파일이 왜곡됩니다. 이 장애를 극복하기 위해 엔드멤버(PNPs와 RENPs 시료의 스펙트럴 프로파일)를 HSI 시스템으로 획득했습니다. 이를 위해 두 나노프로브 유형을 PBS에 현탁시키고 원심분리 튜브에 담았습니다(Fig. 4a). 기존 PL 영상으로는 두 시료를 구별하기 어렵습니다(Figs. 4b, 3e). HSI 시스템을 사용하여 900~1200 nm 스펙트럴 범위에서 10-nm 간격으로 31장의 PL 이미지를 수집했습니다(Fig. 4c). Fig. 4b의 적색, 청색, 녹색 사각형으로 표시된 영역의 신호를 스펙트럴 차원으로 평균화하여 PNPs, RENPs, 배경(BG)의 스펙트럴 프로파일을 계산했습니다(Fig. 4d). 분광형광도계로 측정한 것과 유사한 PNPs와 RENPs의 스펙트럴 프로파일을 얻었으며, 이를 스펙트럴 언믹싱의 엔드멤버로 사용했습니다. 이후 PNPs, RENPs, BG 스펙트럴 프로파일을 엔드멤버로 사용하여 해당 성분의 풍부도를 계산하고 2D 컬러맵 플롯으로 매핑했습니다(Fig. 4e). 풍부도는 하이퍼큐브의 모든 공간 픽셀에 대해 계산되었으며 0~1 값으로 표현되며, 0과 1은 해당 성분의 완전한 부재와 완전한 풍부도를 각각 나타냅니다. 모든 성분의 풍부도 합은 모든 픽셀에서 1입니다. 언믹싱 소프트웨어는 신호 강도에 의한 임계값 처리를 사용하여 저강도 픽셀로 인한 오류를 제거했습니다. 픽셀의 스펙트럴 차원을 따른 최대 강도가 전체 하이퍼큐브 최댓값의 5% 미만이면 해당 픽셀을 노이즈 성분으로 완전히 풍부한 것으로 간주했습니다. 또한 해당 풍부도를 고려하고 배경 성분을 제거하여 PNPs와 RENPs의 적분 강도 이미지를 계산했습니다(Fig. 4f). 예상대로 풍부도 매핑과 적분 강도 이미지 모두 오른쪽 튜브에서 PNPs의 완전한 풍부도, 왼쪽 튜브에서 RENPs의 완전한 풍부도를 보여주며, PL 방출 산란과 언믹싱 알고리즘의 불완전성으로 인한 약간의 오차가 있습니다.

스펙트럴 언믹싱은 PNPs와 RENPs의 혼합물도 구별할 수 있습니다. 이를 입증하기 위해 세 개의 원심분리 튜브에 PNPs, RENPs, 그 혼합물 용액을 채웠습니다. 하이퍼큐브 획득 및 스펙트럴 언믹싱 절차 후, 풍부도 매핑은 첫 번째 튜브에서 PNPs의 완전한 존재, 두 번째 튜브에서 RENPs의 완전한 존재, 세 번째 튜브에서 두 나노입자의 혼합을 나타냈습니다(Fig. 5a). PNPs와 RENPs PL 신호의 시료 내 강도 분포를 밝히기 위해 강도 이미지 재구성을 추가로 수행했습니다(Fig. 5b).

개발한 HIS 방법을 생체 내 SWIR PL 영상에서 스펙트럴 중첩 나노프로브의 다중화에 적용 가능함을 추가로 입증했습니다. 누드 마우스를 마취시키고 PNPs, RENPs, 두 나노입자의 혼합물을 피하 주사했습니다. 850-nm 롱패스 필터를 사용한 NIR 영상에서는 세 개의 구별할 수 없는 광발광 반점이 보입니다(Fig. 6a). HSI 수행 및 분석 후, 풍부도 매핑은 상단 주입 부위에서 PNPs의 완전한 풍부도, 하단 주입 부위에서 RENPs의 완전한 풍부도, 왼쪽 주입 부위에서 두 나노입자의 혼합물을 보여줍니다(Fig. 6b). 또한 PL 강도 분포를 얻기 위해 강도 재구성을 수행했습니다(Fig. 6c). 언믹싱 소프트웨어의 임계값을 15%(경험적으로 추정)로 조정함으로써 방출 반점 인접 영역의 노이즈를 제거할 수 있었습니다(Fig. 6d). 이러한 결과는 장파대 또는 대역통과 광학 필터를 사용하는 기존 PL 영상 양식과 달리, HSI가 시료 내 강도 분포를 매핑할 수 있을 뿐만 아니라 이미지의 모든 픽셀에서 강도의 스펙트럴 프로파일을 식별하여 혼합물에 존재하는 성분을 다중화할 수 있음을 나타냅니다.

따라서 HSI 획득과 스펙트럴 언믹싱 처리의 결합을 본 연구에서 스펙트럴 중첩 SWIR PL 나노프로브의 다중 영상화에 적용했습니다. 그러나 HSI 양식의 적용 가능성과 관련하여 몇 가지 사항을 고려해야 합니다. 첫째, 스펙트럴로 좁은 획득으로 인해 모든 HSI 프레임은 상대적으로 낮은 신호 강도를 다루게 됩니다(특히 유기 물질의 스펙트럴로 넓은 PL 방출의 경우). 또한 생체 영상에서 PL 여기 레이저 파워 증가는 조직 손상(또는 광독성) 위험으로 제한됩니다. 이로 인해 HSI가 기존 PL 영상에 비해 수십 배 더 긴 획득 시간을 요구할 수 있으므로 PL 프로브의 밝기와 광안정성에 대한 요구 사항이 더 높아집니다. 또한 선형 혼합 분석과 스펙트럴 언믹싱 알고리즘은 조직 투과율이 HSI 스펙트럴 범위에서 크게 변하지 않는 스펙트럴 범위에서 생체 조직의 다중 PL 영상에 만족스럽게 작동할 수 있습니다. 반면, 조직 투과율이 HSI 스펙트럴 범위에서 독특한 특징을 가지면 선형 스펙트럴 혼합 모델은 거의 적용하기 어려울 수 있습니다(특히 깊은 조직의 경우), 이때 비선형 모델을 고려할 수 있습니다.

결론

결론적으로, SWIR 스펙트럴 범위에서 발광하는 나노입자의 다중화를 위해 초분광 SWIR 바이오이미징 기술을 개발하고 적용했습니다. 기존 영상에서는 구별할 수 없는 중첩 PL 스펙트럼을 가진 두 종류의 나노입자를 초분광 획득과 선형 스펙트럴 혼합 분석 알고리즘을 사용하여 PL 스펙트럴 프로파일로 성공적으로 다중화했습니다. 개발된 방법은 시료 현탁액과 소동물에 주입된 SWIR PL 나노입자의 다중 영상화에 성공적으로 활용되었습니다. SWIR 바이오이미징이 더 깊은 영상 깊이에서 우수한 해상도를 가지므로, SWIR HSI 접근법은 NIR-SWIR PL 나노프로브를 이용한 다중 영상화가 필요한 다양한 응용 분야에서 큰 잠재력을 가집니다. 또한 SWIR 바이오이미징이 매우 초기 단계이므로, HSI와 결합된 PL 프로브의 생물의학적 응용 개발에 충분한 여지가 있습니다.

약어

BG:

배경

HSI:

초분광 이미징

LCTF:

액정 가변 필터

NIR:

근적외선

NPs:

나노입자

PL:

광발광

PNIPAM:

폴리-N-이소프로필아크릴아미드

PNPs:

폴리머 나노입자

PS:

폴리스티렌

RENPs:

희토류 도핑 불화물 나노입자

SWIR:

단파 적외선

TEM:

투과전자현미경