DNA로 만든 강력한 항종양 면역자극 생체적합성 나노하이드로겔

초록

메틸화되지 않은 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드는 Th1 유형 항원 특이적 T 세포 반응을 유도하여 선천 및 후천 면역 시스템을 모두 활성화하는 강력한 면역 자극 모티프이지만 혈청에서의 불안정성은 면역 자극제 효율에 큰 영향을 미칩니다. 여기에서 우리는 다중 프라임 사슬 증폭을 통해 CpG-MCA 나노하이드로겔이라는 CpG 단위의 직렬 반복 시퀀스로 구성된 새로운 면역 DNA 나노하이드로겔을 구성했습니다. CpG-MCA 나노하이드로겔은 분해에 저항하고 쥐 대식세포 유사 RAW264.7 세포의 증식 및 이동을 증가시키는 것으로 입증되었습니다. 또한, CpG-MCA 나노하이드로겔은 종양괴사인자-α와 인터루킨-6의 높은 발현을 효과적으로 유도하고 U251 세포의 증식을 현저히 억제하여 CpG-MCA 나노하이드로겔이 강력한 항암 면역자극제로 활용될 것으로 기대된다. /P>

소개

메틸화되지 않은 CpG 모티브를 포함하는 박테리아 DNA는 매우 유망한 백신 보조제, 항알레르겐, 면역 보호제 및 항암제입니다[1]. 그것은 수지상 세포(DC), 대식세포, T 세포, 자연 살해(NK) 세포 및 NKT 세포와 같은 면역계 세포 내부의 엔도솜에 있는 수용체에 의해 인식될 수 있습니다[2]. 이러한 타고난 면역 세포는 병원성 미생물의 병원체 특이적 분자에 대한 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)의 인식을 통해 메틸화되지 않은 CpG 모티프에 반응할 수 있습니다. CpG 올리고뉴클레오티드(CpG-ODN)는 Toll-like receptor 9(TLR9)[3]에 의해 인식될 수 있고 Myd88 의존적 신호전달 경로[4]를 통해 Th1형 면역 반응을 유도할 수 있음이 확인되었습니다. 그러나 CpG-ODN의 이러한 단점은 단백질 흡착에 의한 조기 성숙, 혈청 내 엔도뉴클레아제에 의한 소화 [5] 및 생체 내 불안정성으로 인해 임상 적용을 방해했습니다. 이러한 문제는 단일 가닥(ss) 핵산을 전달체에 캡슐화하거나 나노 구조로 자가 조립되어 생체 내 안정성과 타고난 면역 세포에 대한 보다 효율적인 내재화 비율을 향상시켜 해결될 것으로 기대됩니다. 현재 CpG-ODN 전달에 양이온성 고분자 폴리에틸렌이민(PEI)[6], 리포솜[7, 8] 및 미세입자[9]와 같은 다양한 운반체가 사용되었습니다. 세포 독성, 제한된 로딩 속도 등과 같이 여전히 개선해야 할 몇 가지 단점이 있습니다.

핵산으로 구성된 DNA 물질은 CpG-ODN을 전달하는 운반체로 활용될 가능성이 크다. ssDNA와 비교하여 2차원 또는 3차원 구조의 DNA 물질은 세포막의 용이한 침투 및 사이토카인 분비를 위한 대식세포의 자극과 같은 상이한 특성을 나타낸다[10]. X-형 DNA는 CpG 모티브를 전달하고 증가된 세포 흡수에 의해 CpG-ODN의 면역 자극 활성을 성공적으로 증가시키는 데 사용되는 반면, 증가된 세포 흡수는 부분적으로 X-형 구조에 기인합니다[11]. 유사하게, 균일한 크기의 나노구조로 자가 조립될 수 있는 3차원 DNA 사면체는 비침습적이고 효율적으로 RAW264.7 세포에 입력되어 기능합니다. 또한, 이러한 사면체는 연구에 따라 기계적으로 안정하고 세포독성이 없는 것으로 입증되었습니다[12]. 최근 RCA(rolling circle amplification)를 통해 제조된 나노플라워 구조의 CpG-RCA 하이드로겔(CpG-RCA gel)은 면역 자극 신호 전달, 뉴클레아제 분해 저항, 면역 사이토카인 분비 증가, 인간 급성 림프구성 백혈병 T 림프구(CCRF-CEM) 세포의 증식을 억제합니다[13]. 이상의 결과는 DNA 물질의 형태와 구조가 세포 흡수를 증가시키고 면역 자극 효율을 높이는 데 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. CCRF-CEM 세포는 혈액 악성 종양의 일종인 인간 T 림프모구 백혈병에서 유래했기 때문에 혈액 악성 종양과는 달랐습니다. 고형 종양은 종종 유효한 항종양 면역을 방해할 수 있는 면역억제 미세환경으로 둘러싸여 있습니다[14]. 이를 위해 우리는 RCA[16]가 아닌 MCA(multi-primed chain amplification)[15]를 통해 훨씬 더 많은 CpG-ODN 사본을 포함하는 DNA 면역자극제를 제작했습니다. 상보적 염기쌍의 원리를 이용하여 CpG 관련 프라이머와 특별히 설계된 템플릿 서열을 리가아제에 혼합하고 유리 dNTP의 존재 하에 phi29 중합효소에 의해 확장시켰다. x에 대해 RCA(R) 또는 MCA(M) 반응 또는 y Rx 또는 My로 별도로 표시되는 시간(그림 1) 생성물은 아가로스 겔 전기영동으로 확인되었다(그림 2a). MCA 반응을 기반으로 CpG 모티브 사본의 큰 증가로 인해 수백 또는 수천 개의 탠덤 CpG를 보유하는 CpG-MCA 하이드로겔(CpG-MCA 겔)이라고 불리는 얻어진 제품. CpG-MCA 젤은 또한 RAW264.7 세포에서 사이토카인의 분비를 크게 증가시키고 인간 신경교종 U251 세포주의 증식을 효과적으로 억제하는 강력한 면역 자극제였습니다. 우리는 이 연구가 DNA 물질을 기반으로 한 새로운 나노하이드로겔 면역자극제에 전도성을 띠고 종양 면역치료에 대한 응용을 촉진할 것으로 기대했습니다[17].

<그림>

CpG-MCA 겔과 CpG-RCA 겔의 이미지. 아 CpG-RCA 겔(R12) 및 CpG-MCA 겔(R4M4 및 R4M8)의 아가로스 겔 전기영동 이미지. 레인 1, DNA MW 표준 마커 λ-Hind III 소화; 레인 2, R12; 레인 3, R4M4; 레인 4, R4M8, 레인 5, DL5000 DNA 마커. R12의 SEM 이미지(b ), R4M4(c ) 및 R4M8(d ). R12의 TEM 이미지(e ), R4M4(f ) 및 R4M8(g ). 검은색 눈금 막대는 3 μm입니다. 빨간색 눈금 막대는 1 μm입니다. 흰색 눈금 막대는 500 nm

입니다. <그림>

CpG-ODN, CpG-RCA 겔(R12) 및 CpG-MCA 겔(R4M4 및 R4M8)(100 nM CpG 등가물)로 처리한 RAW 264.7 세포의 공초점 현미경 이미지 및 평균 형광 강도. CpG-MCA 겔 및 CpG-RCA 겔은 세포 흡수를 위해 Cy5-dCTP를 추가하여 Cy5(빨간색)로 표시했습니다. Cy5로 표지된 CpG-ODN을 대조군으로 사용하였다. 아 2 시간 동안 배양한 후 RAW 264.7 세포에 의한 CpG-RCA 겔 및 CpG-MCA 겔의 공초점 현미경 이미지. ㄴ RAW264.7 세포에서 Cy5의 평균 형광 강도. 결과는 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SD로 표시됩니다. ****피 <0.0001

방법/실험

자료

모든 올리고뉴클레오티드는 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.에서 구입하고 고성능 액체 크로마토그래피로 정제했습니다. dNTP 세트(각 100 mM), phi29 DNA 중합효소(10 U/μL), 10× phi29 DNA 중합효소 반응 완충액(330 mM Tris-acetate(pH 7.9 at 37 °C), 100 0gmM M , 1%(v /v ) Tween 20, 10 mM DTT)는 Thermo Fisher Scientific(Waltham, MA, USA)에서 구입했습니다. T4 DNA 리가아제(400 U/μL), 5'-트리포사데닌(ATP) 및 10x T4 DNA 리가아제 반응 완충액(50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂ , 1 mM ATP, 10 mM DTT, pH 7.5 at 25 °C)는 New England Biolabs, Inc.(Ipswich, MA)에서 구입했습니다. Cyanine 5-dCTP는 PerkinElmer, Inc.(Waltham, MA, USA)에서 구입했습니다. Amicon Ultra-0.5 원심 필터 장치는 Merck KGaA(Darmstadt, Germany)에서 구입했습니다. 본 논문에 사용된 물은 Millipore Synergy UV Ultrapure 정수 시스템으로 정수하였다. Gibco 태아 소 혈청(FBS), Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM, 고포도당, L-글루타민, 페놀 레드, 피루브산나트륨 포함, HEPES 없음), 트립신-EDTA(0.25%) 및 페니실린(10000 U/mL)- 스트렙토마이신(10000 μg/mL)은 Thermo Fisher Scientific(Waltham, MA, USA)에서 구입했습니다. ELISA 키트는 R&D Systems, Inc.에서 구입했습니다. Cell Counting Kit-8(CCK-8)은 Dojindo(Kumamoto, Japan)에서 구입했습니다. 마우스 대식세포 유사 세포주(RAW264.7 세포)는 중국 과학 아카데미(중국 상하이)의 세포 은행에서 입수했습니다. 인간 신경교종 세포주(U251 세포)는 중국과학원(중국 상하이)의 세포 은행에서 입수했습니다.

원형 DNA 템플릿 준비

동일한 비율의 CpG-ODN 프라이머(프라이머 1)가 있는 5' 말단에 인산화된 기가 있는 긴 단일 가닥 DNA를 1x phi29 반응 완충액에서 혼합하고 95°C에서 5분 동안 어닐링한 다음 4°C로 천천히 냉각했습니다. 열 순환기(Bio-Rad T100, 독일)를 사용하여 - 1 °C/s의 속도. 어닐링 후, ATP 및 T4 DNA 리가제 반응 완충액이 포함된 20 U/μL T4 DNA 리가제를 첨가하고 4 °C에서 밤새 인큐베이션했습니다. 효소는 75 °C에서 10 분 동안 비활성화되었습니다.

CpG-MCA 젤 및 CpG-RCA 젤 준비

원형 DNA 주형(10 μL)을 1x phi29 DNA 중합효소 반응 완충액, 각각에 대해 4 mM dNTP와 혼합하고, 5 U phi29 DNA 중합효소 및 멸균 DDW를 추가하여 총 50 μL입니다. 혼합물을 12시간 동안 진탕하면서 30℃에서 인큐베이션하였다(R12). MCA 겔 형성을 위해 4시간의 RCA 반응 후 500pM의 프라이머 2 및 프라이머 3을 생성된 혼합물에 각각 첨가하여 추가 시약(R4M4 및 R4M8)을 추가하지 않고 나머지 시간 동안 30°C에서 인큐베이션했습니다. phi29 중합효소는 65°C에서 10분 동안 비활성화되었습니다. CpG-RCA 겔과 CpG-MCA 겔은 한외여과로 정제하였다.

CpG-MCA 겔 및 CpG-RCA 겔 농도

CpG-MCA 겔과 CpG-RCA 겔의 농도는 처리군의 모든 하이드로겔에 포함된 CpG 복사체의 수를 기준으로 측정하였다. 반응 시스템에 첨가된 dNTP는 각각 4 mM이었기 때문에 하나의 원형 주형에는 81개의 뉴클레오티드와 1개의 CpG 사본이 포함되었습니다. Abs가 260 nm 및 ε에서 dNTP의 흡광도인 경우 는 260 nm에서 dNTP의 소광 계수이며, 반응에서 소모된 dNTP를 측정하고 CpG의 총 사본을 다음 방정식으로 계산할 수 있습니다. CpG 사본 =(4 mM × 4 − Abs/ε × 1,000,000)/81 [13]. 복근 및 ε dNTP의 NanoDrop 2000c로 측정했습니다.

아가로스 겔 전기영동

아가로스 겔 전기영동은 CpG-MCA 겔의 형성 및 분해 및 원형 주형의 형성을 평가하는 데 사용되었습니다. 하이드로겔은 100 V에서 60분 동안 1% 아가로스 겔에서 실행되었고, 원형 템플릿은 60분 동안 100 V에서 3% 아가로스 겔에서 실행되었습니다.

CpG-MCA 겔 및 CpG-RCA 겔의 특성

투과 전자 현미경(TEM, Hitachi HT7700, Japan)을 사용하여 CpG-MCA 겔의 내부 구조와 대략적인 크기를 특성화했습니다. CpG-MCA 젤은 구리 위에 증착되고 건조되기 전에 30분 동안 초음파로 검사되었습니다. 테스트는 렌지 병원의 중앙 연구소에서 수행되었습니다. 주사 전자 현미경(SEM, Hitachi SU8020, Japan)을 사용하여 CpG-MCA 겔의 형태를 얻었다. CpG-MCA 젤은 깨끗한 실리콘 웨이퍼에 증착되기 전에 30분 동안 초음파로 검사되었으며 샘플은 Au로 금속 코팅되었습니다.

공초점 현미경 이미징

세포 흡수는 Leica 공초점 현미경으로 이미지화되었습니다. RAW264.7 세포를 공초점 배양 접시에 2 × 10⁵ 의 밀도로 시딩했습니다. 세포/mL. 인산염 완충액(PBS)으로 2회 세척한 후, 세포를 37°에서 2시간 동안 신선한 DMEM 배지에서 100nM Cy5 표지된 CpG-ODN, CpG-RCA 겔 및 CpG-MCA 겔과 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포를 PBS로 3회 세척하고 4% 파라포름알데히드로 30분 동안 고정한 다음 세포를 FITC-팔로이딘 및 Hoechst 33342로 염색했습니다. 모든 이미지는 Leica 레이저 공초점 현미경을 사용하여 촬영했습니다. 평균 형광 강도의 반정량적(semiquantitative)은 이미지 분석을 위한 Java 기반 애플리케이션인 Image J에 의해 계산되었습니다.

ELISA 분석

RAW264.7 세포는 7 × 10⁴ 의 밀도로 시딩되었습니다. 사용하기 전에 24시간 동안 배양된 24웰 플레이트의 세포/mL. 세포를 CpG-MCA 겔 및 기타 그룹의 존재하에 37℃에서 TNF-α의 경우 8시간 및 IL-6의 경우 24시간 동안 배양하였다; 상층액을 수집하였다. 상등액의 사이토카인 수준은 제조업체가 제안한 프로토콜에 따라 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 검출되었습니다.

유전자 발현 분석

유전자 발현 수준은 정량적 실시간 PCR(Q-PCR)에 의해 분석되었습니다. RAW264.7 세포는 1 × 10⁶ 의 밀도로 시딩되었습니다. 사용하기 전에 24시간 동안 배양된 6웰 플레이트의 세포/mL. 세포를 CpG-MCA 겔 및 기타 그룹의 존재하에 37°C에서 TNF-α 및 TLR9의 경우 2시간 동안, IL-6 및 기타의 경우 8시간 동안 배양하였다. mRNA의 분리 및 정제는 TRIzol Reagent(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 수행되었습니다. 추출된 mRNA는 NanoDrop 2000c에 의해 정량화되었습니다. 총 RNA의 1μg은 gDNA Eraser(Takara Bio Inc.)가 포함된 PrimeScript RT 시약 키트를 사용하여 역전사되었습니다. 제조사의 지침에 따라 TB Green Premix Ex Taq II(Takara Bio Inc)를 사용하여 총 반응 부피 20 μL에서 증폭을 수행했습니다. 유전자에 대한 프라이머는 다음과 같습니다:GAPDH:F:AGGTCGGTGTGAACGGATTTG; R:TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA; TLR9:F:ATGGTTCTCCGTCGAAGGACT; R:GAGGCTTCAGCTCACAGGG; TNF-α:F:GACGTGGAACTGGCAGAAGAG; R:TTGGTGGTTTGTGAGTGTGAG; IL-6:F:CCAAGAGGTGAGTGCTTCCC; R:CTGTTGTTCAGACTCTCTCCCT; CD86:F:GAGCTGGTAGTATTTTGGCAGG; R:GGCCAGGTACTTGGGCATT; CD206(MRC1):F:CTTCTGTTCAGCTATTGGACGC; R:CGGAATTTCTGGGATTCAGCTTC.

긁힌 상처 마이그레이션 분석

RAW264.7 세포는 5 × 10⁵ 의 밀도로 70 μL 접종했습니다. 사용 전 24 h 동안 배양 삽입물의 세포/mL. 그런 다음 삽입물을 조심스럽게 제거하고 세포를 두 번 세척한 후 각 그룹을 새로운 배지에서 처리했습니다. 사진은 0 h, 6 h 및 24 h에 수집되었습니다. ImageJ로 상처 부위를 측정했습니다. 각 그룹은 세 번 반복했고 실험은 세 번 반복했습니다.

세포독성 분석

CCK8을 사용하여 세포독성을 분석하였다. RAW264.7 세포를 96웰 플레이트에 접종하고 각 그룹으로 24시간 동안 처리했습니다. 그런 다음, 10 μL의 CCK8 용액을 각 웰에 첨가한 다음 37 °C에서 1-2 시간 동안 배양했습니다. 흡광도는 450 nm에서 측정하였고, 각 그룹은 3번 반복하였고, 실험은 3번 반복하였다.

RAW264.7 세포와 공동 배양된 U251 세포

RAW264.7 세포를 상부 챔버에 접종하고 U251 세포를 하부 챔버에 별도로 접종하고 처리 전 24시간 동안 배양했습니다. PBS로 3회 세척한 후, 새로운 배지의 1 μM GpC-ODN, CpG-ODN, CpG-RCA 겔 및 CpG-MCA 겔을 지시된 시간 동안 상부 및 하부 챔버에 첨가하였다. 하부 챔버의 U251 세포를 수집하여 플레이트 클로닝 실험을 수행했습니다.

판 클론 형성 분석

RAW264.7 세포와 공동 배양한 U251 세포 증식에 대한 효과를 플레이트 클로닝 실험으로 분석하였다. 하부 챔버의 U251 세포를 수집하고 6웰 배양 플레이트에서 최종 수 200개 세포/웰에 15% FBS를 함유하는 DMEM에서 여러 비율로 희석하고 클론 클러스터를 관찰할 수 있을 때까지 2주 동안 배양을 계속했습니다. 육안(50개 이상의 세포/클론). PBS로 부드럽게 세척한 후 세포를 4% 파라포름알데히드로 30분 동안 고정한 다음 크리스탈 바이올렛으로 1시간 동안 염색했습니다. 50개 이상의 세포를 포함하는 클러스터는 성공적인 클론 형성으로 계수에 포함됩니다. 실험은 세 번 반복되었고 각 실험에는 세 개의 반복 우물이 있었습니다:클론 형성 속도 =(클론 형성 수/접종된 세포 수) × 100%.

CpG-MCA 겔 및 CpG-RCA 겔의 안정성

동결건조된 CpG-MCA 겔 또는 CpG-RCA 겔을 각각 10% 소태아혈청(10% FBS-DMEM)을 함유하는 400μL DMEM에 넣고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 상층액의 DNA 농도는 1000 rpm에서 10초 동안 원심분리한 후 NanoDrop 2000c로 측정했습니다. 나머지 하이드로겔은 상등액의 DNA 농도에 따라 계산되었습니다. 남은 젤 =(m − ㄷ × V )/m × 100%, 여기서 m 는 우리가 추가한 젤 덩어리입니다. c 는 상등액의 DNA 농도, V 상층액의 부피이다. CpG-MCA 젤 또는 CpG-RCA 젤을 각각 10% FBS-DMEM 또는 PBS에 넣고 37 °C에서 12 또는 24 시간 동안 배양했습니다. 인큐베이션 후 겔을 1% 아가로스 겔에서 100 V에서 60분 동안 실행했습니다.

CpG-ODN

단일 가닥 CpG-ODN은 Sangon Company(중국 베이징)에서 합성하고 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 정제했습니다. 본 연구에 사용된 CpG-ODN은 CpG-ODN 1668[18]:5'-TCCATGACGTTCCTGATGCT이고 non-CpG 올리고뉴클레오티드는 GpC-ODN[18]:5'-TCCATGAGCTTCCTGATGCT로 명명되었습니다.

통계 분석

이 연구의 모든 데이터는 2개 또는 3개의 독립적인 실험에서 얻은 평균값 ± 표준편차(mean ± SD)로 표시됩니다. 서로 다른 그룹 간의 통계 분석은 학생의 t 테스트. 통계적 유의성은 P로 설정되었습니다. <0.05(95% 신뢰 수준).

결과 및 토론

DNA 면역자극제는 MCA 반응을 통해 성공적으로 구축되었다[16]. 이 반응에서 등온 증폭의 첫 번째 중요한 단계는 긴 단일 가닥(ss) 템플릿의 고리화 반응입니다(Scheme 1). 우리는 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 어닐링 및 프라이머로 결찰한 후 원형 DNA의 형성을 확인했습니다(추가 파일 1:그림 S1). template이 하나의 cycle이 되고 primer로 ligation된 후 구조가 변하기 때문에 primer와 long ssDNA template 사이의 이동 거리가 짧아졌습니다. MCA 반응은 일련의 반복 단위 문자열을 포함하며 연속 와인딩으로 인해 나노플라워의 출현을 쉽게 유도합니다(Scheme 1). 아가로스 겔 전기영동 결과는 RCA 반응(CpG-RCA 겔 또는 R12) 및 MCA 반응(CpG-MCA 겔 또는 R4M4/R4M8)의 생성물이 성공적으로 얻어졌음을 보여주었다(그림 1a). CpG-RCA 겔 및 CpG-MCA 겔은 아가로스 겔을 통해 이동하기 어려웠고 홈 위치에 유지를 유지했습니다. 두 젤 모두 너무 끈적해서 파이펫팅할 때 실크처럼 벗겨졌습니다(추가 파일 1:그림 S2A–C). 이러한 결과는 DNA 주형이 유리 dNTP로 기하급수적으로 증폭되어 하이드로겔을 형성함을 시사합니다[15]. 이동 거리는 CpG-RCA 겔과 CpG-MCA 겔 사이에 유의미한 차이가 없었다는 점을 언급할 가치가 있습니다. 또한, SEM 및 TEM 결과는 CpG-RCA 겔(도 1b, e) 및 CpG-MCA 겔(도 1c, d, f 및 g)의 직경이 나노 규모에서 마이크로미터 규모의 범위임을 추가로 보여주었다. 나노플라워의 형태를 보였다. CpG-ODN은 TLR9 양성 면역 세포로 내재화되고 면역 세포 내부의 엔도솜에 국한된 TLR9와 상호작용하여 면역 자극 활성을 실행해야 합니다. 이를 위해 Cy5 표지 CpG-ODN, CpG-RCA 겔, CpG-MCA 겔을 사용하여 공초점 현미경을 사용하여 RAW264.7 세포에서의 흡수를 조사했습니다. 도 2a에서 관찰된 바와 같이, Cy5로 표지된 CpG-MCA 겔은 RAW264.7 세포의 세포질에 효과적으로 내재화 및 분포되었다. 측정된 평균 형광 강도를 기반으로 CpG-MCA 겔의 흡수 효율이 크게 증가했습니다(P <0.0001) CpG-ODN(그림 2b)과 비교하여 CpG-MCA 겔의 효과적인 흡수를 보여 더 강력한 면역 자극을 발휘하는 데 유리합니다. 상이한 DNA 나노구조를 설계함으로써 마우스 대식세포 RAW264.7 세포에 의한 DNA 흡수가 증가된 것으로 보고된다. tetrapod-like 구조화된 DNA(tetrapodna), tetrahedral DNA(tetrahedron), tetragonal DNA(tetragon) [19]. 유사하게, X형 DNA, Y형 DNA 및 X-DNA 하이드로겔도 세포의 DNA 흡수를 증가시키는 것으로 입증되었습니다[20, 21]. 이러한 결과는 DNA의 고차 구조가 기능화된 DNA 단편을 전달하는 데 보다 효율적인 형태임을 시사했습니다. 따라서 우리는 겔 형성을 통한 CpG-MCA 겔 형태의 변화로부터 유래된 CpG-MCA 겔의 높은 세포 흡수율을 추측하였다. 그런 다음 CpG-MCA 젤의 안정성을 테스트했습니다. CpG-MCA 겔은 다양한 용액에서 37 °C에서 서로 다른 시간 동안 배양되었습니다. 아가로스 겔 전기영동 결과는 CpG-MCA 겔이 PBS 용액에서 상대적으로 안정했고 배지 관련 혈청에서 부분적으로 분해되었음을 보여주었습니다(추가 파일 1:그림 S3A). CpG-MCA 겔은 불완전한 분해를 시사하는 단일 밴드라기보다는 여전히 사다리처럼 보였다. 우리는 이후에 10% FBS-DMEM에서 겔의 안정성을 연구했습니다. TEM 결과는 CpG-MCA 겔이 부분적으로 소화되었고 더 이상 꽃처럼 보이지 않지만 여전히 모양을 유지한다는 것을 확인했습니다(추가 파일 1:그림 S2D–F). CpG-MCA 겔의 분해 곡선은 24 h 이내에 상등액의 DNA 농도를 감지하여 플롯되었습니다(추가 파일 1:그림 S3B). 10% FBS-DMEM에서 24시간 동안 배양한 후 R12는 거의 80%를 유지한 반면 R4M4와 R4M8은 거의 85%를 유지했으며 이는 아가로스 겔 전기영동의 결과와 일치했습니다. 겔의 분해를 확인하기 위해 CpG-MCA 겔을 37°C에서 최대 48시간 동안 혈청에서 배양하고 분해 생성을 아가로스 겔 전기영동에서 실행했습니다(추가 파일 1:그림 S4). 젤은 혈청 내 효소에 의해 조각으로 분해되어 점도를 잃고 단일 염기 조각이 되었기 때문에 더 이상 사다리처럼 보이지 않습니다. FBS). 따라서 CpG-MCA 겔은 24시간 이내에 혈청 소화에 효과적으로 저항하고 마침내 완전히 분해됩니다. 분해에 저항하는 높은 능력은 면역 자극 효율을 향상시키는 데 도움이 될 것입니다. RAW264.7 세포의 상층액에서 TNF-α와 IL-6의 발현 수준은 CpG-MCA 젤이 세포를 효과적으로 자극하여 면역 사이토카인을 생성할 수 있음을 분명히 보여주었습니다.

<그림>

CpG-MCA 겔 및 CpG-RCA 겔의 준비 및 세포 흡수에 대한 개략도. 5' 말단에 인산화된 그룹이 있는 긴 단일 가닥 DNA를 CpG 모티프로 구성된 프라이머와 혼합하고 먼저 어닐링하고 T4 DNA 리가제에 의해 연결하여 원형 주형을 형성했습니다. RCA 및 MCA 반응은 phi29 DNA 중합효소에 의해 수행되어 많은 양의 순차적 연쇄체 DNA를 생성하고 많은 나노플라워처럼 회전합니다. 젤은 대식세포에 의해 흡수되어 사이토카인의 분비를 자극할 수 있습니다.

CpG-MCA 겔의 면역 자극 효능을 추가로 평가했습니다. 우리는 RAW264.7 대식세포를 GpC-ODN(순서가 GACGTT 효과에서 GAGCTT로 변경됨), CpG-ODN, CpG-RCA 겔 및 CpG- MCA 겔화 후 TNF-α 및 IL-6의 발현을 감지했습니다. CpG-RCA 겔(R12) 및 CpG-MCA 겔(R4M4 및 R4M8)과 함께 8시간 동안 배양된 RAW264.7 세포의 상청액에서 TNF-α의 농도는 CpG-ODN보다 훨씬 더 높은 수준의 TNF-α를 유도했습니다. 동일한 처리 농도(그림 3a). CpG-MCA 겔의 경우 R4M4보다 R4M8이 더 높은 수준의 TNF-α 분비를 유도했습니다(P <0.001), 이는 카피가 증가함에 따라 TNF-α 분비가 증가함을 시사한다. 또한, R4M8은 유의하게(P <0.001) R12보다 더 높은 농도의 TNF-α는 총 반응 시간이 동일할 때 CpG-MCA 겔이 CpG-RCA 겔보다 더 강력한 자극제임을 나타냅니다. IL-6의 검출에서도 동일한 경향이 발견되었습니다(그림 3d). CpG-MCA 겔과 CpG-RCA 겔에 의해 자극된 IL-6의 분비는 유의하게 증가하였다. R12, R4M4 및 R4M8 그룹에서 IL-6의 분비는 2.97배(P <0.0001), 4.39배(P <0.0001) 및 27.81배(P <0.0001) 각각 CpG-ODN 그룹의 것입니다. R4M8 그룹에서 IL-6의 분비는 6.33배(P <0.0001) R4M4 그룹과 9.36배(P <0.001) R12 그룹에서 언급된 것. IL-6의 분비는 CpG-ODN, GpC-ODN 및 대조군 사이에 유의미한 차이가 없었다는 점은 언급할 가치가 있다. 이러한 결과는 CpG-ODN보다 CpG-MCA 겔을 처리한 RAW264.7 세포에서 더 높은 TNF-α 및 IL-6 방출 효율이 관찰되었음을 확인시켜 주었다. 또한, 농도가 다른 CpG-MCA 겔이 사이토카인 분비에 미치는 영향도 조사한 결과, 겔 농도에 따라 TNF-α와 IL-6의 분비가 증가함을 발견했습니다(그림 3b, e). non-CpG 겔(Fig. 3c에서 R12-C, R4M4-C, R4M8-C로 표시)과 GpC-ODN의 면역자극능 결과는 TNF-α의 분비를 거의 유도하지 않는 것으로 나타났다(Fig. 3c), CpG-MCA 겔에 의해 유도된 면역 반응은 CpG 모티브에서 비롯됨을 나타냅니다.

<그림>

ELISA-kit을 사용하여 CpG-ODN, CpG-RCA 겔 및 CpG-MCA 겔로 자극된 RAW264.7 세포에서 방출된 사이토카인의 검출. 아 RAW264.7 세포에서 TNF-α의 분비. ㄴ 다른 농도의 CpG-MCA 겔로 처리한 후 RAW264.7 세포에서 TNF-α의 분비. ㄷ CpG 겔 및 비 CpG 겔(R12-C, R4M4-C, R4M8-C)의 면역 자극 능력 검출. d RAW264.7 세포에서 IL-6의 분비. 이 다양한 농도의 MCA 겔로 처리한 후 RAW264.7 세포에서 IL-6의 분비. 결과는 두 개의 독립적인 실험의 평균 ± SD로 표시됩니다. **피 <0.01, ***P <0.001, ****P <0.0001

다음으로 사이토카인, 세포 표면 마커 및 TLR-9의 mRNA 발현을 테스트했습니다. CpG-ODN군의 TNF-α mRNA 발현은 대조군의 1.25배, R12, R4M4, R4M8군의 fold change는 3.28배(P <0.01), 2.53배(P <0.05) 및 4.57배(P <0.001) CpG-ODN 그룹에서 별도로 테스트했습니다(추가 파일 1:그림 S5A). CpG-ODN 그룹에서 IL-6의 mRNA 발현은 대조군의 1.01배였습니다. R12, R4M4 및 R4M8 그룹에서 IL-6 mRNA 발현은 3.87배(P <0.01), 4.63배(P <0.05) 및 23.04배(P <0.0001) 각각 CpG-ODN 그룹(추가 파일 1:그림 S5B)만큼.

세포 내부의 CpG 수용체인 TLR-9의 mRNA 발현도[4] 대조군에 비해 모든 군에서 증가하였으나, CpG-MCA 겔 군은 CpG에 비해 TLR-9의 mRNA 발현을 현저히 증가시켰다[4]. -ODN 그룹(추가 파일 1:그림 S5C). 사이토카인 및 TLR9 외에도 공동자극 분자(CD) CD86 및 CD206도 검출했는데, 이는 각각 전염증(M1) 및 성장 촉진(M2) 대식세포에 태그를 지정하는 데 사용되었습니다[23]. CD86 또는 CD206(추가 파일 1:그림 S5D, E)에서 CpG-ODN 그룹과 대조군 사이에 큰 차이가 없는 것으로 나타났습니다. CpG-RCA 겔 군과 비교하여 CpG-MCA 겔 군에서 CD86은 다양한 정도로 증가한 반면, CD206은 다양한 정도로 감소하였고, R4M8 군은 가장 많이 증감하였다. 이는 CpG-MCA 겔로 처리된 RAW264.7 세포가 CpG-MCA 젤의 면역 자극 능력을 더욱 입증한 CD86 표면 마커로 M1 집단으로 분화하는 경향이 있습니다.

대식세포로부터의 사이토카인 분비는 면역 자극 반응과 대식세포의 증식 및 이동에 매우 중요합니다. CpG-ODN을 사용한 대식세포의 자극은 TLR9 의존성 경로를 통해 항염증성 사이토카인의 생산을 증가시킬 것입니다. CpG-ODN에 의해 유도된 사이토카인은 세포주기 음성 조절인자의 발현을 하향 조절함으로써 대식세포의 이동을 증가시키고 대식세포의 증식을 촉진시킨다[24]. CpG-ODN은 또한 대식세포에서 플라스미노겐 활성제 억제제 1형(PAI-1)의 발현을 유도하여 비트로넥틴을 통한 이동을 증가시켰습니다[25]. 우리는 또한 CpG-MCA 겔이 대식세포의 이동을 촉진하고 세포 독성을 평가하는 능력을 조사했습니다. RAW264.7 세포의 이동은 트랜스웰 이동 시스템(그림 4a)과 스크래치 상처 이동 분석(그림 4b) 모두에서 CpG-MCA 겔에 의해 유도되었습니다. RAW264.7 세포를 CpG-MCA 겔의 존재 또는 부재하에 배양하고 24시간 동안 이동되도록 하였다. CpG-MCA 겔 그룹에서 대식세포의 이동 수는 CpG-ODN 그룹보다 훨씬 많았습니다(그림 4a). 그런 다음 스크래치 상처 이동 분석을 진행했습니다. 세포는 24 h 동안 이동하도록 허용되었고 사진은 0 h, 6 h 및 24 h에 캡처되었습니다. 결과는 상처가 치유됨에 따라 긁힌 부위가 감소함을 보여주었다. 6 h에서 대식세포의 이동은 상처 치유율이 높을수록 CpG-MCA 젤이 CpG-ODN 그룹보다 더 효과적임을 보여주었지만 R12, R4M4 및 R4M8 그룹 간에 뚜렷한 유의성은 없었습니다(추가 파일 1:그림 S6A, B). 그리고 24 h에서의 긁힌 부위는 CpG-ODN군에서 긁힌 부위의 치유율이 1.70배임을 확인하였다(P 대조군의 <0.05), R12, R4M4 및 R4M8 그룹의 치유율은 1.63배(P <0.001), 1.63배(P <0.0001) 및 2.23배(P < 0.0001) of that measured in the CpG-ODN group separately. The healing rate in the R4M8 group was 1.36 times (P < 0.01) of that in the R12 group. CpG-MCA gels strongly promoted the migration of RAW264.7 cells compared to that treated with the CpG-ODN or control groups (Fig. 4c). In addition, RAW264.7 cells were cultured with a series concentration of gels for 24 h. We found that the CpG-MCA gels exhibited a negligible cytotoxicity to RAW264.7 cells due to the non-toxicity of DNA itself; on the contrary, CpG-MCA gels could stimulate RAW264.7 cell proliferation with a dose-dependent effect, which was a benefit to enhance the production of immune cytokines (Fig. 4d).

The analysises of migration and cell viability of CpG-ODN, CpG-RCA gel (R12), and CpG-MCA gels (R4M4 and R4M8) in RAW264.7 cells. 아 The migration assay of RAW264.7 cells induced with CpG-ODN, R12, R4M4, and R4M8. ㄴ The migration assay of RAW264.7 cells stimulated with CpG-ODN, R12, R4M4, and R4M8 for 24 h. ㄷ The scratch area analysis in the scratch migration experiment. The percentages are calculated as the ratio of the original area. d The cell viability of RAW264.7 cells treated with CpG-ODN, R12, R4M4, and R4M8 for 24 h. Results are expressed as the mean ± SD of three independent experiments. **피 <0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001

For further verifying the inhibited efficiency of CpG-MCA gels for the proliferation of solid tumor cells, we estimated the inhibitory effects of CpG-MCA gels as immune stimulators for the U251 human brain glioma cells. The U251 cells was first co-cultured with RAW264.7 macrophages for 24 h, and the clone formation rate was used to check the proliferate ability of the U251 cells. As shown in Fig. 5a–f, the clone formation rate in the CpG-ODN group was 74.1% of that observed in the control group (P < 0.05), and the rates in R12, R4M4, and R4M8 groups were 45.4% (P < 0.01), 15.3% (P < 0.001), and 12.0% (P < 0.001) of that in the CpG-ODN group, respectively. The results demonstrated that the U251 cells treated with CpG-MCA gels presented a significantly lower percentage of clone formation rate compared with that treated with the CpG-ODN or control groups (Fig. 5g). It is notable that the trend of inhibitory results was in accordance with the secretion of TNF-α among groups, CpG-MCA gels exhibited a stronger effect on stimulating RAW264.7 cells to secrete cytokines to inhibit proliferation of U251 cells than CpG-ODN. Our research provided preliminary evidence to demonstrate the CpG-MCA gels have the potential to be used as an immunostimulant.

The assessment on the therapeutic effect of immunostimulatory CpG-RCA gel (R12) and CpG-MCA gels (R4M4 and R4M8) on cancer cells in vitro by plate clone formation assay. U251 cells treated with a none, b RAW264.7 cells, c RAW264.7 cells treated with CpG-ODN, d RAW264.7 cells treated with R12, e RAW264.7 cells treated with R4M4, and f RAW264.7 cells treated with R4M8. 지 Results of the proliferation percentage of U251 cells after co-cultured with RAW264.7 cells for 24 h. Results are expressed as the mean ± SD of three independent experiments. **피 <0.01, ***P < 0.001

Conclusions

In summary, we have successfully preparedCpG-MCA nanohydrogels that consist of hundreds of immunostimulatory CpG motifs to effectively deliver immune stimulus signal into cells and significantly induce the expression of immune cytokines. CpG-MCA nanohydrogels exhibited powerful anti-tumor immunity against human glioma cells, demonstrating that CpG-MCA nanohydrogels have the potential to be used as an immunostimulant for the therapy of cancer.

데이터 및 자료의 가용성

The datasets used and/or analyzed during the current study are available from the corresponding author on reasonable request.

약어

CpG-MCA gels:: CpG-MCA hydrogel
CpG-RCA gel:: CpG-RCA hydrogel
MCA/M:: Multi-primed chain amplification
R12:: CpG-RCA gel
R12-C, R4M4-C, R4M8-C:: Hydrogels not containing CpG motifs
R4M4, R4M8:: CpG-MCA gels
RCA/R:: Rolling circle amplification

화학적으로 환원된 홀리 산화 그래핀 박막 기반 가스 센서 CdS 나노구조의 표면 관련 여기자 및 레이징

나노물질