MALAT1/miR-143/VEGFA 축이 혈관내피 손상을 유도해 두개내 동맥류 발생

초록

일부 장거리 비부호화 RNA(lncRNA)의 두개내 동맥류(IA) 내 역할이 많은 연구에서 조사되었습니다. 본 연구는 lncRNA 전이 관련 폐 선암 전사체 1(MALAT1)/마이크로RNA-143(miR-143)/혈관내피세포 성장인자-A(VEGFA) 신호 축이 혈관내피 손상 유발 IA에서 작동하는 기전을 규명하는 것을 목적으로 합니다. IA 조직과 정상 동맥 조직에서 MALAT1, miR-143, VEGFA 발현을 측정했습니다. 조직 내 기질 금속단백질분해효소 9(MMP-9), 혈청 및 조직 내 폰 빌레브란트 인자(vWF), 혈청 내 엔도텔린-1(ET-1)을 측정했습니다. IA 모델 쥐에 MALAT1 억제 또는 과발현 플라스미드를 주입해 혈관내피 손상을 관찰했습니다. IA 환자 유래 혈관내피세포를 분리해 MALAT1 억제/과발현 형질주입으로 세포 생존율과 세포사멸 영향을 검증했습니다. MALAT1, miR-143, VEGFA 간 연관성은 온라인 예측, 루시퍼라제 활성, RNA 풀다운 분석으로 확인했습니다. IA 조직에서 MALAT1과 VEGFA 과발현, miR-143 저발현이 확인되었습니다. MALAT1 억제는 IA 모델 쥐에서 혈압, ET-1, vWF, MMP-9 발현, 혈관내피세포 세포사멸 지수를 감소시켰습니다. MALAT1 저하가 IA 혈관내피세포에서 세포사멸을 억제하고 생존율을 증진시켰습니다. MALAT1이 miR-143과 결합하고 miR-143이 VEGFA를 표적함이 확인되었습니다. 본 연구는 MALAT1이 miR-143과 경쟁적 결합으로 VEGFA 발현을 높여 IA 혈관내피세포에서 세포사멸을 촉진하고 생존율을 저하시킴을 시사합니다.

서론

두개내 동맥류(IA)는 뇌동맥강 또는 동맥벽의 국소적 비정상 확장으로 인한 두개내 압력 상승으로 발생하며, 뇌동맥류라고도 합니다. IA는 높은 사망률과 이환율을 가진 중증 질환으로, 일반 인구 유병률은 약 1-3%입니다. 주요 임상 특징은 뇌혈관 연축, 자발적 뇌출혈, 안운동신경 마비입니다. 현재까지 IA 발생·진행 주요 위험 인자는 혈역학적 장애, 유전, 노화, 감염, 선천적 요인 등입니다. 주된 임상 치료는 수술적 클립 결찰과/또는 혈관내 코일 색전술로 동맥류 파열 예방이 목적입니다. 그러나 IA 상세 기전은 아직 규명되지 않아 더 효과적 관리법 개발이 시급합니다.

장거리 비부호화 RNA(lncRNA)는 200 뉴클레오티드 이상 길이의 비부호화 RNA 계열입니다. IA에서 lncRNA 성장 정지 관련 lncRNA 1 발현이 저하됨이 보고되었습니다. 전이 관련 폐 선암 전사체 1(MALAT1)은 약 8000 nt 길이로 고농도 발현되는 널리 분포한 lncRNA입니다. MALAT1은 흉부 대동맥류에서 평활근 기능 이상 조절이 보고되었습니다. 또한 IA에서 비정상적 lncRNA와 메신저 RNA(mRNA) 발현 및 lncRNA-mRNA 공발현 네트워크가 IA 발병 기전 단서를 제공합니다. MALAT1이 마이크로RNA-143(miR-143) 발현 표적으로 오스테릭스 발현을 높여 인간 골수 중간엽 줄기세포 골아세포 분화를 조절함이 보고되었습니다. miR-143/145 클러스터가 평활근 세포에서 크루펠 유사 인자 5 조절을 역전시켜 IA에서 수축성과 증식에 관여함도 제시되었습니다. Feng 등에 따르면 순환 중 miR-143/145 저하와 높은 MMP-9 수치가 IA 형성과 파열과 관련될 수 있습니다. 분석 결과 가장 조절되지 않는 miRNA(miR-143, miR-145)가 혈관내피 성장인자(VEGF) 등 신호 경로와 세포 이동·부착 조절 유전자를 공통 표적으로 함이 밝혀졌습니다. VEGFA 변이의 IA 예측 중요성도 보고되었습니다. 따라서 본 연구는 혈관내피 손상 유발 IA에서 MALAT1/miR-143/VEGFA 신호 축 기전을 평가하고자 합니다.

재료 및 방법

윤리 선언

본 연구는 중국과학기술대학 생명과학의학부 제1부속병원 기관윤리위원회 승인을 받았으며 헬싱키 선언 원칙을 따랐습니다. 참여자는 서면 동의를 제공했습니다. 모든 동물 실험은 미국 국립보건원 실험동물 관리·사용 가이드라인을 준수했으며, 중국과학기술대학 제1부속병원 동물실험윤리위원회 허가를 받았습니다.

연구 대상

영상 검사로 진단받고 중국과학기술대학 제1부속병원에서 신경외과적 클립 결찰술을 받은 IA 환자 20명(IA군)을 선정했습니다. 남성 11명, 여성 9명, 평균 연령 43.27 ± 6.25세였습니다. IA 조직을 채취했습니다. 한편 편도체와 해마 경화증으로 인한 측두엽 간질 환자 20명(대조군)에서 측두극 측두피질 동맥 혈관 조직을 절제했습니다. 절제 조직은 수술 후 병리검사로 정상 동맥 조직으로 확인되었으며, 남성 13명, 여성 7명, 평균 연령 44.18 ± 5.91세였습니다. IA군과 대조군 간 성별과 연령에 유의한 차이는 없었습니다(모두 P>0.05). 모든 대상자에게서 수술 전 아침 공복 상태에서 정맥혈(2튜브)을 동시에 채취했습니다.

IA 쥐 모델 확립

체중 200-250g 청정급 스프라그-도ली 수컷 쥐 60마리(중국 후난 SJA 실험동물)를 7일간 사육했습니다(25±2°C, 상대습도 65-70%, 12시간 명암 주기, 자유 섭식). 쥐 외경동맥과 분기부 동맥벽 주위에 돼지 췌장 엘라스타제를 주입했습니다. 외경동맥을 분기부 약 1.5mm 지점에서 두 수술사로 결찰하고, 두 선 사이를 절개해 외경동맥 맹단에 내경동맥류를 형성했습니다. 수술 후 1주일간 1% 생리식염수 급여했습니다. 1개월 후 뇌혈관 조영술로 동맥류 형성을 관찰했습니다.

IA 쥐 모델 확립 후 50마리를 무작위 분배했습니다: 빈군(n=10, 모델 쥐에 입체정위 주사로 100μL 인산완충식염수(PBS) 1일 1회), sh-음성대조군(NC)(n=10, sh-MALAT1 NC 100μL 1일 1회), sh-MALAT1군(n=10, sh-MALAT1 플라스미드 100μL 1일 1회), 과발현(OE)-NC군(n=10, OE-MALAT1 NC 플라스미드 100μL 1일 1회), OE-MALAT1군(n=10, OE-MALAT1 플라스미드 100μL 1일 1회). 상기 플라스미드는 상하이 Genechem사에서 제작했습니다.

쥐 혈압 측정

수술 후 1주, 4주, 12주에 쥐 꼬리동맥 혈압을 측정했습니다. 측정 전 쥐를 항온 가열 장치에 잠시 두어 외부 온도 간섭을 막고, 특수 쥐 케이지에서 몇 분간 안정시켜 활동 간섭을 방지했습니다. 혈압 변동이 크면 여러 번 측정해 평균값을 구했습니다.

동맥류 조직 채취

3개월 후 1% 펜토바르비탈 나트륨(40 mg/kg) 복강 주사로 마취해 정맥혈 채취했습니다. 쥐를 안락사시키고 개흉해 좌심실을 대동맥에 관입시키고 하대정맥을 절개해 출혈시켰습니다. 헤파린 나트륨 함유 30mL 생리식염수로 급속 심장 관류해 혈액을 씻어내고, 10% 폴리포름알데히드/0.1M PBS(pH 7.4) 10mL를 뇌에 주입했습니다. 관류 고정 후 쥐 뇌를 개두해 두개저 동맥 순환을 세밀히 관찰하고 동맥류 조직을 분리해 현미경으로 변화를 관찰했습니다.

효소면역측정법(ELISA)

혈청 관련 지표를 ELISA 키트로 측정했습니다. 채취 혈액을 37°C 항온기에서 1시간 두고 3000 rpm으로 10분 원심분리했습니다. 엔도텔린-1(ET-1)과 폰 빌레브란트 인자(vWF) 발현 검출은 키트 지침대로 수행했습니다(모든 키트는 중국 난징 젠청 바이오엔지니어링 연구소 제품).

헤마톡실린-에오신(HE) 염색

시료를 10% 포르말린으로 24시간 이상 고정해 파라핀 블록에 보관했습니다. 파라핀 블록을 자일렌으로 20분 탈파라핀하고, 기울기 하강 알코올(100%, 95%, 80%, 75%)로 1분씩 탈수했습니다. 헤마톡실린으로 10분 염색 후 증류수로 세척, 염산 알코올로 30초 분화, 50°C 온수에서 5분 담갔습니다. 에오신 용액으로 염색 후 증류수 세척, 70%와 90% 알코올 탈수, 자일렌 투명화, 중성 검으로 봉입했습니다. 고배율 현미경으로 조직 형태를 관찰했습니다.

투과전자현미경 관찰

여분 조직을 2.5% 글루타르알데히드와 1% 오스뮴산으로 고정, 탈수 후 Epon812 레진으로 포매했습니다. 반박절편을 톨루엔 블루로 염색, 다듬어 초박절편 제작했습니다. 초박절편을 초산 우라닐과 구연산 납으로 염색해 JME-2000EX 투과전자현미경(히타치 하이테크, 중국 상하이)으로 관찰했습니다.

TUNEL 염색

TUNEL 키트(로슈, 스위스 바젤) 기반으로 IA 쥐 혈관내피세포 세포사멸을 관찰했습니다. 준비된 쥐 동맥류 절편을 자일렌으로 2회(회당 5분) 세척, 기울기 하강 알코올(100%, 95%, 80%, 75%)로 3회(회당 5분) 탈수했습니다. DNase 없는 20μg/mL 프로테아제 K 용액으로 15-30분 처리, 50μL TUNEL 반응액을 떨어뜨려 60분 반응, 25°C에서 50μL 다이아미노벤지딘(DAB)으로 10분 현상했습니다. 헤마톡실린 대조 염색, 기울기 알코올 탈수, 자일렌 투명화, 중성 검 봉입했습니다. 광학현미경으로 관찰하고 세포사멸 지수를 계산했습니다.

동맥류 혈관내피세포 분리 및 동정

혈관내피세포 분리는 Boscolo 등의 방법으로 수행했습니다. IA 조직을 3mm² 조각으로 절편하고 0.1% 콜라게나제 B/0.1% 디스파제(로슈)로 37°C에서 25분 처리했습니다. 미리 분리된 조직을 2mL 피펫으로 2분간 파쇄하고 100μm 스트레이너(써모피셔, 미국 일리노이)로 여과했습니다. 이후 세포 현탁액을 원심분리 후 MV2 배양액(성장인자 포함, 20% 태아우시혈청)(프로모셀, 독일 하이델베르크)에 재현탁했습니다. 1×10⁴ cells/mL 밀도로 1μg/cm² 피브로넥틴 코팅 플라스크에 접종했습니다. Jackson 등의 방법으로 80-100% 컨플루언스 세포를 Ulex europaeus 응집소 I(UEA) 코팅 비드(다이나비즈 M-450 토실액티베이티드, 옥소이드, 영국 햄프셔)로 분리했습니다. 렉틴 코팅 비드에 부착된 혈관내피세포를 자기입자 농축기로 모으고 비결합 세포를 기초 배양액으로 세척했습니다. UEA 양성 세포를 배양액에 재현탁해 피브로넥틴 코팅 플라스크에 접종해 부착과 증식률을 높였습니다.

세포를 피브로넥틴 코팅 챔버 슬라이드에서 MV2 배양했습니다. 80-100% 컨플루언스 도달 시 아세톤으로 4°C 고정, 1% 트리톤 X-100으로 5분 처리, 0.5% 우시혈청알부민(BSA)으로 15분 처리했습니다. 항-vWF 일차항체(1:300, 압캠, 미국 매사추세츠 케임브리지)로 2시간 반응(음성대조는 일차항체 없이 수행), 과산화효소 결합 면역글로불린 G(1:150, 압캠)로 30분 반응했습니다. 50μL DAB로 25°C에서 5분 현상, 헤마톡실린 대조 염색, 0.1% 염산 분화, 알코올 탈수, 자일렌 투명화, 중성 검 봉입 후 건조해 위상차 현미경으로 촬영했습니다.

세포 그룹 분류 및 형질주입

대수기 동맥류 혈관내피세포를 5그룹으로 배정했습니다: 빈군(처리 없음), sh-NC군(sh-MALAT1 NC 플라스미드 형질주입), sh-MALAT1군(sh-MALAT1 플라스미드 형질주입), OE-NC군(OE-MALAT1 NC 플라스미드 형질주입), OE-MALAT1군(OE-MALAT1 플라스미드 형질주입). 상기 플라스미드는 Genechem에서 합성했습니다. 세포 형질주입은 리포펙타민™ 2000 시약(11668-027, 인비트로젠, 미국 캘리포니아 칼스배드) 지침대로 수행했습니다.

MTT 분석

각 그룹 혈관내피세포를 96웰 플레이트에 3×10⁴ cells/mL 밀도로 접종해 37°C, 5% CO₂에서 48시간 배양했습니다. 각 그룹 5개 병행 웰, 각 웰에 신선한 MTT 용액(5mg/mL, 시그마, 미국 미주리 세인트루이스) 20μL 첨가. 4시간 반응 후 200μL 디메틸설폭사이드 첨가. 완전 용해 후 마이크로플레이트 리더(바이오래드, 미국 캘리포니아 허큘리스)로 490nm에서 광학밀도 측정했습니다.

유세포 분석

세포 주기 분포는 요오드화 프로피디움(PI) 염색으로 측정했습니다. 혈관내피세포를 분리, 원심분리, 예냉 75% 에탄올에 재현탁해 -20°C에서 하룻밤 고정했습니다. 원심분리해 상층액 제거. 450μL PBS에 100μL RNase A 첨가, 400μL PI로 4°C에서 30분 차광 염색. 유세포계측기(FACSCalibur, 벡톤디킨슨, 미국 뉴저지)로 세포 주기 분포 측정했습니다.

세포 세포사멸은 Annexin V/PI 이중 염색으로 측정했습니다. 분리된 혈관내피세포를 모아 PBS로 3회 세척. 100μL 예냉 1× 결합 완충액에 재현탁해 5μL Annexin과 5μL PI 각각 혼합. 유세포계측기로 세포사멸 측정. Annexin V를 횡축, PI를 종축으로 할 때 좌상사분면은 기계적 손상 세포(Annexin V⁻/PI⁺), 우상사분면은 후기 세포사멸/괴사 세포(Annexin V⁺/PI⁺), 좌하사분면은 정상 세포(Annexin V⁻/PI⁻), 우하사분면은 초기 세포사멸 세포(Annexin V⁺/PI⁻). 총 세포사멸 세포(Annexin V⁺/PI⁻ 및 Annexin V⁺/PI⁺)를 백분율로 계산했습니다.

역전사 정량적 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR)

조직과 세포 총 RNA를 트라이졸(타카라 바이오테크, 중국 다롄)로 추출하고 농도와 순도 확인했습니다. 역전사 키트(K1621, 페르멘타스, 미국 메릴랜드 뉴욕) 지침대로 RNA를 상보적 DNA로 역전사했습니다. MALAT1, miR-143, VEGFA 프라이머 서열(표 1)을 Genechem에서 설계·제작했습니다. lncRNA, miRNA, mRNA 발현 평가를 위해 SYBR Green PCR 마스터 믹스(타카라, 일본 도쿄)와 Roche 실시간 PCR 시스템(Roche)으로 RT-qPCR 수행했습니다. U6를 miR-143 내부 대조로, MALAT1과 VEGFA는 GAPDH를 내부 대조로 사용했습니다. 표적 유전자 상대 전사 수준은 2^(-ΔΔCt) 법으로 계산했습니다.

웨스턴 블롯 분석

조직과 세포 총 단백질을 추출했습니다. 단백질 농도는 BCA 키트(보스터 생물기술, 중국 우한) 지침대로 측정했습니다. 10% 폴리아크릴아미드 겔(보스터 생물기술)로 전기영동 분리했습니다. 막을 폴리비닐리덴 플루오라이드 막으로 전이하고 5% BSA로 1시간 차단했습니다. 1차 항체: Ki-67(1:1000), VEGFA(1:1000), vWF(1:1000), MMP-9(1:1000, 압캠, 영국 케임브리지), Cyclin D1(1:1000), Bax(1:1000), Bcl-2(1:1000, 산타크루즈 바이오테크, 미국 캘리포니아 산타크루즈), GAPDH(1:2000, 잭슨 면역연구, 미국 펜실베이니아 그로브). 2차 항체(1:500, 잭슨 면역연구)는 과산화효소 표지. 오디세이 이색 적외선 형광 스캐닝 이미징 시스템으로 막 촬영, Quantity One 영상 분석 소프트웨어로 밴드 회색값 측정했습니다.

이중 루시퍼라제 보고자 유전자 분석

MALAT1과 miR-143 결합 부위를 바이오인포매틱스 웹사이트(https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/)로 예측·해석했습니다. MALAT1과 miR-143 결합 관계는 루시퍼라제 보고자 유전자 분석으로 추가 검증했습니다. 합성 MALAT1 3'비번역영역(3'UTR) 유전자 조각을 pmiR-Report 루시퍼라제 보고자 벡터(써모피셔)에 Bamh1과 Ecor1 제한효소 부위로 도입해 MALAT1 야생형(MALAT1-WT) 제작. 상보적 서열 돌연변이 부위를 MALAT1-WT에 설계해 표적 조각을 pmiR-Report 벡터에 T4 DNA 라이게이스로 제한효소 소화 후 삽입해 MALAT1 돌연변이형(MALAT1-MUT) 제작. 정확한 서열 확인된 MALAT1-WT와 MALAT1-MUT를 모방 NC와 miR-143 모방과 동시 형질주입해 혈관내피세포에 도입. 48시간 후 세포 수집·용해, 루시퍼라제 검출 키트(바이오비전, 미국 샌프란시스코)와 루미노미터(Glomax20/20, 프로메가, 미국 위스콘신 매디슨)로 루시퍼라제 활성 측정했습니다.

miR-143과 VEGFA 표적 관계와 miR-143-VEGFA 3'UTR 결합 부위를 바이오인포매틱스 웹사이트(https://www.targetscan.org/vert_72/)로 예측. miR-143 결합 부위 포함 VEGFA 3'UTR 프로모터 영역 서열을 합성·클로닝해 pmiR-Report 벡터에 도입해 VEGFA-WT 제작. 이 보고자 기반으로 VEGFA-WT와 miR-143 결합 부위 돌연변이로 VEGFA-MUT 형성. VEGFA-WT 또는 VEGFA-MUT 보고자를 모방 NC 또는 miR-143 모방과 혼합해 혈관내피세포에 48시간 동시 형질주입. 이후 세포 용해, 루시퍼라제 검출 키트로 루시퍼라제 활성 측정했습니다.

RNA 풀다운 분석

miR-143과 MALAT1 결합 관계 검증 위해 RNA 풀다운 분석 수행. 바이오틴 표지 miRNA 서열 3종(Bio-miR-143-WT, Bio-miR-143-MUT, Bio-miR-NC) 설계해 GenePharma사(중국 상하이)에 의뢰. 이 바이오틴화 올리고뉴클레오티드를 세포에 48시간 형질주입. 세포 수집 후 특이적 세포 용해액(앰비온, 미국 텍사스 오스틴)으로 10분 처리. 용해액을 RNase-free 및 효모 tRNA(모두 시그마) 미리 코팅된 M-280 스트렙타비딘 비드와 4°C에서 3시간 배양. 찬 용해액으로 2회, 저염 완충액으로 3회, 고염 완충액으로 1회 세척. 길항 miR-143 프로브를 음성대조로 설정. 트라이졸로 총 RNA 추출 후 RT-qPCR로 MALAT1 풍부도 측정했습니다.

통계 분석

모든 데이터는 SPSS 21.0 소프트웨어(IBM, 미국 뉴욕 아몬크)로 분석했습니다. 측정 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시. 두 그룹 비교는 독립 표본 t검정, 다그룹 비교는 일원분산분석(ANOVA), 사후 비교는 Tukey 다중 비교 검정. MALAT1 발현과 IA 임상병리적 특징 관계는 카이제곱 검정. P<0.05를 통계적 유의성 기준으로 삼았습니다.

결과

IA 조직에서 MALAT1과 VEGFA 과발현, miR-143 저발현

IA군과 대조군 혈청 ET-1과 vWF 발현을 ELISA로 측정했으며, IA군에서 둘 다 유의하게 증가했습니다(모두 P<0.05)(Fig. 1a, b).

그림 1. IA 조직에서 MALAT1과 VEGFA 과발현, miR-143 저발현. a IA 환자와 측두엽 간질 환자 혈청 ET-1 발현(ELISA). b 혈청 vWF 발현(ELISA). c IA 조직과 정상 동맥 조직 병리 관찰(HE 염색). d 투과전자현미경 형태 관찰. e IA 조직과 정상 동맥 조직 MALAT1, miR-143, VEGFA mRNA 발현(RT-qPCR). f VEGFA, MMP-9, vWF 단백질 발현(웨스턴 블롯). 혈관내피세포(EC), 내부 탄력판(IEL), 평활근세포(SMC). 측정 데이터는 평균 ± 표준편차, 그룹 간 비교는 독립 표본 t검정.

HE 염색으로 IA 조직 병리 변화 관찰. 정상 동맥 조직은 내피, 내피세포, 평활근세포에 뚜렷한 손상 없고 세포 배열 정연하고 구조 완전. IA 조직은 내피세포 손상, 평활근세포 변성, 동맥벽 위축, 탄력섬유 파열, 염증세포 침윤 나타남(Fig. 1c).

투과전자현미경으로 IA와 정상 동맥 조직 초미세 구조 관찰. 정상 동맥 조직은 내피세포 완전, 외막 구조 온전, 내부 탄력막 파열 없음, 평활근세포 세포사멸 없음. IA 조직은 혈관벽 심한 변성: 대부분 내피세포 소실, 내부 탄력층 심한 파열, 평활근세포 심한 손상·변성, 혈관 외막 무질서(Fig. 1d).

RT-qPCR로 MALAT1, miR-143, VEGFA mRNA 발현, 웨스턴 블롯으로 VEGFA, MMP-9, vWF 단백질 발현 측정. 정상 동맥 조직 대비 IA 조직에서 MALAT1, VEGFA, MMP-9, vWF 발현 증가, miR-143 발현 감소(모두 P<0.05)(Fig. 1e, f).

IA 조직에서 Hunt-Hess 등급, 내피 손상 정도, 흡연력이 MALAT1 발현과 연관

MALAT1 중간 발현값 기준으로 환자군을 저발현군과 고발현군으로 나눴습니다. MALAT1 발현과 IA 환자 임상병리적 특징 간 관계 분석. Hunt-Hess 등급, 내피 손상 정도, 흡연력이 MALAT1 발현과 연관됨(모두 P<0.05). 연령, 성별, 수술 방식은 무관(모두 P>0.05)(표 2).

MALAT1 저하가 IA 쥐 혈압, ET-1, vWF, MMP-9 발현, 혈관내피세포 세포사멸 지수 억제

표 3에서 MALAT1 녹다운은 4주와 12주 혈압을 낮추고, MALAT1 과발현은 높였습니다.

ELISA 결과 MALAT1 저하는 IA 쥐 혈청 ET-1과 vWF 발현 감소, 과발현은 증가시킴(Fig. 2a, b).

그림 2. MALAT1 저하가 IA 쥐 혈압, ET-1, vWF, MMP-9 발현, 혈관내피세포 세포사멸 지수 억제. a 쥐 혈청 ET-1 발현(ELISA). b 혈청 vWF 발현(ELISA). c 쥐 IA 조직 병리 변화(HE 염색). d 쥐 IA 조직 초미세 구조(투과전자현미경). e 혈관내피세포 세포사멸(TUNEL 염색). f 쥐 혈관내피세포 세포사멸 지수. g 쥐 IA 조직 MALAT1, miR-143, VEGFA mRNA 발현(RT-qPCR). h VEGFA, MMP-9, vWF 단백질 발현(웨스턴 블롯). *P<0.05 vs sh-NC, #P<0.05 vs OE-NC. 측정 데이터 평균 ± 표준편차, 다그룹 비교는 일원분산분석 후 Tukey 사후 검정.

각 그룹 IA 조직 병리 변화 HE 염색 관찰. 빈군, sh-NC군, OE-NC군은 내막 손상, 내피세포 박리, 평활근세포 변성, 세포층 감소, 동맥벽 위축. sh-MALAT1군은 두개내 동맥 내피, 내피세포, 평활근세포층, 외막층 약간 손상但 정연 배열. OE-MALAT1군은 내피층 소실, 내피세포 박리, 탄력섬유 파열, 염증세포 침윤(Fig. 2c).

각 그룹 쥐 IA 조직 투과전자현미경 관찰. 빈군, sh-NC군, OE-NC군은 변성 내피세포, 하내피층 해체, 내부 탄력층 소실, 평활근세포 감소. sh-MALAT1군은 편평 내피세포, 타원 핵, 콜라겐 섬유 증가但 탄력층 없음. OE-MALAT1군은 내피세포 소실, 탄력층이 근육층에서 분리돼 강내로 붕해(Fig. 2d).

TUNEL 염색으로 IA 쥐 혈관내피세포 세포사멸 지수 측정. MALAT1 침묵은 세포사멸 지수 감소, 과발현은 반대 효과(Fig. 2e, f).

RT-qPCR로 MALAT1, miR-143, VEGFA mRNA 발현, 웨스턴 블롯으로 VEGFA, MMP-9, vWF 단백질 발현 측정. MALAT1 제거는 MALAT1, VEGFA, MMP-9, vWF 발현 저하, miR-143 발현 증가. MALAT1 과발현은 반대 효과(Fig. 2g, h).

MALAT1 저발현이 IA 혈관내피세포 생존율 증진, 세포사멸 억제

면역조직화학 염색으로 혈관내피 특이 표지자 vWF 발현 검출. IA 혈관내피세포 세포질에 미세 갈색 입자 덮임(양성), 음성대조군 세포질엔 갈색 입자 없음. 배양 세포가 혈관내피세포임 확인(Fig. 3a, b).

그림 3. MALAT1 저발현이 IA 혈관내피세포 생존율 증진, 세포사멸 억제. a IA 혈관내피세포 vWF 면역조직화학: 미세 황색 입자 덮임. b 음성대조군: 갈색 입자 없음. c 각 그룹 혈관내피세포 생존율(MTT). d CyclinD1, Ki-67 단백질 발현(웨스턴 블롯). e 세포 주기 변화(PI 염색). f 세포 세포사멸률(Annexin V/PI 이중 염색). g Bax, Bcl-2 단백질 발현(웨스턴 블롯). *P<0.05 vs sh-NC, #P<0.05 vs OE-NC. 측정 데이터 평균 ± 표준편차, 다그룹 비교는 일원분산분석 후 Tukey 사후 검정.

MTT, 유세포 분석, 웨스턴 블롯으로 혈관내피세포 생존율과 세포사멸 측정. MALAT1 감소는 혈관내피세포 생존율 증진(Cyclin D1, Ki-67 발현 증가), 세포사멸 억제(G0/G1기 세포 감소, S기·G2/M기 세포 증가, Bax 감소, Bcl-2 증가). MALAT1 과발현은 반대 효과(Fig. 3c-g).

miR-143이 MALAT1에 결합, VEGFA가 miR-143 표적 유전자

각 그룹 혈관내피세포 MALAT1, miR-143, VEGFA 발현 RT-qPCR과 웨스턴 블롯 검증. MALAT1 녹다운은 MALAT1, VEGFA 발현 저하, miR-143 발현 증가. MALAT1 과발현은 MALAT1, VEGFA 증가, miR-143 감소(Fig. 4a, b).

그림 4. miR-143이 MALAT1에 결합, VEGFA가 miR-143 표적 유전자. a 각 그룹 동맥류 혈관내피세포 MALAT1, miR-143, VEGFA mRNA 발현. b VEGFA 단백질 발현. c 바이오인포매틱스 예측 MALAT1-miR-143 결합 부위. d 이중 루시퍼라제 보고자 분석으로 MALAT1-miR-143 조절 관계 검증. e RNA 풀다운으로 MALAT1-miR-143 결합 검증. f 바이오인포매틱스 예측 miR-143-VEGFA 결합 부위. g 이중 루시퍼라제 보고자 분석으로 miR-143-VEGFA 조절 관계 검증. *P<0.05 vs sh-NC, #P<0.05 vs OE-NC. 측정 데이터 평균 ± 표준편차, 두 그룹 비교 독립 표본 t검정, 다그룹 비교 일원분산분석 후 Tukey 사후 검정.

온라인 분석 소프트웨어로 MALAT1-miR-143 특이 결합 영역 예측(Fig. 4c). 이중 루시퍼라제 보고자 분석 결과 MALAT1-WT+miR-143 모방군에서 루시퍼라제 활성 저하(P<0.05) vs MALAT1-WT+모방 NC군. MALAT1-MUT+miR-143 모방군에서는 MALAT1-MUT+모방 NC군 대비 루시퍼라제 활성 유의 차이 없음(P>0.05), miR-143이 MALAT1에 특이적 결합함 입증(Fig. 4d). RNA 풀다운 분석 결과 Bio-miR-143-WT군 MALAT1 풍부도 증가(P<0.05) vs Bio-miR-NC군. Bio-miR-143-MUT군에서는 유의 차이 없음(P>0.05)(Fig. 4e).

바이오인포매틱스 소프트웨어로 miR-143-VEGFA 표적 관계 예측(Fig. 4f). 루시퍼라제 활성 결과 VEGFA-WT와 miR-143 모방 동시 형질주입 시 상대적 루시퍼라제 활성 억제(P<0.05). VEGFA-MUT와 miR-143 모방 동시 형질주입 시 영향 없음(P>0.05)(Fig. 4g). VEGFA가 miR-143 직접 표적 유전자임 입증.

고찰

IA는 주로 지주막하 출혈 유발하는 심각한 두개내 질환입니다. 선행 연구에서 lncRNA 관련 경쟁성 내생 RNA 네트워크의 IA 관여 입증. 최근 연구에서 miR-143/145 유전자 프로모터 영역 기능적 다형성이 IA 위험과 연관됨 보고. Xu 등의 연구에서 VEGFA 같은 혈관신생 인자 과발현이 IA 형성·파열과 관련됨 제시. MALAT1의 IA 분자 기전 규명을 위해 일련 분석 수행 결과, 혈관내피 손상 유발 IA가 MALAT1/miR-143/VEGFA 신호 축에 의해 조절됨 확인.

첫째, 본 연구는 IA 조직에서 MALAT1, VEGFA 상향 조절, miR-143 하향 조절에 대한 실질적 증거 제공. 최근 연구에서 MALAT1이 뇌허혈 과정에서 가장 상향 조절된 lncRNA 중 하나임 보고. 다른 연구에서 MALAT1이 난소암 세포에서 상향 조절돼 세포사멸, 이동, 증식 관여함 보고. 미파열/파열 IA 발현 프로파일 연구에서 VEGFA 같은 혈관신생 인자 발현이 파열 동맥류에서 상향 조절됨 입증. 임상 연구에서 IA 환자 miR-143/145 클러스터가 건강인 대비 저하됨 보고. 또한 miR-143/145가 동맥류 형성 관련 다양한 생물학적 과정 관여, IA 환자에서 저하됨 선행 논의. 이 모든 선행 연구 결과와 어느 정도 일치.

상기 발견 외에 본 연구는 기능 획득/상실 분석으로 MALAT1의 IA 기능적 역할 탐구. 요약하면 MALAT1 저하는 혈압, 혈청 ET-1, vWF, IA 조직 MMP-9 발현 감소. 선행 제안에서 MALAT1 저하가 포도당 유도 ET-1 전사 산물 상향 조절 억제함 보고. 이소성 MALAT1 발현이 vWF 생성 유도함 보고. 다른 연구에서 골수 유래 대식세포 MALAT1 고갈이 MMP-9 발현 억제함 검증.

세포 실험으로 MALAT1 IA 기능 추가 확인. MALAT1 녹다운이 IA 혈관내피세포 생존율 증진, 세포사멸 억제함 제시. 유사하게 MALAT1 교란이 대동맥 벽 구조 개선, 동맥류 성장 지연 보고. 본 연구 발견 보완으로 MALAT1 저발현이 급성 골수성 백혈병 세포 세포사멸 유도, 증식 억제 연구. 다른 연구에서 MALAT1 녹다운이 인간 골관절염 연골세포 증식 억제 효과 입증. 선행 연구에서 MALAT1 저하가 교모세포종 세포 세포사멸 유도, 증식 약화 확인. RNA 간섭 유도 MALAT1 저발현이 다발성 골수종 세포 세포사멸 촉진, 증식 억제. 종합적으로 이 연구들이 MALAT1 IA 분자 기전 일부 설명.

또한 본 연구는 miR-143이 MALAT1에 결합, VEGFA가 miR-143 표적 유전자임 입증. 유사하게 MALAT1이 직접 miR-143 결합해 발현 억제함 주장. Zhu 등은 MALAT1이 자궁경부암 세포에서 miR-143 상호작용으로 역할 수행함 발견. MALAT1이 miR-200b-3p 매개로 VEGFA 간접 조절함 추가 확인. 다른 연구에서 miR-143-3p가 혈액 내 VEGFA 포함 다수 단백질 표적에 ZFPM2 효과 매개함 제안. 그러나 IA에서 MALAT1, miR-143, VEGFA 간 상호작용은 논의되지 않아 추가 연구 필요.

결론

이 결과들로부터 MALAT1 녹다운이 miR-143/VEGFA 축 조절로 IA 혈관내피세포 세포사멸 억제, 생존율 증진함 명확. 공발현 네트워크는 VEGFA 관여 하 MALAT1-miR-143 연결 시사. 본 연구 발견은 IA 개시·진행 병인 일부 규명, 연구 표적들이 IA 병리학을 다른 관점에서 밝힐 잠재적 진입점 될 수 있음. 단, 대규모 추가 연구로 MALAT1/miR-143/VEGFA 축 IA 기전 포괄적 규명 필요.