HepG2 간암 세포를 위한 NIR 조사 Cs0.33WO3 나노 입자의 온열 요법 고안

초록

온열요법은 비침습성, 부작용 및 독성 최소화, 시행 용이성으로 인해 암 질환을 치료하는 가장 환자 친화적인 방법 중 하나이며 광열 유발 용량 시스템과 같은 새로운 치료 방법의 개발을 촉진합니다. 여기에서 이 연구는 Cs_0.33의 광열 효과 변수를 조사합니다. WO₃ 시험관 내에서 HepG2 간암 세포주에 대한 나노입자(NP), 조사 기간, 광학 전력 밀도 및 NP 농도는 근적외선(NIR) 조사 열 용량의 공식화로 이어집니다. 명시적으로, 120nm의 입자 형상 크기를 갖는 NP는 일련의 산화-환원(REDOX) 반응, 열 어닐링 및 습식 분쇄 공정을 통해 합성되었으며 물리적, 구성적, 광학적, 광열적 특성의 후속 특성은 동적 광산란(DLS), 에너지 분산 X선 분광법(EDS), 주사 및 터널링 전자 현미경(SEM 및 TEM), X선 회절(XRD) 및 가시광선 근적외선(VIS-NIR) 광분광법. HepG2 세포에 대한 NP의 세포독성 및 조사 매개변수를 얻었다. 세포를 나노입자와 함께 배양하여 엔도사이토시스 상태를 확인하고 세포가 포함된 배양 접시의 배지 온도를 인체 온도 약 36.5°로 유지하면서 광열 선량의 가변 매개변수에 대한 세포 생존율의 의존성을 확인했습니다. 다.

소개

2018년 한 해 동안 전 세계적으로 흉포한 암 질환으로 인해 약 1천만 명이 목숨을 잃었고 약 1천 8백만 건의 새로운 사례가 추가되었습니다[1]. 지금까지 화학 요법, 방사선, 외과 적 제거 또는이 세 가지의 맞춤 조합이 치료 된 암 환자의 40 %를 약간 넘는 5 년 생존율의 개선을 설명하지만 [2, 3], 화학 물질 및 이온의 독성 및 해로운 특성 폭격은 필연적으로 탈모, 심장 독성, 불임, 염색체 이상 등과 같은 수많은 부작용을 야기합니다[4, 5]. 이러한 생명을 위협하는 결과는 나노입자가 포함된 화합물을 포함한 환자 친화적인 치료 의학의 개발을 강력하게 촉구했습니다.

100nm 미만의 크기에서 독특한 재료 시스템, 구조, 모양 및 원자 화학량론을 기반으로 하는 나노기술은 양자화 현상에 의해 강화된 전례 없는 화학적, 물리적 및 생화학적 특성을 산출하며 이미 많은 분야에서 전임상 및 시험관 내 응용을 발견했습니다. 생물 의학 [6, 7]. 화학요법의 단점에도 불구하고 전달체 역할을 하는 나노입자는 병든 종양에서 약물 방출의 선택성을 향상시키고 종양 세포의 약물 흡수를 촉진하며 건강한 조직의 누적 독성을 크게 감소시킵니다[8, 9]. 또한 일련의 NP 기반 이미징 방식으로 생성된 이미지 품질은 생체 분포를 밝히고 약물 흡수를 모니터링하며 종양을 국소화하고 치료 효능을 평가하기 위해 더 높은 감도, 더 미세한 공간 해상도 및 더 나은 깊이 침투로 크게 향상됩니다[10]. 진단 기능 외에도 NP는 RF(radiofrequency) 절제 또는 광열 온열 요법과 같은 고유한 물리적 특성과 함께 활용될 때 향상된 효율성으로 원하는 위치에 추가 손상을 유발할 수 있습니다[11,12,13]. 두 번째는 일반적으로 부위별 투여, 낮은 통증 정도, 낮은 부작용 및 조직 화상 위험 감소보다 선호됩니다.

지금까지 광조사시 고열을 유발할 수 있는 NP 물질계는 금(Au), 텅스텐산세슘(CsWO₃ ), 산화철, 황화구리, 그래핀 및 탄소관 등을 포함하고, 제자리에서 세포외 또는 세포내 온도를 상승시켜 암세포에 치명적인 손상을 가하는 적용 가능성을 입증하였다[14,15,16,17,18]. NP-enhanced RF-ablation과 마찬가지로 광자 소스의 입사 전력 밀도 수준은 임상 안전과 환자의 편안함에 중요한 문제이며[11], 인간 피부의 최대 노출 한계는 VIS 및 400~980nm 사이의 NIR 파장은 0.2~0.726W/cm² 입니다. 2013년에 발표된 국제 비이온화 방사선 보호 위원회(ICNIRP)에 따르면 [19]. 그럼에도 불구하고, 이전의 시험관 내 암세포 연구에서 보고된 대부분의 광학 전력 밀도는 피부 조직에 대한 안전 한계를 훨씬 넘어섰습니다. 취약성. 예를 들어 암 세포의 효과적인 파괴를 입증한 금(Au) NP의 NIR 광학 출력 밀도는 2~80W/cm² 입니다. 10분(분) 이하로 조사될 때 [13, 14, 20,21,22]. 유사하게, 그래핀 산화물[18], 철 백금(FePt)[23] 및 NaYF₄와 같은 다른 재료 시스템의 분류 :Yb,Er 나노결정 [24] 최소 150mW/cm² 필요 도구적 배포를 위해.

체외 실험을 위한 상대적으로 덜 탐구된 물질이기 때문에 몇몇 연구에서 NIR 조사된 CsWO₃에 의한 자궁경부암 세포(Hela)의 소멸이 보고되었습니다. 최소 0.72W/cm² 의 NP ICNRP가 설정한 NIR 파장의 피부 조직 노출 한계 부근에 있으며 장기간 노출되면 건강한 조직에 유해한 영향을 미칠 수 있다[15, 25, 26]. 또한, 과거 연구에서 NP 농도의 처리량, 광노출 시간 및 광강도의 조합에 의해 생성된 배양 배지의 온도는 건강한 인간 세포가 견딜 수 없는 40°C를 훨씬 초과했으며, 사망률이 암 세포의 세부 사항이 묘사되지 않았습니다.

CsWO₃ NP는 800nm에서 2400nm까지의 NIR 파장 범위에서 예외적으로 흡수하며[27] 생물의학 응용에 기능적으로 적합합니다. 암세포를 제거하는 탁월한 효능에도 불구하고 세포독성은 아직 많이 알려지지 않았으며 피부조직에 대한 안전한 광노출 한계 내에서 낮은 세포독성, 짧은 조사시간 및 광출력밀도의 NP 농도의 투여식 제공은 아직 부족합니다.

본 연구에서는 피부 조직의 광노출 한계 내에서 세포독성이 없는 NP 농도와 광출력 밀도를 잘 이용하여 직경 5.2cm의 페트리 접시에서 배양한 HepG2 간암 세포를 시험관 내에서 사멸시키는 가능성을 평가하고 유지하는 것을 시도합니다. 36.5°C의 정상 인체 온도에서 세포 배양 배지의 온도. 자세히 Cs_0.33 WO₃ 평균 피처 크기가 약 120nm인 NP는 일련의 산화환원, 열 어닐링 및 습식 분쇄 공정을 사용하여 합성되었으며 표면 형태, 결정도, 광학 및 시간적 광열 특성을 특징으로 합니다. 또한 중심 파장 980nm에서 작동하는 NIR 조사의 가변 선량 매개변수, 조사 시간, 나노입자 농도 및 광출력 밀도가 HepG2 암세포의 생존율에 미치는 광열 효과를 조사하여 다음과 같이 판단했습니다. 안전 치료 용량의 조합을 고안하십시오.

방법

본 연구에서는 인간의 원발성 종양에서 유래한 102세대 HepG2 간암 세포주를 NIR 조사된 집에서 만든 Cs_0.33에 의해 부과되는 세포독성을 평가하기 위한 실험 모델로 배양했습니다. WO₃ 피부 조직 노출에 대한 안전 한계 내에서 그리고 무독성 NP 농도에서 다양한 열 투여량의 치료 효능을 평가합니다.

C의 합성 _0.33 워 ₃ NP

그림 1의 왼쪽 패널은 세슘 텅스텐 산화물(Cs_0.33 WO₃ ) NP 소재. 간단히 말해서, 전구체 화학물질, ((NH₄ )₂ WO₄ )(Alfa Aesar, 99.9% 순도) 및 CsCl(Alfa Aesar, 99.9% 순도)을 100ml의 탈이온수에 개별적으로 용해한 다음, 250rpm의 속도로 일정하게 교반하면서 25°C에서 함께 혼합합니다. 1시간(hr) 동안 자기적으로 작동되는 스피너. 교반이 끝난 후, 혼합액이 담긴 비이커의 온도를 180℃로 조절하고 용액의 수분이 완전히 증발할 때까지 굽는다. 생성된 건조된 백색 분말은 Cs_0.33의 최종 전구체였다. WO3 소재. 칠러를 켠 상태에서 전구체 분말이 포함된 석영 보트를 고온로 튜브의 중앙에 로드하고 가열로 튜브 내부의 압력을 0.08torr로 가져왔습니다. 그 후 전구체는 H₂ 기체 조합의 유입과 함께 500°C 온도에서 가열됩니다. 및 N₂ , 산화환원 반응을 촉진하기 위해 분당 표준 입방 센티미터(SCCM) 90 대 10의 비율. 1시간 후 H₂ 유입구 가스가 꺼지고 N₂의 흐름 가스를 100SCCM으로 조정하고 1시간 동안 열처리를 위해 노의 온도를 800°C로 올립니다. 공정이 완료된 후 냉각기와 온도 조절로를 끄고 석영 보트를 주변 온도에 도달할 때까지 냉각하고 로 튜브에서 꺼냈습니다. 석영 보트에서 얻은 결과 짙은 파란색 분말은 마이크론(µ) 크기 Cs_0.33입니다. WO₃ 가루. 분체의 크기를 더욱 축소하기 위해 15g의 µpowder, 3.8g의 공중합체계 입자 응집방지 분산제, 10ul의 소포제 및 DI로 구성된 혼합 용액 150g 물을 준비하고 600g의 지르코니아 비드가 들어 있는 샘플 보울에 붓고 나노그라인더 장비(Justnanotech Co., 대만)의 챔버에 장착했습니다. 속도와 온도를 2400RPM(분당 회전수) 및 15°C로 설정하면 0.1mm ZrO₂로 µpowder를 분쇄하여 NP가 생성됩니다. 4시간 동안 비드, 0.05mm ZrO₂ 사용 추가 4시간 동안 구슬. 과도한 유체 점도와 재료의 물리적 크기의 불규칙한 변화를 방지하기 위해 각 연삭 공정의 총 시간은 4시간을 초과하지 않습니다. 모든 후속 특성화 및 실험을 위해 분쇄 공정 후 최종 용액을 0.22μm 기공 필터를 통해 체질했습니다. Cs_0.33의 형광 버전 WO₃ NP(fNP)는 다음 프로토콜을 사용하여 만들었습니다. 28mg/ml 농도의 플루오레세인 2ml와 Cs_0.33 2ml로 구성된 용액 WO₃ 1.5 mg/ml의 NP 용액을 비이커에 준비하고 초음파 진탕기의 그릇에 15분 동안 두었습니다. 이어서, NP 용액과 분산제를 1:1.25의 비율로 혼합하고 15분 동안 초음파 진탕을 하였다. 그 다음 생성된 용액을 D.I. 10,000rpm에서 15분 동안 원심분리합니다. 사용하기 전에 두 번 반복합니다.

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물질 합성, NP를 사용한 세포 배양 및 암세포에 대한 광열 분석을 위한 실험 절차의 개략도. BCL, TEn 및 PD는 각각 양면 오목 렌즈, 열 인클로저 및 페트리 접시의 약어입니다. 빨간색 화살표는 빔 프로파일 측정 위치를 나타냅니다.

재료 특성화

이후 Cs_0.33의 특성화 WO₃ NP의 통계적 특징 크기, 결정 구조, 구조적 형태, 윤곽 형상, VIS-NIR 광 흡광도를 포함한 NP는 제타 전위 분석(ZS90, Malvern, UK), XRD(D2 Phaser, Bruker AXS GmbH, 독일), SEM을 사용하여 수행되었습니다. (SU-5000, Hitachi, Japan) 내장 에너지 분산 분광법(EDS), TEM(JEM-2100F, JEOL, 일본), 동적 광산란(DLS)(Delsa Nano C, Beckman Coulter, 미국) , UV–VIS–NIR 분광계(V-750, Jasco, Japan). XRD 스펙트럼은 분당 4°의 스캔 속도로 20°에서 80°의 각도 범위 내에서 샘플에 대해 X선을 스캔하여 획득했습니다. 시료의 스캐닝 각도 의존적 회절 신호를 측정하고 Cs_0.32의 표준 XRD 스펙트럼과 비교했습니다. WO₃ 분말 회절 표준 공동 위원회(JCPDS) 카드 번호 83-1334. NP의 광열 특성의 시간적 의존성을 확인하기 위해 980nm 파장의 NIR 레이저와 온도 측정 프로브로 구성된 간단한 실험 장치를 설정하여 NIR이 조사된 용액에 의해 생성된 온도 상태를 조사했습니다. 검사 솔루션에는 D.I. 물로 희석한 NPs 용액과 세포 배양 배지의 NPs 용액의 혼합물. 배양 접시의 시료용 광학 빔의 직경은 배양 접시의 전체 표면을 덮도록 확장되어 0.05W/cm² 를 생성합니다. 예상 광출력 밀도, 그렇지 않으면 2W/cm² 에서 그대로 유지됨 . 그림 1의 오른쪽 패널에 표시된 광학 설정은 NIR 조사를 수행하는 데 사용됩니다. 광학 시스템의 핵심에는 빔 직경을 4mm에서 5.2cm로 확장하는 양면 오목 렌즈를 향한 NIR 레이저 빔이 있습니다. 이는 36.8°로 설정된 핫 플레이트에 놓인 페트리 접시의 표면 직경과 동일합니다. 세포 성장을 위한 생리학적 온도인 C; 또한 페트리 접시는 주변 환경과 배지의 온도를 평형화하는 데 도움이 되는 플라스틱 원통형 인클로저로 둘러싸여 있습니다. 추가 파일 1:그림 S1은 그림 1의 레이저 빔 옆에 빨간색 화살표로 표시된 빔 조리개 출구에서 측정된 NIR 레이저 빔의 광 강도 매핑을 보여줍니다. 빔 프로파일은 3D 분포를 나타냅니다. 광학 강도를 측정하고 페트리 접시의 전체 개구부에 걸쳐 조명 필드의 균일성을 확인합니다.

세포독성 및 광열 분석

세포 배양 주기를 시작하기 위해 Ham's nutritional mixture F-12 및 Dulbecco's Modified Eagle's essential medium(HDMEM) 440ml로 구성된 배지 용액 500ml, 태아 소 혈청(FBS) 50ml, L-글루타민 5ml 기공 크기가 0.22μm인 메쉬 필터로 멸균된 P/S(Penicillin-Streptomycin) 5ml를 준비했습니다. 8ml 및 2ml의 배지로 채워진 직경 10cm 또는 5.2cm의 세포 함유 페트리 접시를 1차 및 2차 배양에 사용하고 5% CO2로 조절된 배양기에서 배양했습니다. 하위> 37 ºC의 온도에서. 2일에 1회씩 세포 성장 관찰 및 배양액 재생을 실시하였다.

(1) 외부 입력이 없는 대조군, (2) 단독 NIR 조사, (3) NP와 배양, (4) 여파 NIR 조사와 함께 NP와 배양을 포함하는 세포 분석의 경우 생존율을 얻기 위해, 배양접시 안의 배양액을 빨아내고 트립신 0.4ml를 배양접시에 넣고 인큐베이터에 약 10분간 두었다. 접시 벽에서 세포의 박리가 확인되면 배양 접시에서 세포가 포함된 배지 10μl를 빼내고 미세 원심 분리 튜브에 있는 트리판 블루 용액 10μl를 첨가하고 몇 가지를 통해 잔류 부유 NP를 제거했습니다. 인산완충액(PBS)으로 세척하는 횟수. 그 후, 주입구를 통해 10μl의 염색된 세포 용액을 계수판에 채우고 세포를 계수하여 세포를 실체현미경의 초점면에서 관찰하고 수동 계수기로 계수할 수 있다. 세포 생존율과 관련하여 모든 수치에 표시된 각 데이터 포인트는 3회의 실험의 평균이었습니다(N =3) 표준편차의 여백을 더한 것입니다.

NP의 세포 독성 및 세포 생존율에 대한 광열 효과의 평가를 준비하기 위해 5.2cm 접시의 배지를 제거하고 새로운 배지에 적절한 양의 NP 용액을 다시 채워 테스트 농도의 배열을 만들고, 2 mg/ml, 1.5 mg/ml, 1 mg/ml 및 0.5 mg/ml을 첨가한 후 실험 하루 전 배양

광열 분석 전에 세포 독성 평가를 수행하여 NP 농도 배열에 대한 세포의 반응을 조사했으며 다음과 같이 수행했습니다. 세포와 NP를 포함하는 배지를 인큐베이터에서 꺼내어 흡인하였다. 미리 예열된 PBS 1ml를 사용하여 암세포를 세척하고 부유하는 CsWO₃ 잔류물을 빨아들였습니다. 엔도사이토시스를 거치지 않은 NP는 잠재적인 세포 사멸이 새로운 배지에서 NP로 인한 온도 상승으로 인해 발생하지 않도록 여러 번 반복됩니다. 광열 처리 후 세포에 대한 세포 독성 및 광열 분석을 위해 계수 절차를 수행했습니다.

<섹션 데이터-제목="결과">

결과

Cs_0.33의 흡광도 및 광열 특성 WO₃ 나노 물질은 결정 구조, 풀림 후 온도, 원자 화학량론 및 입자 형상 크기에 크게 의존합니다[28, 29].

Cs_0.33의 표면 형태를 특성화하려면 WO₃ µpowder, 10,000X 배율의 SEM 이미지는 그림 2a에서 빨간색 화살표로 표시된 원주형 육각형의 상징적 구조를 시각적으로 확인하기 위해 획득했습니다. 또한 TEM 이미지는 특징 크기가 약 1μm 이하인 그림 2b에서 µpowder 과립의 윤곽 모양과 특징 크기를 나타냅니다. NP의 막대 모양 기하학과 120nm를 중심으로 하는 나노 스케일 피처 크기의 DLS 분포 히스토그램도 확인되었으며 그림 2c 및 해당 삽입 TEM 이미지에 표시됩니다. 또한 XRD가 있는 µpowder 및 NP의 결정질 특성이 그림 2d에 나와 있습니다. 상단 패널에 있는 µpowder의 XRD 스펙트럼에서 볼 수 있듯이 (002), (102), (200), (112), (202), (212), (004), (220)을 따라 결정화의 상징적인 평면을 볼 수 있습니다. ), (222), (204), (400) 및 (224)는 Cs_0.32의 표준 스펙트럼과 잘 일치합니다. WO₃ 분말 회절 표준 공동 위원회(JCPDS) 카드 번호 83-1334. µpowder의 기능 크기가 120nm로 감소하면 모든 회절 피크의 강도가 단조롭게 감소하고 평면 (102) 및 (220)과 같이 강한 NIR 흡수를 나타내는 일부 특성 피크는 스펙트럼에서 보이지 않게 왜소해집니다. 마찬가지로, 그림 2e에 표시된 세슘(Cs), 텅스텐(W) 및 산소(O)의 원자 구성 요소 식별은 원자 존재를 확인할 뿐만 아니라 Cs 대 W의 원자 백분율 비율인 0.315를 인증합니다. , 초기에 설계된 화학량론과 매우 유사합니다.

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물리적 및 물질적 특성화. 아 검색엔진 마케팅 및 b µpowder의 TEM 이미지, c NP 기능 크기의 DLS 분포 히스토그램, d µpowder 및 120nm NP의 XRD 스펙트럼 및 e 원자 구성의 백분율과 함께 EDS 스펙트럼이 표시됩니다. a의 눈금 막대 , b , ㄷ 각각 1.5μm, 200nm, 100nm

재료 특성화 상단에서 NP의 광학 흡광도 스펙트럼과 온도의 시간 경과에 따른 광열 변조가 측정되었으며 그림 3에 나와 있습니다. (a, b)에서 NIR 흡광도의 의존성과 NIR에 의해 유도된 온도 상승 프로파일 - 조사된 NP 용액은 NP 농도의 함수로 묘사되며, 예를 들어 1mg/ml의 시간 경과에 따른 온도 플롯은 최고 40°C이고 최소 1시간 동안 꾸준히 유지되어 재료의 광열 안정성과 내구성을 확인합니다. . 마찬가지로, 그림 3c의 시간 경과에 따른 온도 프로파일은 190분 이내에 5회의 반복 주기를 보여 NP 재료의 광열 응답성을 확인합니다. 그림 3d에서 배양기에서 꺼낸 배양액과 NP가 첨가된 배양액의 시간적 온도 프로파일은 핫플레이트에 올려놓고 근적외선 조사를 하여 10분 동안 약 37°C에서 안정화되고, NIR 조사된 순수 NP 용액의 온도는 10분 후에 24.6°C에서 33.6°C까지 상승합니다. 이에 따라 나노입자의 광열 기능을 고려하여 다음 실험을 위한 근적외선 조사를 10분, 30분, 60분 동안 수행하여 실험 기간 동안 나노입자의 견고성을 유지하고 전임상 연구에 적용할 수 있습니다.

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광학 및 광열 특성. 아 b에서 NIR 조사된 NP 용액의 광학 흡광도 스펙트럼 및 시간 경과 온도 프로파일 , ㄷ 큐벳 및 d 페트리 접시가 그려져 있습니다. Ex는 빔 확장 케이스의 프로파일을 상징합니다. NP 농도 1.5mg/ml 및 광출력 밀도 50mW/cm² (d에 사용됨 ); c에서 주기당 NIR 조사 기간 15분입니다.

이어서, 50mW/cm2에서 1시간 및 2시간 동안 세포를 조사하여 NIR 조사 기간 및 NP 농도를 포함하는 실험 매개변수의 무독성 용량을 결정했습니다. 및 0.5 mg/ml, 1 mg/ml, 1.5 mg/ml 및 2 mg/ml 농도의 NP와의 직접적인 상호작용을 통해 각각 그림 4a, b에 표시됩니다. NIR 조사 2시간 동안 세포 생존율이 95%를 훨씬 초과하여 980nm 광자에 장기간 노출된 세포의 무독성과 1.5mg 미만의 무독성 NP 농도를 확인했습니다. /ml가 결정되었습니다.

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실험 매개변수의 세포독성 분석. a를 투여했을 때 HepG2 세포의 생존율 NIR 조사 기간, b 다양한 농도의 120nm NP가 제시됩니다. NP 배양 기간은 하루였습니다. 세 가지 실험 시도의 표준 편차(N =3) 각 데이터 포인트에 대해 표시됨

HepG2 세포에 대한 피해가 거의 없는 1.5 mg/ml 이하의 암세포를 투여하는 목적은 NP 고유의 독성을 내포하지 않고 광열선량이 암세포에 미치는 영향을 조사하기 위함입니다. 근적외선 조사된 나노입자가 암세포를 제거하는 실행 가능한 솔루션인지 확인하기 위해 세포를 1.5mg/ml의 나노입자와 함께 하루 동안 배양한 다음, 1시간 동안 근적외선 조사에 가했습니다. 그림 5d-f의 명시야(BF) 광학 이미지에서 볼 수 있듯이 노출 시간이 1시간(e) 또는 2시간(f) 지속되면 세포 수가 명확하게 감소합니다. 양적으로는 조사 시간이 10분에서 증가함에 따라 생존율이 84.2%에서 58.4%로 단조 감소합니다. ~ 1시간, 그리고 선형 추세선이 흩어져 있는 데이터 포인트 사이에 잘 맞아 조사가 2시간 동안 지속될 때 생존율의 20%를 예측합니다. 또한 그림 5h는 1시간의 조사에서 광출력 밀도가 12.5에서 50mW/cm2로 증가함에 따라 생존율이 73%에서 58%로 감소함을 나타냅니다. , 암세포 파괴의 광열 촉발제로서의 NIR 조사 NP의 기능 확인.

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광열 분석. NIR 조사와 함께 1.5mg/ml의 NP 농도를 투여했을 때 HepG2 세포의 생존율입니다. a의 각 눈금 막대 –ㄷ 상단 및 d –f BF 광학 이미지의 하단 행은 200μm 및 100μm입니다. 세 가지 실험 시도의 표준 편차(N =3) 각 데이터 포인트에 대해 표시됨

또한, 이러한 광열 작용이 세포 내 또는 세포 외 방식으로 발생했는지 여부에 대한 불확실성은 fNP를 준비하고 동일한 세척 및 배양 절차를 수행하고 fNP의 세포 내 존재를 관찰함으로써 해결되었습니다. 그림 6은 공초점 BF(b, e) 및 형광(a, d) 이미지와 fNP 없이 배양된 세포의 중첩된 합성물(c, f)을 보여줍니다. 분명히, 대조군으로 fNP를 배양하지 않은 세포는 무시할 수 있는 녹색 형광을 나타내며, 이는 주로 세포 자가형광에 기인하며, 녹색 형광의 분포가 이미지에서 발견되는 모든 세포질 내 편재하는 실험과 뚜렷한 대조를 이룹니다. 대조군 및 실험 샘플의 이미지에서 평균 형광 강도도 정량화되었으며 엔도사이토시스를 거친 fNP의 형광이 대조군보다 9배 이상 강한 그림 6g의 히스토그램에 표시됩니다.

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광학 공초점 이미지. 아 , d 형광, b , e BF 및 c , f 상응하는 실험군 및 대조군으로서, fNP와 함께 배양된 HepG2 세포와 없이 배양된 HepG2 세포의 합성 광학 이미지는 a에 제시되어 있습니다. –ㄷ 상단 및 d –f g 옆의 맨 아래 행 평균 형광 강도의 히스토그램. 축척 막대는 20μm를 나타냅니다. 레이저 여기 파장은 488nm입니다.

토론

전자파를 이용한 온열요법의 개념은 이미 1900년대 초반으로 거슬러 올라가 일부 악성종양의 퇴치에 성공했으나 발열항균제의 유용성과 정밀한 치료의 부재로 인해 시들해졌다. 현장에서 관심 있는 국소 종양에 대한 접근성 [30]. 1980년대가 되어서야 암세포에 치명적인 영향을 미치는 온열 치료 후 대사 변화, 종양 미세 순환의 변화 및 산분해의 많은 측면을 발견한 여러 시험관 내 연구로 관심이 되살아났습니다[31]. 기계적으로, 적용 온도가> 42°C일 때 암세포가 괴사를 일으키고 세포자멸사가 감소하는 직접적인 세포독성 외에도 낮은 냉각 능력 및 낮은 pH(<6.8)와 관련하여 혈류 속도가 감소하여 암세포가 가열 및 결과적으로 더 높은 세포 사멸률 [32, 33]. 그러나 임상적으로는 부정확한 비특이적 국소화의 한 세기 동안의 결점으로 인해 온열 요법은 화학 요법 또는 방사선 요법과 동시에 적용될 때에만 향상된 치료 효능을 발견했습니다[34, 35].

정밀한 표적화 및 모니터링을 가능하게 하고 표면 전하, 형광, 광열 변환과 같은 광범위한 물리적 특성을 갖는 NP 기반 재료는 온열 요법 응용 분야에서 이러한 부정확성의 틈새에 잘 맞습니다. 그러나 암세포 연구에서 많은 근적외선 조사 나노입자 물질의 유용성이 입증되었음에도 불구하고 CsWO의 경우와 같이 광노출의 안전 한계가 잘 조사되지 않는 경우가 많습니다₃ NP. CsWO₃ 그러나 그림 4b에서 볼 수 있듯이 NP는 임계값이 1μg/ml인 Ag, Au, 그래핀과 같은 소수의 인기 있는 NP 물질과 비교할 때 1.5mg/ml로 상대적으로 낮은 세포독성을 보입니다. 18, 36, 37], 여전히 0.7W/cm² 필요 800nm~2400nm의 파장 범위에서 강력한 NIR 흡수에도 불구하고 Hela 세포를 효과적으로 파괴합니다[15, 25, 26].

이 연구는 효과적인 NIR 조사 트리거 Cs_0.33을 고안하고자 합니다. WO₃ 피부 조직에 대한 NIR 노출 한도 내에서 NP 농도, 조사 지속 시간 및 광학 출력 밀도의 함수로서 시험관 내 HepG2 암세포에 대한 NP 기반 열 투여 공식.

실험은 NP 합성으로 시작되며 산화환원 반응, 어닐링 공정 및 습식 분쇄 방법을 포함한 단계별 합성 절차가 그림 1에 요약되어 있습니다. 산화환원 반응은 큰 삼원 원소(이 경우 Cs)를 다음과 같이 통합합니다. WO₆의 팔면체 구조의 고리 적절한 물리적 환경에서 독특한 결정 구조를 형성하고 금속 분자 화합물에 자유 전자를 결합할 수 있으며, 이는 NIR 흡수 시 강한 광열 변환의 본질적인 이유입니다[26, 27]. 또한 후속 어닐링 및 습식 분쇄 공정은 결정 형성을 개선하고 NIR 광열 변환을 더욱 향상시키는 미립자 형상 크기를 줄이는 데 도움이 되었습니다. 그 후 합성된 NP 솔루션은 NIR 흡수의 중요한 최적화인 120nm의 평균 기능 크기를 확인하고 원자 구성을 인증하는 일련의 물리적 및 재료 특성화를 진행했습니다(그림 2). 또한 0.5mg/ml, 1mg/ml 및 1.5mg/ml에 대한 제타 전위의 해당 측정값은 -53.2mV, -54.3mV, -60.1mV입니다. 일반적으로 endocytosis 과정은 대부분의 NP 유형에 대한 주요 진입 경로이며 non-phagocytic 세포에 대한 양이온 및 이온 NP의 흡수율은 중성 개체보다 높지만 전자가 후자보다 더 우수합니다[38]. 또한 많은 이전 보고서에서 음전하를 띤 NP가 비 식세포에 덜 독성이 있음을 발견했습니다[39, 40]. 이는 낮은 독성을 동반한 광열 선량에 대한 과도한 세포 내 NP 축적을 고려할 때 유익한 장점입니다.

To set up a tone for the photothermal assay upon the HepG2 cells, the assessment of the NPs' robustness as a photothermal heater, its long-term stability at saturated temperature in equilibrium with the ambient environment over an hour and the repeatability for 5 consecutive cycles within 3 h were demonstrated (Fig. 3b, c). Also, to quantify the effectiveness of the NP's hyperthermia per se in dosing the cancer cells by ruling out the influence of ambient temperature (nominally at 25 °C), a calibration of the experimental apparatus was implemented by setting a hotplate to 37 °C, atop which all cell assays were carried out, and the temporally photothermal characteristics of the pure culture medium and NP-incorporated culture medium remained at 37.1 °C (Fig. 3d). Thereafter, the dependence of cytotoxicity on the duration of irradiation and NP concentration was examined separately and is presented in Fig. 4 indicating less than 5% of cell killing for over 2 h of NIR-irradiation and 1.5 mg/ml as the pivotal point toward lethal concentration. By fixing the NP concentration at 1.5 mg/ml, which was used throughout the rest of photothermal assay, the thermal dose for medical hyperthermia was defined as functions of variable dosing duration and optical power density. Figure 5 illustrates the action of cell killing with low (a–c) and high (d–f) magnification when NIR-irradiation for 0 h, 1 h and 2 h was implemented, the seemingly reduced number in the cells reflects well the quantitative analysis of cell survival rate as shown in (g), and the linear trend line predicts 80% of cell death for 2 h of irradiation. Likewise, the decrease in cell survival rate upon the incremental optical power density is also demonstrated in (h). Lastly, as clearly depicted by the BF, fluorescence and superimposed composite images in Fig. 6, in which a histogram of fluorescence analysis was presented, the endocytosis of the fNPs was verified.

결론

In summary, this study presents material synthesis and characterization of Cs_0.33 WO₃ NPs, examines in vitro cytotoxicity assays of the direct NPs interaction, and separately, with NIR irradiation, and proves the endocytosis of the NPs as well as effectiveness of the NIR-irradiated NPs upon destructing the HepG2 cancer cells. Moreover, this study suggests a combinative dose of the NIR-irradiated Cs_0.33 WO₃ NPs solution for the HepG2 cancer cells, 1.5 mg/ml of NP concentration, the duration of irradiation between 30 min. to 1 h, and optical power densities of NIR irradiation under 50 mW/cm² which is well below the safety NIR exposure limit for skin tissue while allowing cancer cell mortality rate close to 40% and may be potentially applicable to the development of patient-friendly and personalized medicine. Such studies in a clinical setting will require additional measures like surface modification with molecules that recognize surface receptors of specific cancer cell types.