초소형 초상자성 산화철 나노입자, 파킨슨병 줄기세포 추적에 활용

요약

파킨슨병(PD)은 중뇌 도파민 신경세포의 점진적 손실이 특징이며, 줄기세포 이식 방법이 치료에 유망한 전략을 제공합니다. 이러한 연구에서 이식된 세포의 생체 내 생물학적 거동 추적은 줄기세포 기능의 기본적 이해와 임상적 효과 평가에 필수적입니다. 본 연구에서는 열분해 법과 2단계 수정을 통해 폴리아크릴산(PAA)과 메톡시폴리에틸렌글리콜아민(PEG)으로 코팅된 새로운 초소형 초상자성 산화철 나노입자(USPIO-PAA/PEG NPs)를 개발했습니다. USPIO-PAA/PEG NPs는 TEM과 FTIR에서 보인 바와 같이 10.07±0.55nm의 균일한 직경과 해당 리간드의 적절한 흡수 피크를 가집니다. MTT 분석 결과 USPIO-PAA/PEG NPs와 배양된 세포 생존율이 96% 이상으로 유지되었습니다. 합성된 USPIO-PAA/PEG는 84.65 s⁻¹ Mm⁻¹의 우수한 이완율을 보여 MRI로 효율적으로 섭취 및 추적될 수 있음을 나타냈습니다. 또한 일차 인간 지방유래 줄기세포(HADSCs)를 특성화하고 USPIO-PAA/PEG로 표지해 6-하이드록시도파민(6-OHDA) 유도 PD 쥐 모델 선조체에 이식했습니다. 표지된 세포는 이식 수술 후 최대 3주까지 MRI로 추적 가능했으며, 표지된 HADSCs 이식은 PD 모델에서 아포모르핀 유도 회전 행동을 유의하게 완화시키고 흑질(substantia nigra) 도파민 신경세포 수를 증가시켰습니다. 전반적으로 USPIO-PAA/PEG NPs 개발은 세포 치료의 생체 내 추적 기술에 유망한 도구를 제공하며, 치료 잠재력을 가진 줄기세포를 추적하는 새로운 전략을 제시합니다.

서론

파킨슨병은 중뇌 도파민 신경세포의 점진적 손실이 특징인 신경퇴행성 질환입니다. 비교적 국소적인 손상으로 인해 세포 기반 치료의 좋은 후보가 됩니다. 태아 중뇌 조직[1]부터 배아줄기세포(ESC) 또는 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 유도 뉴런[2]까지 여러 세포 유형이 PD 치료에 관여해왔으나, 적용 과정에서 윤리적 우려와 종양 발생 잠재적 위험을 피할 수 없었습니다[3]. 중간엽줄기세포(MSC)는 지난 10년간 PD를 포함한 신경퇴행성 질환에 유망한 치료 도구로 보고되었습니다[4,5]. 다른 세포 유형에 비해 MSC는 우수한 증식력, 인체 전반에 걸친 광범위한 가용성, 면역억제 능력을 보입니다. 일부 연구에서 두개내 MSC 이식이 신경보호, 뉴런 분화, 면역조절을 촉진함이 입증되었습니다[6,7,8]. 이러한 연구에서 이식된 세포의 생존, 이동, 통합을 생체 내 추적하는 것은 줄기세포 기능의 기본적 이해와 임상적 효과 평가에 필수적입니다.

이식 세포 치료 효과를 더 잘 분석하기 위해 다양한 추적자가 개발되었습니다. 추적자의 안전성과 효능은 적용에 영향을 미치는 가장 중요한 요소입니다. 형광 단백질 표지[9]와 비교해 초상자성 산화철(SPIO) 입자 추적은 이식 세포에 유전적 변형을 주지 않습니다[10,11,12]. 여러 연구에서 SPIO를 효과적 조영제로 사용해 이식 세포를 시각화하고 추적했습니다[6,13,14]. 그러나 일부 상용 SPIO가 MSC 정상 기능에 영향을 미친다는 보고가 있어[15,16,17], 새로운 SPIO 개발에 광범위한 노력이 기울여졌습니다. 본 연구에서는 폴리아크릴산(PAA) 코팅 초소형 SPIO 나노입자(USPIO)와 후속 메톡시폴리에틸렌글리콜아민(PEG) 층을 합성했습니다. 새로운 USPIO-PAA/PEG는 in vitro와 in vivo에서 우수한 세포 내재화와 장기 MRI 추적 능력을 보입니다. 또한 USPIO-PAA/PEG 표지 인간 지방조직 유래 MSCs(HADSCs)는 생물학적 특성을 유지하며 PD 동물 모델에서 행동 장애 개선과 흑질 TH 면역반응성 증가를 보였습니다.

재료 및 방법

재료

철 아세틸아세토네이트, TREG(트리에틸렌 글리콜), 디에틸렌 글리콜, PEG는 Aladdin Industrial Corporation(상하이, 중국)에서 구입했습니다. 메틸티아졸릴디페닐-테트라졸륨 브로마이드(MTT)는 Sigma-Aldrich Corporation(상하이, 중국)에서 구입했습니다. Dulbecco 변형 이글 배지(DMEM), 트립신-EDTA(0.25%), 태아 소 혈청(FBS)은 Thermo Fisher Scientific에서 구입했습니다. 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염과 N-하이드록시석시나미드는 Sigma-Aldrich(중국)에서 구입했습니다. N,N-디메틸포름아미드, 무수 에탄올, 에틸아세테이트는 Sinopharm Chemical Reagent Corporation에서 구입했습니다. 초순수는 Millipore 정수 시스템으로 제조했습니다. 항인간 CD90-FITC, 항인간 CD45-PE, 항인간 CD34-FITC, 항인간 CD105-PE는 Biolegend에서 구입했습니다.

USPIO 합성

USPIO는 이전 연구[18,19,20,21]와 같이 폴리올 법으로 합성했습니다. 실험 단계는 다음과 같습니다: 철 아세틸아세토네이트 1mmol과 TREG 25mL를 3목 플라스크에 혼합하고, 아르곤, 구형 냉각관, 온도계에 연결했습니다. 아르곤 흐름으로 15분 배양 후, 혼합물을 120°C(가열 속도 3°C/min)로 가열해 1시간 유지한 후, 같은 가열 속도로 250°C까지 더 가열해 30분 유지했습니다. 반응 혼합물을 자연 냉각해 실온으로 내린 후, 무수 에탄올 2mL로 희석하고 에틸아세테이트로 침전시켰습니다. 침전물을 8000rpm으로 20분 원심분리해 수집한 후 무수 에탄올에 재분산시켰습니다. USPIO를 4°C에서 무수 에탄올에 보관해 추후 사용했습니다.

PAA/PEG 코팅 USPIO 제조

USPIO-PAA는 이전 보고[22]에 따라 획득했습니다. 상세히, 폴리아크릴산(PAA) 1.5g을 24mL 디에틸렌 글리콜에 녹였습니다. 5분 아르곤 흐름 후, 혼합물을 110°C로 가열해 용액이 투명해질 때까지 유지했습니다. 이전 단계에서 제조한 28mg USPIO 함유 에탄올 분산 용액을 초음파 분산 후 상기 투명 용액에 첨가했습니다. 용액을 3°C/min 속도로 210°C까지 가열했습니다. 2시간 환류 후 반응을 중단하고 자연 냉각했습니다. 냉각 후 에틸아세테이트를 반응 용액에 첨가해 USPIO NPs를 침전시키고 8000rpm 20분 원심분리해 상층액을 제거했습니다. 침전물을 에탄올에 분산시키고 에틸아세테이트로 다시 침전시켰습니다. 세척 절차를 3회 반복 후 USPIO-PAA를 초순수에 분산해 추후 사용했습니다. 생체적합성 향상을 위해 EDC와 NHS 매개 아미드화[23]로 PEG를 나노입자 표면에 추가로 결합했습니다. PEG 0.45g을 5ml 초순수에 녹여, 20mg EDC와 12mg NHS를 보충한 15ml USPIO-PAA 분산액(35mg Fe 함유)에 첨가했습니다. 혼합물을 실온에서 2시간 기계 교반한 후, 10ml DMF 용매를 첨가하고 회전증발장치에서 40°C로 수분을 제거했습니다. 마지막으로 40mg DEC와 24mg NHS를 혼합물에 첨가해 실온에서 48시간 혼합했습니다. 반응 용액을 초순수 투석백에 넣어 72시간 투석했으며, 12시간마다 초순수를 교체했습니다. 혼합물을 초여과 튜브로 옮겨 4000rpm 10분 원심분리로 30kD 이상 분자량 분자를 수집했습니다. 최종 생성물을 초순수에 녹여 4°C에 보관했습니다. 경우에 따라 물에 녹은 SPIO-PAA/PEG를 초여과 원심분리 튜브(>30KD 공극 크기, Millipore)로 원심분리 수집하고, 펠릿을 진공 오븐에서 건조해 추가 실험에 사용했습니다.

NPs 특성화

시료의 입자 크기, 크기 분포, 형태는 TEM으로 분석했습니다. 코팅 층은 네거티브 스테이닝으로 측정했습니다. 초음파 분산 후 USPIO-PAA와 USPIO-PAA/PEG 수용액을 300메쉬 탄소 지지막 구리망에 첨가해 자연 건조한 후 투사 전자현미경(Tecnai G2F20 s-twin, FEI)으로 관찰했습니다.

적외선 분광 분석은 Agilent Technologies Cary 600 시리즈 FTIR 분광계로 수행했으며, 건조 시료 분말을 시료 탱크에 직접 넣어 검출했습니다.

USPIO-PAA/PEG 분산액 내 Fe 함량은 화염 원자 흡수 분광법(FAAS, PerkinElmer Analyst 700 모델)으로 결정했습니다. 먼저 1, 2, 3, 4, 5μg/mL 철 표준 용액을 제조해 표준 곡선을 그린 후, 100μL USPIO-PAA 또는 USPIO-PAA/PEG 분산액을 질산으로 용해해 50mL 메스플라스크에서 철 함량을 측정했습니다.

나노입자 자기공명영상은 소주대학 제1부속병원 영상과 3T 임상 스캐너에서 수행했습니다. 나노입자를 해당 농도에 따라 1% 아가로스 겔 용액에 분산시켰습니다. 용액 고화 후 다중 에코 시퀀스로 횡이완 시간(T2)을 측정했습니다. MRI 영상을 DICOM 형식으로 내보내고 RadiAnt DICOM Viewer로 열어 회색값을 읽고, 다른 에코 시간의 회색값을 Origin으로 가져와 피팅해 다양한 농도 USPIO 분산액의 횡이완 시간 값을 얻었습니다. 마지막으로 1/T2 횡이완율과 시료 Fe 농도 선형 피팅으로 USPIO-PAA와 USPIO-PAA/PEG 시료의 횡이완율 r2를 얻었습니다. USPIO-PAA와 USPIO-PAA/PEG 자기 히스테리시스 루프는 이전 방법[24]에 따라 Suzhou University of science and technology에서 Quantum Design DynaCool-9 장치로 획득했습니다.

HADSCs 분리 및 동정

모든 연구는 '인간 배아줄기세포 연구 윤리 지침 원칙'(중국 과학기술부 및 보건부, 2003)과 헬싱키 선언에 따라 수행되었습니다. 지방 조직은 소주대학 제1부속병원에서 정보제공 동의와 윤리 승인 하에 얻었습니다. 해부 현미경 하에서 혈관과 결합조직을 제거한 후 지방 조직을 세척하고 작은 조각으로 자랐습니다. 블록을 1형 콜라게나아제(0.3 pzu/mL)로 37°C에서 30분 소화한 후, 500g에서 10분 원심분리했습니다. 세포 펠릿을 DMEM+10% FBS에 현탁해 8×10⁴/cm² 밀도로 파종했습니다. 48시간 후 부유 세포 함유 구배지를 버리고 신선한 배지로 교체했습니다.

HADSCs를 유세포분석으로 중간엽(CD90, CD105) 및 조혈(CD34, CD45) 줄기세포 표지 표면 마커로 특성화했습니다. 총 1×10⁵개 세포를 수확해 CD34, CD45, CD90, CD105 마우스 항인간 단클론항체와 적절한 아이소타입 대조군에 대해 PE, FITC, APC/Cy7, PerCP 결합 항체로 염색했습니다. 염색 세포를 유세포분석기(LSRFortessa, BD, USA)로 분석하고 FlowJo 소프트웨어로 데이터를 분석했습니다. CD90+, CD105+, CD34−, CD45− 4가지 표현형을 HADSCs 표면 마커로 선정했습니다. 세포 표면 마커 발현 수준은 유세포분석(BD LSRFortessa)으로 확인했습니다.

HADSCs의 지방생성 및 골생성 분화능을 Oil Red O와 Alizarin Red 염색으로 각각 평가했습니다. HADSCs를 MesenCultTM 지방생성 분화 배지(Stem cell Tech., 05412) 또는 OriCellTM 골생성 분화 키트(Cyagen, HUXMA-90021)로 배양했습니다. HADSCs 지방생성 분화는 14일째 Oil Red O 염색으로 지질 충만 성숙 지방세포를 정성 평가했습니다. HADSCs 골생성 분화는 21일째 Alizarin Red 염색으로 성숙 골세포의 칼슘 결절을 평가했습니다. 이미지는 역위 Nexcope 현미경으로 획득했습니다.

USPIO-PAA/PEG 세포 내재화 및 생체적합성 평가

HADSCs를 6웰 플레이트에 웰당 1×10⁶ 밀도로 플레이팅했습니다. USPIO-PAA/PEG(Fe 10μg/mL, 0.1μg/mL) 함유 배지에서 2시간 배양 후 프러시안 블루(PB) 염색으로 세포내 Fe를 확인했습니다.

USPIO-PAA/PEG 생체적합성은 MTT 비교색법과 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU) 혼입 분석(EdU 증식 키트, Thermo)으로 결정했습니다. MTT 실험에서 HADSCs를 96웰 플레이트에 웰당 5×10³ 밀도로 플레이팅하고 USPIO-PAA/PEG를 다양한 농도(0, 10, 20, 40, 80, 160 Fe μg/mL)로 24, 48, 72시간 배양했습니다. 웰당 20μl MTT 용액(5mg/mL)을 4시간 첨가한 후, 150μL 디메틸설폭시드로 결정을 용해했습니다. 각 웰 흡광값을 효소표지기(BioTek Synergy HT)로 OD 570nm에서 측정했습니다. EdU 분석에서 HADSCs를 160 Fe μg/mL SPIO-PAA/PEG로 72시간 배양 후 10μM EdU로 24시간 배양했습니다. 세포를 수집해 4% 파라포름알데히드로 고정하고 2mg/mL 글리신으로 중화했습니다. 투과화 후 염색 용액(아지드 647 복합체)으로 배양하고 유세포분석으로 EdU 혼입율을 평가했습니다.

6-OHDA 유도 PD 모델

15~20마리 수컷 Wistar 쥐(SPF 등급, 체중 220±20g)를 USPIO-PAA/PEG 표지 HADSCs의 PD 동물 생체 내 추적에 사용했습니다. 모든 절차는 중국 규정(실험동물 관리 규정, 2017)에 따라 수행되었고 중국과학원 기관 동물 관리 및 사용 위원회 승인을 받았습니다. 전반적으로 동물은 조절된 조명(12/12시간 명/암 주기, 오전 7시 점등) 하에 자유롭게 사료와 물에 접근하며 사육되었습니다. PD 모델은 6-하이드록시도파민(6-OHDA, Sigma, St. Louis, MO, USA)을 쥐 편측 선조체에 2점 주입해 제조했습니다. 이전 연구[25,26]에 따라 6-OHDA 용액(5μg/μL) 3μL를 2개 좌표(AP: 1.2mm, ML: 2.2mm, DV: -4.0~-6.0mm; AP: -1.0mm, ML: 4.4mm, DV: -4.5~-6.5mm)에 입체택틱 주입했습니다. 아포모르핀 유도 회전(0.5mg/kg, 피하주사) 검사로 PD 모델 유효성을 검증했습니다. 6-OHDA 처리 후 1, 2, 3주에 아포모르핀(0.5mg/kg)을 피하주사하고 30분간 개방장에서 회전 점수를 평가했습니다. 아포모르핀 유도 분당 7회전 이상인 쥐를 성공적 PD 모델로 간주했습니다.

세포 이식 및 생체 내 MRI 영상

HADSCs가 80% 컨플루언스에 도달했을 때 USPIO-PAA/PEG(철 농도 10μg/mL)로 2시간 배양했습니다. PD 모델 제조 3주 후, USPIO-PAA/PEG 표지 HADSCs 또는 생리식염수 3×10⁶개를 PD 쥐 모델 좌측 선조체에 다음 좌표(AP: 1.2mm, ML: 2.2mm, DV: -4.0~-6.0mm)로 주입했습니다. 이식받은 동물은 수술 직후와 이후 2일간 부프레노르핀(0.5mg/kg)을 투여받았습니다. 이 동물들은 이식 수술 후 1, 2, 3주에 아포모르핀 유도 회전 검사를 받았습니다.

생체 내 MRI는 생체 내 영상 시스템(IVIS) 소동물 영상 시스템(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)으로 HADSCs 또는 생리식염수 주입 후 3, 9, 15, 21일째 촬영했습니다.

조직학적 분석

줄기세포 이식 3주 후(n=5 per group) 남은 쥐 모델 뇌를 수확해 30μm 두께로 절편화해 분석했습니다. 절편을 항티로신 하이드록실라제(TH, abcam, 영국)와 배양하고 알렉사-594 결합 당나귀 항토끼 항체(Abcam)로 시각화했습니다. DAPI로 핵 대조염색했습니다. 이미지는 Leica TCS SP5 공초점 현미경으로 촬영했습니다.

통계 분석

수치 데이터는 평균±SD로 표현했습니다. 데이터는 GraphPad Prism 7.0(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)으로 양측 Student t-검정 또는 일원배치 ANOVA를 적용해 차이를 평가했습니다. *는 p<0.05, NS는 유의한 차이 없음을 나타냅니다.

결과

나노입자 합성 및 특성화

실험 설계는 그림 1에 표시되어 있습니다. 소수성 USPIO NPs를 열분해 법으로 제조했습니다. 그림 2a~c에서 원래 USPIO NPs 직경은 4.07±0.57nm였으며, PAA 코팅 후 USPIO-PAA NPs 직경이 6.34±0.54nm로 증가했고, 추가 PEG 수정으로 USPIO-PAA/PEG NPs 직경이 10.07±0.55nm에 도달했습니다. 세 나노입자 모두 구형이며 고르게 분산되어 있습니다. 통계 분석에서 USPIO, USPIO-PAA, USPIO-PAA/PEG NPs 직경 간 유의한 차이가 확인되었습니다(F=10, **p<0.01, ##p<0.01), PAA와 PEG 수정이 성공적임을 나타냅니다(그림 2d).

적외선 흡수법으로 USPIO-PAA에서 PAA 분자 카르보닐 신축 진동 피크로 인한 1728cm⁻¹ 명백한 카르보닐 흡수 피크를 발견했습니다. USPIO-PAA/PEG에서 PEG 수정으로 인한 1595cm⁻¹ 탄소-질소 결합 평면 굴곡 진동 피크와 3440cm⁻¹ 수산기 신축 진동 피크를 확인했습니다(그림 2e). 이 모든 데이터는 PAA 또는 PEG 분자가 NPs 표면에 성공적으로 수정되었음을 추가로 확인합니다.

USPIO-PAA/PEG, HADSC와 우수한 생체적합성 및 in vitro 자기 응답

USPIO-PAA와 USPIO-PAA/PEG의 in vitro 영상 능력을 다양한 농도(Fe 농도 환산)에서 MRI 영상 회색값으로 평가했습니다. 피팅 후 다양한 농도 분산액의 횡이완 시간 값을 얻었습니다. 횡이완율 1/T2를 세로축, Fe 농도를 가로축으로 설정해 USPIO-PAA 횡이완율을 107.94 s⁻¹ mM⁻¹(그림 3a), USPIO-PAA/PEG를 84.65 s⁻¹ mM⁻¹(그림 3b)로 계산했습니다. 두 입자 모두 우수한 MRI 영상 특성을 보였습니다. SPIO-PAA와 SPIO-PAA/PEG 자기 히스테리시스 루프에서 SPIO-PAA 포화 자화값은 10,000Oe 이상에서 57emu/g(그림 3c), SPIO-PAA/PEG는 40emu/g(그림 3d)이었습니다. 보자력과 잔류자화는 0에 가까웠습니다(그림 3c, d), 두 입자 모두 초상자성임을 추가로 나타냅니다.

USPIO-PAA/PEG NPs를 HADSCs와 다양한 시간 배양한 결과, 세포 생존에 유의한 영향이 없었습니다(p>0.05). HADSCs 세포 생존율은 Fe 농도 0~160μg/mL 범위에서 96% 이상 유지되었습니다. 또한 배양 시간 증가(24~72시간)가 각 Fe 농도에서 유의한 세포 손실을 유도하지 않았습니다(그림 4a). iPSCs를 다양한 농도 USPIO-PAA/PEG NPs와 배양했을 때도 유사한 관찰이었습니다(그림 4b). HADSCs를 160μg Fe/mL USPIO-PAA/PEG로 72시간 처리해도 EdU 혼입율로 나타난 증식 능력이 USPIO-PAA/PEG 존재로 손상되지 않았습니다(그림 4c). 이 모든 데이터는 합성된 USPIO-PAA/PEG NPs의 생물학적 안전성을 입증합니다.

세포가 USPIO-PAA/PEG NPs로 효과적으로 표지될 수 있는지 확인하기 위해 HADSCs를 USPIO-PAA/PEG NPs(Fe 10μg/mL 또는 0.1μg/mL)와 2시간 배양했습니다. 그림 4d에서 USPIO-PAA/PEG(Fe 10μg/mL) 존재 시 거의 100% HADSCs에서 다수의 파란색 염색 NPs가 관찰되었습니다. USPIO-PAA/PEG 용량을 0.1μg Fe/mL로 낮춰도 거의 모든 HADSC에서 다소 균일하고 분산된 PB 염색을 관찰할 수 있었습니다. 다른 보고된 일부 SPIOs[14,27,28]와 비교해 USPIO-PAA/PEG는 높은 세포 섭취 효율을 보였습니다.

PD 쥐 모델에서 USPIO-PAA/PEG NPs 표지 HADSCs 장기 추적

USPIO-PAA/PEG NPs로 표지된 HADSCs를 입체택틱 주입으로 PD 쥐 모델 좌측 선조체에 이식했습니다. 그림 5에서 HADSC 이식 3일 후 좌측 선조체에서 명확한 MRI 신호를 관찰해 이식 세포의 적절한 생체 내 추적을 나타냈습니다. 이식 후 D3, D9, D15, D21 동적 관찰에서 NP 표지 이식 세포가 3주까지 명확히 추적 가능했으며, MRI 신호가 과정에서 뚜렷한 감소 없이 유지되었습니다. 이 결과는 합성된 나노입자가 이식 세포 생체 내 추적에 좋은 잠재력을 가짐을 나타냅니다.

USPIO-PAA/PEG NPs 표지 HADSCs, PD 모델에서 치료 효과 나타내

NPs 표지 HADSCs가 치료 효과를 보이는지 평가하기 위해 먼저 분리된 HADSCs 표현형 특성화를 수행했습니다. 그림 6a에서 배양된 HADSCs는 방추형 세포였습니다. 유세포분석 결과 HADSCs가 중간엽 세포 마커인 CD90(>99%)과 CD105(>99%)를 고발현하는 반면, 조혈 마커인 CD34와 CD45는 거의 발현하지 않았습니다(그림 6b~g). HADSCs는 특정 조건에서 지방생성 또는 골생성 계열로 분화 가능했으며, 분화능은 Oil Red O 또는 Alizarin Red 염색으로 각각 나타났습니다(그림 6h). 대조군 HEK293 세포에서는 그러한 구조가 관찰되지 않은 반면, 분화된 HADSCs에서 지질 방울 또는 석회화 결절을 확인했습니다(그림 6h). 이 모든 것이 HADSCs가 중간엽 세포 기준을 충족함을 나타냅니다.

6-OHDA 주입 후 1, 2, 3주차 아포모르핀 유도 회전수는 각각 분당 17.1±1.79, 28.7±1.77, 31.86±1.72회로, 쥐 PD 모델 성공적 구축을 확인했습니다. 그림 7에서 NPs 표지 HADSCs를 병변 측 선조체에 이식한 후 1, 2, 3주차 PD 쥐 모델 회전수가 각각 분당 32.59±1.12, 31.85±1.98, 31.54±1.73으로 감소했습니다. 통계 분석에서 이식 수술 2주차부터 생리식염수 투여군과 HADSC 투여군 간 유의한 차이가 나타났습니다(2주차 p<0.01, 3주차 p<0.01; 각 그룹 n=5), NPs 표지 HADSCs가 PD 모델 행동 장애를 개선함을 나타냅니다.

PD는 흑질(substantia nigra)에서 티로신 하이드록실라제(TH) 발현 뉴런 손실이 특징입니다. TH 면역염색으로 6-OHDA가 흑질 TH 발현 뉴런을 감소시키고, PD 쥐 모델 선조체 HADSC 이식이 이러한 감소를 완화할 수 있음을 확인했습니다(그림 8). 세포 이식이 PD 쥐 행동 장애를 완화한다는 관찰과 결합해, USPIO-PAA/PEG NPs 표지 HADSCs가 PD 쥐 모델에서 치료 효과를 발휘함을 결론지었습니다.

논의

세포 치료는 신경퇴행성 질환 치료에 유망한 전략으로 지난 20년간 전임상 연구 최전선에 있었습니다[29,30]. 이식 세포 추적은 기저 메커니즘 규명과 임상 효과 평가에 필수적인 부분이나, 어렵고 어느 정도 세포 치료 적용을 방해합니다[31,32]. 컴퓨터단층촬영(CT), 근적외선 형광 영상(NIFI), MRI가 이식 세포 생체 내 추적에 가장 흔히 사용되는 방법입니다[31,32]. CT의 높은 방사선과 NIFI의 낮은 감도에 비해 MRI는 깊은 조직 영상, 높은 콘트라스트, 낮은 이온화 방사선으로 생체 내 추적에 좋은 후보가 됩니다[33,34,35,36]. 따라서 MRI용 적절한 추적자 개발은 세포 치료 응용 촉진에 필수적입니다.

SPIO는 MRI 시각화를 위한 단순하고 신뢰할 수 있는 표지 전략입니다. 이식 세포 장기 생체 내 추적을 위해 SPIO 입자는 균일하고 초소형 크기를 가져야 합니다. 큰 입자는 추적자 불균일 분포를 초래하고 정상 혈액 순환을 방해할 수 있기 때문입니다[33]. 또한 나노입자 내재화 효율과 생체적합성은 추적자 평가의 또 다른 중요 지표입니다. 나노입자는 보통 액상 내포작용[37], 수용체 매개 내포작용[38], 식작용[39]으로 세포에 진입합니다. 더 나은 세포 섭취를 위해 SPIO 입자는 보통 중간 리간드로 수정됩니다[18,40,41].

세포 추적 외에도 SPIO는 약물 전달에도 적용되었습니다[42]. 조직 분포와 약동학적 청소율은 두 응용 모두 중요 지표입니다. NPs-PAA에 비해 NPs-PAA/PEG가 혈중 잔류 시간 더 길고 요로 청소율 더 느렸습니다[43]. PEG 밀도 코팅 NPs는 위장관[44], 호흡기[45,46], 뇌종양[42] 등 점막 상피 표면에서 훨씬 더 균일한 분포를 제공합니다. 또한 PEG 코팅은 단백질 부착과 코로나 형성을 줄여, 섭취 감소 대가로 NPs 균일 분포를 촉진할 수 있습니다[47]. 잠재적 우수 진단 및 치료 도구로서 SPIO-PAA/PEG의 MSCs 표지 능력과 PD 등 뇌질환 적용은 충분히 연구되지 않았으며, 본 연구는 이 질문에 답하고자 설계되었습니다. 본 연구에서는 SPIO 코어를 PAA와 PEG 리간드로 각각 수정해 새로운 초소형 USPIO-PAA/PEG 나노입자를 합성했습니다. USPIO-PAA/PEG NPs는 균일한 초소형 직경(10.07±0.55nm), 수용액 내 좋은 분산성, 다양한 세포 유형과 생체적합성, in vitro 및 in vivo 우수한 자기 응답 효과를 가집니다. 중요하게는 표지 HADSCs 신호가 뇌 이식 후 3주까지 MRI에서 명확히 검출되어 임상 적용 잠재력이 우수함을 나타냅니다.

PD는 흑질에서 도파민 신경세포 점진적 손실과 도파민 네트워크 도파민 결핍이 특징입니다[1]; 가장 영향을 받는 것은 선조체를 포함한 흑질-선조체 경로입니다. 본 연구에서 USPIO-PAA/PEG 표지 HADSCs를 PD 쥐 모델 선조체에 이식했고, 이러한 이식이 행동 장애를 개선하고 흑질 도파민 신경세포 손실을 어느 정도 완화함을 발견했습니다. 유사하게 Ardeshir 등은 쥐 지방조직 유래 MSCs 이식이 PD 모델에서 아포모르핀 유도 회전을 완화한다고 보고했습니다[48]. 태아 중뇌 조직[49]이나 도파민 신경 전구체[50] 이식과 달리, HADSCs는 손상 조직 대체보다는 주로 분비체 효과[51,52]로 치료 효과를 발휘합니다. 연구에서 MSCs가 면역조절, 신경보호, 뉴런 분화 촉진자로 작용하며, 이러한 효과는 MSCs가 분비하는 분비체로 본질적으로 매개됨이 입증되었습니다[6,7,51]. 우리 결과는 이러한 관찰과 일치하며, 새로운 USPIO-PAA/PEG 추적자가 HADSCs 신경보호 효과에 간섭하지 않음을 추가로 나타냅니다.

결론

우리는 높은 세포 섭취 효율, 우수한 생체적합성, 장기 MRI 추적 능력을 보이는 새로운 USPIO-PAA/PEG 추적자를 개발했습니다. USPIO-PAA/PEG 표지 HADSCs는 세포 이식 후 3주까지 MRI로 추적 가능했습니다. 또한 표지 HADSCs가 PD 모델 행동 장애를 유의하게 완화하고 흑질 도파민 신경세포 수를 증가시켰습니다. USPIO-PAA/PEG 추적자 개발은 줄기세포 연구와 응용에 유망한 도구를 제공할 수 있습니다.