반응성 산소 종의 세포내 감지를 위한 양고추냉이 과산화효소로 캡슐화된 중공 실리카 나노구

결과 및 토론

HSN 및 HRP@HSN의 설계 및 합성

일반적으로 HSN과 HRP@HSN은 이전 방법에 따라 유중수(w/o) 마이크로에멀젼 시스템과 결합된 암모니아 촉매 졸겔 공정을 통해 합성되었습니다[27, 28]. 스킴 1은 HRP@HSN의 합성을 보여줍니다. TEM 이미지(그림 1)에 따르면 캡슐화된 HRP가 있거나 없는 HSN의 평균 직경은 45nm입니다(추가 파일 1:그림 S1). UA 염색은 HRP@HSN 내부에서 향상된 전자 밀도를 분명히 나타내었지만 HRP@HSN 외부에서는 염색이 관찰되지 않았으며(그림 1b), 이는 HRP 효소가 HRP@HSN의 내부 공동 내에 성공적으로 갇혔음을 나타냅니다.

양고추냉이 과산화효소로 캡슐화된 중공 실리카 나노구(HRP@HSN) 합성의 흐름도. APTMS, 3-아미노프로필트리메톡시실란; TEOS, 테트라에틸 오르토실리케이트; SSN, 고체 실리카 나노입자

a의 TEM 이미지 중공 실리카 나노구(HSN), b 우라닐 아세테이트로 염색된 HSN, c 양고추냉이 과산화효소 캡슐화 HSN(HRP@HSN) 및 d 우라닐 아세테이트로 염색된 HRP@HSN. 삽입:확대 보기

실온에서 수행된 DLS 측정 및 제타 전위 분석이 표 1에 나와 있습니다. DLS 데이터에 따르면 HSN과 HRP@HSN은 모두 유체역학적 직경이 188 ± 4 및 184 ± 6 nm인 물(pH ~ 6.5)에서 양의 제타 전위를 나타냅니다. 각각 물에. 그러나 나노입자가 무혈청 DMEM에 분산되었을 때 유체역학적 직경은 HSN의 경우 1767 ± 94nm, HRP@HSN의 경우 1598 ± 127nm로 증가했습니다. 이것은 HSN의 작은 수준의 집계를 나타내지만 여전히 미디어에서 잘 중단되었습니다. 한편, 매질에서 측정된 두 나노입자의 음의 제타 전위는 생물학적 환경의 일부 이온과 생체분자가 나노입자 표면에 흡착되었을 수 있음을 의미합니다[30, 31]. 이 조건에서 나노입자의 양전하 표면은 음전하를 띤 물질로 덮였고, 이는 정전기적 상호작용을 통해 나노입자의 응집을 빠르게 일으켰다. 비특이적 응집을 줄이고 나노 입자의 콜로이드 안정성을 촉진하기 위해 BSA(소 혈청 알부민)를 생물학적 배지에 도입했습니다[28]. 그 후, HSN 및 HRP@HSN의 유체역학적 직경은 각각 197 ± 43 및 195 ± 19nm로 상당히 감소된 유체역학적 직경을 보여주었습니다.

HRP@HSN의 HRP 포착 효율성 및 적재 용량

HRP 포획의 효율성과 로딩 용량을 조사하기 위해 형광 염료(RITC)로 표지된 HRP를 준비했습니다(RITC-HRP로 지정). RITC-HRP@HSNs의 형광 강도는 나노입자를 1M NaOH에 현탁하여 측정하였고, 캡슐화된 RITC-HRP의 양은 형광 강도 대 천연 RITC-HRP의 농도를 플롯팅하여 설정한 보정 곡선에 따라 결정되었습니다. 동일한 조건(추가 파일 1:그림 S2)에서. 포획 효율 및 로딩 용량에 대한 효소 농도의 영향을 연구하기 위해 3가지 다른 양의 HRP(11.1, 22.2, 33.3 nmol)를 합성에 도입했습니다. 이 농도 범위에서 얼마나 많은 효소를 도입했는지에 관계없이 세 가지 경우 각각에 대한 효소의 포획 효율이 약 6%였다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 이 낮은 효율은 마이크로에멀젼 액적의 일부만이 핵생성되고 HSN으로 성장한다는 사실 때문일 수 있습니다. 대부분의 마이크로에멀젼 액적은 핵이 생성되지 않았고 ~ 8 nm의 작은 크기로 남아 있었습니다[25]. 로딩 효율을 높이려면 향후 작업이 필요할 수 있습니다. 그러나 HRP@HSN의 HRP 로딩 용량은 33.3nmol의 HRP가 사용되었을 때 12.5 ± 1.2μg HRP/mg HSN으로 점차 증가했습니다(추가 파일 1:표 S1). 이는 HRP loading capacity가 반응에 존재하는 효소의 양에 의해 제어될 수 있음을 나타냅니다.

HSN 및 HRP@HSN의 세포독성 및 세포 흡수

HSN 및 HRP@HSN의 시험관 내 세포 독성을 평가하기 위해 WST-1 분석으로 세포 생존력을 조사했습니다. 추가 파일 1:그림 S3에서 볼 수 있듯이 나노입자를 2시간 또는 2시간 동안 처리한 후 추가로 24시간 동안 배양한 후 RAW264.7 세포 증식에 ​​큰 변화가 관찰되지 않았습니다. HSN 내부에 HRP의 존재 여부에 관계없이 표시된 시점에서 실리카 나노입자로 인한 세포 미토콘드리아 기능에 대한 명백한 영향은 발견되지 않았습니다.

다음으로, RAW264.7 표지에 대한 나노 입자의 농도 효과를 조사하기 위해 FITC-접합 HSN 및 HRP@HSN을 각각 준비했습니다. 유세포 분석 결과(추가 파일 1:그림 S4)에 따르면 RAW264.7 세포는 무혈청 배지에서 2시간 동안 서로 다른 농도에서 FITC-HSN 및 HRP@FITC-HSN으로 성공적으로 표지되었습니다. 두 경우 모두 라벨링 효율성의 용량 의존적 증가가 발견되었으며 RAW264.7 세포의 80% 이상이 2시간 동안> 50μg/mL 농도의 나노입자에 노출되어 라벨링되었습니다. HRP@HSN은 짧은 배양 시간으로 고효율 세포 내 라벨링, 상대적으로 적은 양의 나노 입자 및 비 세포 독성과 같은 특성으로 인해 ROS의 세포 내 검출에 적합합니다.

다양한 ROS에 대한 HRP@HSN의 반응성

TMB를 기질로 사용하는 HRP 효소 활성 분석에 따르면, HRP를 HSN으로 후속 캡슐화할 때 초기 효소 활성의 약 40%가 남아 있었습니다. 캡슐화된 효소의 관찰된 비활성(단위 시간당 단위 효소당 전환된 기질 몰)의 이러한 감소는 기질이 실리카 쉘을 가로질러 HRP로 이동할 때 발생하는 물질 전달 제한으로 인한 것일 수 있습니다[32]. 그럼에도 불구하고, 캡슐화 전략은 추가 기능을 제공합니다. 예를 들어 다공성 실리카 쉘은 반응물 및 생성물의 작은 분자의 수송을 허용하면서 단백질 분해로부터 HRP를 보호할 수 있습니다[26, 27]. 종합하면, 형광 프로브(DHR123)를 통합하여 평가한 ROS에 대한 HRP@HSNs의 관찰된 반응성은 ROS에 대한 HRP의 고유한 특성뿐만 아니라 나노입자의 친화도의 조합에서 기인할 수 있습니다.

무세포 시스템을 사용하여 과산화수소(H₂ O₂ ), TBHP, 하이드록실 라디칼(•OH), tert-부톡시 라디칼(•OtBu) 및 슈퍼옥사이드(O₂ • ⁻ ). 먼저, DHR123을 HRP 또는 HRP@HSN의 부재 및 존재하에 ROS 패널과 함께 인큐베이션한 다음 생성물 로다민 123(R123)의 형광 강도를 측정하였다. 그림 2와 같이 ROS의 종류에 상관없이 시간에 따라 형광세기를 측정하였다(30, 60, 90, 120분). 그러나 다양한 ROS 간의 강도의 명백한 차이는 DHR123의 고유한 특성에 따라 다릅니다. 한편, 이전 연구[33]와 일치하여 그림 2a는 H₂ O₂ O₂도 아님 • ⁻ DHR123을 R123으로 산화시킬 수 있습니다. 또한, DHR123은 다른 ROS에 비해 •OtBu 및 •OH 라디칼에 대해 더 높은 반응성을 나타냈다. HRP의 촉매 활성으로 인해 그림 2b, c와 같이 기본 HRP 및 HRP@HSN의 존재에서 형광 강도의 현저한 증가가 관찰되었습니다. 동일한 반응 시간에 HRP@HSN에 비해 천연 HRP의 경우에 발견된 더 높은 형광 강도는 관찰된 효소 활성과 양의 상관관계가 있음이 주목되었습니다.

아 –ㄷ 선택된 활성산소종(ROS)과 a의 반응에 대한 시간 의존적 형광 강도 디히드로로다민 123(DHR123), b DHR123 + 고추냉이 과산화효소(HRP) 및 c DHR123 + 고추냉이 퍼옥시다제 캡슐화된 HSN(HRP@HSN). d 선택된 ROS와 DHR123 + HRP 및 DHR123 + HRP@HSNs의 반응 강도 비율이 1시간에 향상되었습니다. 표시된 데이터는 20μM의 DHR123, 400ng/mL의 HRP, 50μg/mL의 HRP@HSN, 100μM의 ROS에 대한 것입니다. (*p <0.05 대 해당 시점의 대조군)

다양한 ROS를 직접 비교할 수 있도록 60분 간격의 데이터를 선택하고 대조군에 대해 정규화된 상대 형광 강도로 보고했습니다(추가 파일 1:그림 S5). 향상된 강도 비율의 후속 분석은 DHR123 + HRP 또는 DHR123 + HRP@HSNs의 상대 형광 강도를 DHR123으로 나누어 표시했습니다(그림 2d). 두 HRP 함유 사례에서 다양한 ROS에 대한 강화된 강도 비율의 유사한 경향과 H₂에 대한 DHR123의 반응성의 상당한 증가 O₂ 및 O₂ • ⁻ 캡슐화된 HRP가 높은 수준의 고유 효소 활성을 제공하고 HRP@HSN의 실리카 껍질이 작은 분자의 수송을 허용하여 선택적 생체 촉매 작용을 수행할 수 있음을 보여주는 것으로 관찰되었습니다.

HRP@HSN을 사용한 세포내 ROS 감지

세포 내 HRP@HSN의 ROS 감지 기능을 평가하기 위해 RAW264.7 대식세포를 HRP@HSN과 함께 2시간 동안 배양한 다음 세척한 다음 DHR123(20μM)과 함께 30분 동안 배양했습니다. 그 후, 세포를 세척하고 추가 1시간 동안 PMA(1μg/mL)로 처리했습니다. PMA로 대식세포를 자극하면 슈퍼옥사이드가 생성되고, 이는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 또는 자발적인 디스뮤테이션에 의해 과산화수소로 변환되는 것으로 알려져 있습니다[34,35,36]. 따라서 PMA는 H₂를 생성하는 자극제로 기능할 수 있습니다. O₂ RAW264.7 대식세포에서 세포내 H₂ 평가 O₂ - HRP@HSN의 감지 기능. 그림 3a에서 볼 수 있듯이, 단독으로 배양한 RAW264.7 대식세포와 HSN과 함께 배양한 경우 모두 유세포 분석에서 약한 형광을 보였으며, 이는 자극되지 않은 세포가 약한 기초 수준의 ROS를 생성했음을 나타냅니다. HSN의 존재. 또한, HRP@HSN으로 처리된 세포는 상당한 강도 증가를 보여(그림 3a), 전달된 HRP@HSN이 세포 내부에서 추가적인 촉매 활성을 제공했음을 시사합니다.

아 나노 입자의 존재 및 부재에서 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)의 유무에 관계없이 자극된 RAW264.7 대식세포의 유세포 분석. ㄴ PMA 및 c 양고추냉이 과산화효소 캡슐화 HSN(HRP@HSNs) 농도는 RAW264.7 대식세포의 형광을 의존적으로 변경했습니다. d 표시된 조건에서 RAW264.7 대식세포의 대표적인 형광 이미지. 스케일 바 50μm

자극 실험의 경우, PMA 처리된 세포는 일반적으로 자극되지 않은 세포에 비해 2배 이상 더 높은 수준의 R123 형광을 생성했습니다. 또한, HRP@HSN으로 처리된 세포가 가장 높은 수준의 형광을 보였고, HSN이 그 다음으로, 세포 단독이 그 뒤를 이었다. 자극된 RAW264.7 대식세포를 HSN으로 처리하면 대조군에 비해 형광 강도가 약간 증가하는 것으로 나타났습니다. 이 결과는 세포 스트레스 반응이 매우 빠르게 유발되고 나노입자에 대한 노출을 포함한 외부 자극에 민감함을 시사합니다[37]. 또한, PMA(0.1, 0.25, 0.5, 1, 2μg/mL)와 HRP@HSN(50, 100, 200μg/mL)은 그림 3에서 명백한 바와 같이 용량 의존적 방식으로 R123의 발현을 유도했습니다. . 3b, c.

유세포 분석에 따라 그림 3d는 나노 입자의 존재 및 부재하에 PMA를 사용하거나 사용하지 않고 자극된 RAW264.7 대식세포의 대표적인 형광 이미지를 표시합니다. 시스템은 내인성 H₂를 시각화할 수 있었습니다. O₂ RAW264.7 세포에서 가장 약한 형광 강도가 발생했으며 HRP@HSN으로 처리한 후 PMA 자극으로 처리한 세포에서 가장 약한 형광 강도가 관찰되었습니다. 그림 4a에서 볼 수 있듯이, 자극제 PMA 또는 외인성 H₂의 존재하에서 RAW264.7 대식세포의 세포 생존력 O₂ WST-1 분석에 의해 조사되었습니다. ROS가 세포 사멸에 연루된 반면 [38], 표시된 시점에서 세포 생존력에 대한 작은 영향만 발견되어 다음과 같은 반정량적 분석이 실용적이고 의미가 있습니다.

아 외인성 H₂ 처리 후 RAW 264.7 대식세포의 WST-1 분석 O₂ 또는 1시간 동안 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)로 자극합니다. ㄴ H₂ 농도 검출 O₂ HRP@HSNs 및 dihydrorhodamine 123(DHR123)이 있는 상태에서 다양한 농도의 PMA 자극제에서 RAW264.7 대식세포에 의해 내인적으로 생성됩니다. 삽입:H₂의 외부 표준에서 얻은 검량선 O₂ HRP@HSN 및 DHR123과 혼합

Application of HRP@HSNs In Vitro for Quantitative Analysis of H₂ O₂

To evaluate the capacity of HRP@HSNs for quantifying endogenous hydrogen peroxide produced in PMA-stimulated RAW264.7 cells, a calibration curve from the exogenous H₂ O₂ experiment, with a detection range of 0.625~15 μM, was established by microplate measurements (Fig. 4b, inset). The standard calibration curve appears to be linear as expected. Then, RAW264.7 cells were treated with 100 μg/mL of HRP@HSNs for 2 h, followed by co-incubation with various concentrations of PMA and 20 μM of DHR123 at 37 °C for 1 h. After that, the concentration of H₂ O₂ endogenously produced by PMA-stimulated RAW264.7 cells was determined by measuring the fluorescence intensity, followed by conversion using the established calibration curve. Notably, because most of the HRP@HSNs were uptaken within the cells, the H₂ O₂ -triggered fluorescence of R123 could be attributed to intracellular enzyme-catalyzed reactions rather than the extracellular contribution. Although H₂ O₂ is able to diffuse across biomembranes, due to its limited diffusion and rapid enzymatic consumption inside cells, concentration gradients of H₂ O₂ are formed across membranes [39, 40]. Typically, under normal physiological conditions, H₂ O₂ has an extracellular concentration estimated at 10 ^− 7 ~10 ^− 6  M, which is about 10-fold higher than that observed in intracellular fluid [1, 41, 42]. In pathological conditions, extracellular concentrations of H₂ O₂ are in the range of 10~50 μM and are additionally elevated to as high as 10 ^− 4  M in apoptosis [1]. As shown in Fig. 4b and Additional file 1:Table S2, endogenous hydrogen peroxide caused by PMA-stimulated RAW264.7 cells was created in a dose-dependent manner and produced at levels of about 10 μM when the concentration of PMA used exceeded 0.25 μg/mL. Taken together, these results indicate that HRP@HSNs were capable of detecting semi-quantitatively endogenous the concentration of hydrogen peroxide of RAW264.7 macrophages under oxidative stress conditions.