반응성 산소종(ROS)은 세포 신호전달에 핵심적이나, 과도 생성 시 산화적 손상을 유발합니다. 따라서 살아있는 세포에서 ROS를 정밀하게 정량하는 것은 기초 생물학과 임상 진단 모두에 필수적입니다. 기존 형광 프로브와 과산화효소(HRP) 조합은 HRP의 낮은 세포막 투과성으로 한계가 있습니다. 본 연구에서는 미세유제-주형 졸겔법으로 제조한 과산화효소 캡슐화 중공 실리카 나노구체(HRP@HSNs)를 제시합니다. 이 나노반응기는 견고한 효소 활성을 유지하며, 세포막을 쉽게 통과하고 우수한 생체적합성을 보입니다. 디하이드로로다민 123(DHR123) 프로브와 결합하여 활성화된 RAW 264.7 대식세포에서 세포 내 과산화수소(H₂O₂)를 정성 및 반정량적으로 검출했습니다. 이 플랫폼은 표적 리간드로 쉽게 기능화할 수 있어 세포소기관 또는 세포 유형 특이적 ROS 이미징이 가능합니다.
ROS(초과산화물, 과산화수소, 하이드록실 라디칼, 단일항 산소, 페록시나이트라이트 등)는 호기성 대사 중 지속적으로 생성되며, 주로 미토콘드리아 전자전달계에서 기인합니다. 항산화 방어 시스템(효소적: 초과산화물 디스뮤타아제, 카탈라아제, 페록시데이스 등; 비효소적: 비타민 A, C, E, 요산, 빌리루빈 등)은 보통 이들을 중화시킵니다. 불균형 시 산화 스트레스가 발생하여 DNA, 지질, 단백질 손상을 초래하고 당뇨병, 암, 심혈관 및 신경퇴행성 질환(알츠하이머, 파킨슨병)의 원인이 됩니다[1-5].
최근 형광 현미경 기술 발전으로 비침습적 단일 세포 ROS 이미징이 가능해졌으며, 주로 비형광 전구체가 산화되어 형광을 띠는 비율 기반 또는 강도 기반 프로브를 이용합니다[6-8]. 특이성이 중요하며, 예를 들어 보론산염 기반 프로브는 생체직교적 산화를 통해 H₂O₂를 표적화합니다[9]. 그러나 많은 프로브는 생체 내 불안정, 조직 투과성 낮음, 빠른 신장 배설 등의 한계가 있습니다[12-14]. 안정화 링커, 유전자 인코딩 센서, 생물발광 리포터, PET 트레이서 등의 전략이 탐구되었습니다[15-18]. 나노 제형은 특이성과 민감도를 높여 ROS 이미징을 향상시킵니다[19-22].
높은 촉매 활성을 가진 효소는 강력한 바이오센서이나, 유리 효소 형태는 안정성과 세포막 투과성이 낮아 세포 내 적용이 제한적입니다. 전극 기반 HRP 센서는 살아있는 세포 이미징에 부적합합니다. HRP를 나노입자 껍질 내에 캡슐화하면 효소를 보호하고 세포 내 전달을 용이하게 할 수 있으며, 중공 실리카 나노구체(HSNs)로 이를 입증한 바 있습니다[25-27]. 본 연구는 HRP@HSNs의 세포 내 ROS 검출 적용성을 평가하며, 로딩 효율, 활성, 세포 섭취, 세포독성, 대식세포에서의 기능적 이미징을 검토합니다.
데케인, n-헥사놀(98%), 암모니아수(35% w/w), TEOS(98%), APTMS(95%), FITC 등은 ACROS와 Sigma-Aldrich에서 구입. HRP(type VI-A), DHR123, PMA, H₂O₂(35%)는 Cayman과 SHOWA Chemical Industry 제품. 모든 시약은 수령 즉시 사용.
선택적 식각을 동반한 물-유리 미세유제법으로 HSNs를 제조했습니다(기존 프로토콜 참조[25, 29]). 간단히, 20 mL 데케인, 1.63 mL CA-520, 550 µL n-헥사놀을 650 rpm으로 교반 후 350 µL 물을 가해 미세유제를 형성. APTMS(25 µL, 1.4 mL 에탄올에 200 µL)와 TEOS(100 µL)를 주입한 뒤 250 µL 35% 암모니아를 20°C에서 첨가. 10시간 후 95% 에탄올로 유제 파괴, 원심분리(11,000 rpm, 20분)로 고체 실리카 나노입자(SSNs) 수득. SSNs를 40°C 물에서 40분 식각해 중공 쉘 형성, 세척 후 99.5% 에탄올에 보관.
HSNs 합성 과정과 동일하나, 350 µL 물을 350 µL 수용성 HRP(10 mg/mL)로 대체. HRP@HSNs는 4°C에서 탈염수에 보관.
녹색 형광 도입을 위해 FITC-APTMS(10 mg FITC, 200 µL APTMS를 1.4 mL 에탄올에, 18시간 암반응)로 에탄올 APTMS를 대체하여 FITC-HSNs와 HRP@FITC-HSNs 제조.
HRP를 RITC로 표지해 RITC-HRP 제조 후 캡슐화하여 RITC-HRP@HSNs 형성. 1 M NaOH로 용해 후 형광 측정(Hitachi F-4500, λ_ex=543 nm, λ_em=550-650 nm)하여 검량선과 비교. 포집 효율(%) = (나노구체 내 RITC-HRP 질량 / 초기 RITC-HRP) × 100; 로딩 용량(µg HRP/mg HSNs) 산출.
발색 기질 TMB로 HRP 활성 정량. 효소 용액(유리 HRP 및 HRP@HSN)에 20 µM TMB와 20 µM H₂O₂를 인산/시트르산 완충액(pH 5.2)에 혼합. BioTek Synergy 리더로 655 nm 흡광도 측정, 유리 HRP 검량선으로 활성 산출.
DHR123(20 µM) 단독 또는 HRP@HSNs(50 µg/mL)와 함께 100 µM ROS(H₂O₂, TBHP, 초과산화물, •OH, •OtBu)를 DMEM(pH 7.4)에서 배양. 형광(λ_ex=488 nm, λ_em=530 nm)을 120분 동안 5분 간격 측정.
RAW264.7 대식세포를 DMEM + 10% FBS + 항생제, 37°C, 5% CO₂ 배양. 생존율: 2×10⁵ cells/well을 24웰 플레이트에 시딩, 24시간 후 0-200 µg/mL 나노입자를 무혈청 DMEM에서 2시간 노출. WST-1 시약(Clontech)으로 생존율 측정(450 nm, 기준 650 nm), Bio-Rad 680 리더 사용.
1×10⁶ RAW264.7 cells/well에 0-200 µg/mL FITC 표지 나노입자 2시간 배양. 세척 및 트립신 처리 후 유세포분석기로 섭취량 정량; 트립판 블루로 세포외 형광 소광.
2시간 나노입자 처리 후 30분 DHR123 로딩, 1 µg/mL PMA로 1시간 자극 후 FACS Canto II로 분석.
96웰 플레이트에 3×10⁴ RAW264.7 cells/well 시딩. 2시간 나노입자 처리 후 1시간 PMA(농도 변화) + DHR123(20 µM) 배양, 형광 측정(λ_ex=488 nm, λ_em=530 nm). 외부 H₂O₂ 검량선(HRP@HSN)으로 형광을 H₂O₂ 농도로 변환.
TEM(JEOL JEM-1200 EX II, 100 kV)로 45 nm 중공 코어 확인; 우라닐 아세테이트 염색으로 내부 HRP 검증. 동적 빛산란(Malvern Zetasizer Nano ZS)으로 수동적 크기와 제타 전위 측정; Zeiss Axio Observer Z1로 세포 이미징.
HRP@HSNs는 암모니아 촉매 졸겔 화학으로 w/o 미세유제 내에서 제조했습니다(Scheme 1). TEM(그림 1)은 단분산 45 nm 구형 입자; 우라닐 아세테이트 염색으로 중공 공동 내 HRP 캡슐화 확인. DLS로 수동적 직경: HSNs 188 ± 4 nm, HRP@HSNs 184 ± 6 nm(물에서), 무혈청 DMEM에서 1.8-1.7 µm로 응집 증가. 소 혈청 알부민(BSA) 첨가로 응집 억제, 195-197 nm 안정한 입자 확보.
RITC-HRP 캡슐화로 11-33 nmol 로딩 범위에서 약 6% 포집 효율; 최대 로딩 용량 33.3 nmol 투입 시 12.5 ± 1.2 µg HRP/mg HSN. 효율은 보통이나 HRP가 나노공동 내 유지됨을 보이며, 효소 농도로 로딩 조절 가능.
WST-1 분석에서 2시간 또는 26시간, 200 µg/mL까지 HSNs 및 HRP@HSNs 노출 시 RAW264.7 증식에 유의미한 감소 없음, 낮은 세포독성 확인. FITC 표지 입자는 50 µg/mL 이상에서 2시간 후 80% 이상 표지 효율, 세포 생존력 저해 없이 효율적 세포 내 전달 입증.
HRP 활성 분석 결과 캡슐화 후 약 40% 활성 유지, 실리카 쉘의 확산 제한 탓으로 추정. 무세포 분석에서 DHR123 단독은 H₂O₂나 초과산화물에 무반응이나 •OH와 •OtBu엔 강하게 반응. HRP 또는 HRP@HSNs 첨가 시 모든 시험 ROS에 대해 형광 신호 대폭 증폭, 유리 HRP가 더 높은 신호 보임(더 높은 활성 때문). 60분 시점 상대 형광 비율로 볼 때, 두 HRP 변형 모두 H₂O₂와 초과산화물 검출 증진, 나노공동이 촉매 기능 보존하면서 기질 확산 허용함 확인.
HRP@HSNs(2시간 전처리) 및 DHR123(30분 로딩) 후 PMA 자극한 RAW264.7 세포에서 대조군 대비 현저히 높은 형광 관찰. 유세포분석으로 자극 세포에서 R123 형광 2배 이상 증가; HRP@HSNs가 추가 촉매 활성 전달, 일반 HSNs는 세포 스트레스 반응으로 인한 미미한 형광 증가만 보임. 형광 강도는 PMA(0.1-2 µg/mL) 및 HRP@HSNs(50-200 µg/mL) 농도 의존적 증가. 공초점 이미지로 세포 내 ROS 이미징 향상 확인(그림 3d).
외부 H₂O₂ 검량선(0.625-15 µM)으로 PMA 자극 RAW264.7 세포의 세포 내 H₂O₂ 정량. 100 µg/mL HRP@HSNs 및 20 µM DHR123 처리 세포에 0.1-2 µg/mL PMA 노출 시, ≥0.25 µg/mL PMA에서 약 10 µM 내생 H₂O₂ 산출. 이 반정량 측정은 살아있는 세포에서 산화 스트레스 평가에 본 플랫폼의 유용성을 입증.
활성 HRP를 캡슐화한 중공 실리카 나노구체를 제작하여 견고한 세포 내 ROS 센서를 구현했습니다. 다공성 실리카 쉘은 작은 기질의 효소 접근을 허용하면서 HRP를 단백질 분해로부터 보호합니다. DHR123과 결합한 HRP@HSNs는 산화 스트레스 하의 대식세포에서 내생 H₂O₂를 향상된 반정량적 검출이 가능합니다. 항체나 펩타이드로 표면 기능화하면 세포소기관 또는 종양 세포 특이적 표적화가 가능하며, 대체 탑재물(나노촉매, 보론산염 프로브 등)로 센싱 레퍼토리 확장 가능. 이 나노반응기는 생의학 연구와 임상 진단에서 동시 ROS 이미징, 정량, 표적 치료 전달을 위한 다용도 플랫폼을 제시합니다.
나노물질
초록 고감도 비접촉 모드 온도 감지는 기초 화학 반응, 생물학적 과정 연구 및 의료 진단 응용에 필수적입니다. 나노스케일 기반 온도계는 아세포 수준의 해상도로 민감하고 정밀한 온도 감지를 위한 비침습적 프로브를 제공합니다. 형광 기반 온도 센서는 비접촉 모드로 작동하며 세포 이미징과 분자 수준의 온도 감지라는 이중 기능을 제공하므로 큰 잠재력을 보여주었습니다. 나노소재와 나노기술의 발전으로 나노온도계(나노스케일에서 높은 공간 해상도를 가진 새로운 온도 감지 소재)와 같은 새로운 센서가 개발되었습니다. 이러한 나노온도계는 형광 단백질
요약 광학 도파관의 특성과 유연 광학 소재의 물성을 바탕으로 촉각 인식을 위한 유연하고 신축성 있는 광학 도파관 구조를 제안합니다. 이 도파관의 센싱 원리는 외부 힘에 의한 기계적 변형이 출력 광 손실을 유발한다는 점에 기반합니다. 이는 불규칙한 표면에 적응하지 못하는 기존 경질 광학 도파관 소자의 한계를 극복합니다. 유연 신축성 도파관은 나노 복제 몰딩 공정으로 제작되었으며, 촉각 센싱 분야에서 압력과 변형률 측정에 적용되었습니다. 제작된 도파관은 0~12.5%의 변형률 검출 범위와 0~23×10–3 N의 외부 힘 검출 범위를 보
