이중 약물 전달을 위한 나노리포좀 기반 시스템의 물리화학적 특성에 대한 조사

결과 및 토론

나노리포솜 특성에 대한 준비 과정의 영향

이중 약물 캡슐화된 나노리포좀은 ERL을 지질 이중층 막으로, DOX를 나노리포좀의 내부 구획으로 캡슐화하여 제조되었습니다. ERL만으로 캡슐화된 리포솜은 수성 AS 용액으로 ERL이 포함된 지질 막을 수화하여 제조하였다. 이러한 과정에서 ERL 분자는 소수성 인력을 통해 지질막으로 통합된 다음 자발적으로 리포솜의 지질 이중층 막으로 캡슐화됩니다. 수화 후, 리포좀 현탁액을 혼형 프로브 초음파 분쇄기를 사용하여 초음파 처리하여 리포좀 직경을 감소시켰다. 초음파 처리 및 냉각 방법이 리포솜 직경에 미치는 영향을 조사하기 위해 다양한 냉각 조건에서 초음파 처리 시간을 증가시키면서 리포솜을 처리하고 그 결과를 그림 2에 나타내었습니다. 그림 2a는 초음파 처리 시간이 리포솜 직경에 미치는 영향을 나타냅니다. 빙수조의 냉각 조건에서 처리된 리포솜의 직경 및 다분산 지수(PDI). 초음파 처리되지 않은 ERL 캡슐화 리포솜의 직경은 759 ± 44 nm였습니다. 그러나 10분의 초음파 처리까지는 리포솜 직경이 222 ± 40 nm로 현저히 감소하였고, 10분 후에는 초음파 처리 시간이 증가함에 따라 직경의 큰 변화가 없었습니다. 이러한 결과는 수화에 의해 형성된 ERL 캡슐화 리포솜이 대부분 다중층 소포(MLV)임을 나타냅니다. 초음파 처리를 통해 MLV 유형 리포솜에 전달된 높은 에너지는 MLV의 다층을 박리하고 큰 리포솜을 분해합니다. 수용액에서 MLV에서 분리된 지질은 소수성 인력을 통해 자가 조립되어 큰 단층 소포(LUV) 또는 작은 UV(SUV) 유형 나노리포솜으로 변형됩니다. 이러한 현상이 반복되면서 평균 나노리포솜 직경은 점차 감소합니다[24,25,26]. 도 2a에 나타난 바와 같이, 리포솜의 직경은 초음파 처리의 짧은 기간에 현저하게 감소하였다. 이 기간 동안 대부분의 MLV형 리포솜이 LUV형 또는 SUV형 리포솜으로 전환된 것으로 생각된다[27]. 10분 이상의 초음파 처리는 리포솜 직경의 약간의 감소를 유발하여 초음파 처리 시간에 따른 소포 유형의 변형이 적음을 나타냅니다. 리포좀 직경의 PDI는 초음파 처리 시간이 증가함에 따라 감소하였으며, 이는 20분 후에 PDI가 약간 증가함에도 불구하고 시간이 지남에 따라 리포좀 직경이 균일해짐을 시사한다. 그림 2b는 수조의 냉각 조건에서 처리된 리포솜의 직경과 PDI에 대한 초음파 처리 시간의 영향을 나타냅니다. 초음파 처리되지 않은 리포솜의 직경은 1433 ± 143 nm였습니다. 리포솜 직경은 초음파 처리 5분까지 337 ± 67 nm로 크게 감소했으며 5분 후에는 15분까지 직경이 점진적으로 감소한 후 직경의 변화가 거의 없었습니다. 리포솜 직경의 PDI는 15분까지 초음파 처리 시간에 따라 변했으며 그 후 안정기에 도달했습니다. 수조 조건에서 리포좀 직경을 미처리 리포좀 직경의 30% 미만으로 줄이는 데 소요된 시간은 얼음 수조 조건에서 소요된 시간보다 짧았습니다. 리포솜 직경의 감소는 초음파 처리에 의해 생성된 열 에너지가 MLV형 리포솜으로 전달되어 이루어진 것으로 생각된다. 빙수조 조건에 비해 수조 조건에서 초음파 처리된 리포솜 현탁액의 온도가 너무 높아 초음파 캐비테이션에 의한 벌크 가열로 인해 발생한 리포솜 현탁액의 열이 덜 효율적으로 방출됨을 의미합니다. 매체 증발 및 과열로 인한 지질 분자의 가능한 열화와 같은 부작용으로부터 리포솜 현탁액을 유지하기 위해 초음파 처리를 위한 냉각 조건으로 얼음물 욕조를 선택했습니다. 한편, 초음파 처리된 리포좀을 투석하여 캡슐화되지 않은 AS를 제거하였다. 초음파 및 투석을 사용하여 제조된 ERL 및 AS 캡슐화된 나노리포좀은 평균 나노리포좀 직경의 약 140 nm를 가졌으며, 이는 투석을 통한 나노리포좀 직경의 약간의 감소를 시사합니다. ERL- 및 AS-캡슐화된 나노리포좀은 AS-구배 방법을 사용하여 나노리포좀의 내부 구획으로 DOX 캡슐화에 사용되었습니다.

프로브 초음파 처리 시간이 ERL 캡슐화 나노리포좀의 직경 및 다분산 지수에 미치는 영향:얼음물 욕조(a ) 또는 수조(b ) 초음파 처리 중 용기에서 리포솜 현탁액 냉각(n =3, 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됨)

그림 3은 DOX 로딩 과정에서 목욕 초음파 분쇄기를 사용한 초음파 처리 시간에 따른 DOX 및 ERL 캡슐화 나노리포좀의 직경을 보여줍니다. 직경의 낮은 변화는 그림 2a와 같이 ERL 캡슐화 나노리포좀의 초음파 처리 10분 후의 변화와 유사했습니다. 초음파 처리 시간의 증가에도 불구하고 나노리포솜 직경은 초음파 처리 45분까지 크게 변하지 않았습니다. 이러한 결과는 DOX 및 ERL이 캡슐화된 나노리포좀이 LUV 또는 SUV라는 사실에 기인할 수 있다[27]. 한편, 초음파 처리 시간이 45분 이상인 경우 평균 나노리포솜 직경의 SEM 증가가 발생하여 리포솜 샘플 간의 차이가 증가함을 알 수 있었다. 초음파 처리 시간이 증가함에 따라 직경의 PDI가 감소했습니다. 이러한 결과는 초음파 처리 60분 후 PDI가 약간 증가함에도 불구하고 초음파 처리 시간에 따라 리포솜 직경의 균일성이 증가함을 시사합니다. 요컨대, 초음파 처리에 의한 나노리포솜 직경의 변화는 리포솜이 MLV에서 LUV 또는 SUV로 변환되는 변환 단계에서 가장 높았습니다. 따라서 리포좀 직경 감소를 위한 초음파 처리는 지질막의 수화와 ERL이 캡슐화된 나노리포좀의 내부 구획으로 DOX 캡슐화 사이에 비교적 짧은 기간 동안 처리를 수행할 때 가장 효과적이었습니다.

DOX 및 ERL 캡슐화된 나노리포좀의 직경 및 다분산 지수에 대한 목욕 초음파 처리 시간의 효과(n =3, 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됨)

EE에 대한 약물 로딩 방법의 영향

이중 약물 캡슐화 나노리포솜은 약 30% EE의 ERL 및 140nm의 나노리포솜 직경을 갖는 ERL 캡슐화 나노리포솜에 DOX 로딩을 사용하여 제조되었습니다. 리포좀에서 캡슐화된 DOX 또는 ERL의 양은 리포좀으로부터 약물의 완전한 방출을 위해 계면활성제로 리포좀을 파괴한 후 측정되었습니다. DOX의 형광강도와 ERL의 흡광도는 각각 분광형광법과 UV-Vis 분광법으로 측정하였다. ERL 및 DOX 캡슐화된 나노리포좀에서 DOX의 EE에 대한 DOX 로딩 방법의 영향을 조사하기 위해 pH 구배 또는 AS 구배 방법과 같은 능동 로딩 방법을 리포좀으로의 DOX 캡슐화에 사용했습니다. 두 가지 약물 로딩 방법 간의 EE 차이를 조사하였고, 그 결과를 Fig. 4에 나타내었다. AS-gradient 방법을 사용한 DOX의 EE는 90% 이상이었고, pH-gradient를 사용한 EE는 약 17%로, AS-구배 방법이 pH-구배 방법보다 DOX 캡슐화에 훨씬 더 효과적임을 나타냅니다[28].

DOX 로딩 방법 및 황산암모늄(AS) 농도에 따른 이중 약물 캡슐화 나노리포좀에서 DOX의 캡슐화 효율:CA 시트르산(n =3, 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됨)

AS 농도에 따른 DOX의 EE 변화를 비교한 결과 EE의 EE가 가장 높았고 SEM은 350mM AS에서 가장 낮았다. AS-gradient 또는 pH-gradient 방법은 나노리포좀의 막관통 이온 농도 구배에서 생성된 추진력으로 인해 나노리포좀 외부의 약물이 나노리포좀 내부 구획으로 이동하도록 유도하는 약물 전위 메커니즘을 사용합니다[29, 30]. 그러나 AS-gradient 방법에 의한 DOX의 EE는 pH-gradient 방법보다 상당히 높았다. 이러한 결과는 이온화된 DOX와 나노리포좀 내부의 반대이온 사이의 결정성이 더 높기 때문에 AS-gradient 방법이 pH-gradient 방법보다 결정성 복합체 개발에 더 효과적이라는 사실에 기인할 수 있습니다[31, 32].

EE에 대한 약물 로딩 조건의 영향

DOX 로딩 과정에서 DOX 용액과 ERL 캡슐화 나노리포좀의 혼합물에 대한 처리 조건이 DOX의 EE에 미치는 영향을 조사하기 위해 그림 5a에 표시된 4개의 실험 그룹을 설계하고 다양한 처리 조건에 따라 실험했습니다. 그룹 1은 배양, 초음파 처리, 밤새 투석의 순서로 처리된 혼합물이었다. 그룹 2에서 초음파 처리된 혼합물의 평형 효과가 EE에 미치는 영향을 조사하기 위해 혼합물을 인큐베이션하고 초음파 처리하고 실온에서 30분 동안 평형화한 다음 밤새 투석했습니다. 장기간 초음파 처리가 EE에 미치는 영향을 조사하기 위한 그룹으로 그룹 3은 혼합물을 배양하고 65°C에서 15분 동안 초음파 처리한 후 밤새 투석했습니다. 또한, 장기 초음파 처리 및 평형이 EE에 미치는 영향을 조사하기 위한 그룹으로 그룹 4는 혼합물을 배양하고 65°C에서 15분 동안 초음파 처리하고 실온에서 30분 동안 평형화한 후 밤새 투석했습니다. 모든 그룹에서 DOX-loading은 AS-gradient 방법을 사용하여 수행되었습니다. 그림 5b에서 볼 수 있듯이 그룹 1, 2, 3, 4의 DOX의 EE는 각각 93 ± 7.8, 98 ± 2.5, 83 ± 4.9, 59 ± 4.2%였습니다. 그룹 3의 EE와 비교하여 그룹 1의 EE가 더 높았으며, 이는 목욕 초음파 처리의 더 짧은 기간이 나노리포좀에서 EE를 증가시키는 더 효과적인 치료임을 나타냅니다. 그룹 1의 EE와 비교할 때 그룹 2는 DOX의 EE가 더 높았습니다. 그룹 4의 EE는 실험된 모든 그룹 중에서 가장 낮았습니다. 그룹 2에 적용된 단기 초음파 처리 후 평형에 의한 EE 향상과 대조적으로 그룹 4에 적용된 장기 초음파 처리 후 평형은 EE 향상에 효과적이지 않았습니다. 이러한 결과는 위에서 설명한 목욕 초음파 처리 중에 나노리포좀을 방해할 수 있는 현탁액에 전달된 과도한 양의 에너지 때문일 수 있습니다. 또한, 3군과 4군에서 장기간의 목욕 초음파 처리에 의해 나노리포좀 내 AS 함량의 감소로 인해 EE가 낮아졌다고 생각된다. 나노리포솜 현탁액의 온도가 상전이 온도(T _ㄷ ) 장기간 목욕 초음파 처리에 의해 지질 이중층의 유동성이 증가하여 리포솜에서 AS 방출을 유도했습니다. 그룹 3의 나노리포좀 샘플은 목욕 초음파 처리 직후에 투석되었으며, 이는 샘플의 급속 냉각을 시사합니다. 대조적으로, 그룹 4의 나노리포좀 샘플은 AS 방출을 유지하고 리포좀 외부의 DOX-황산염 복합체 형성을 증가시켜 EE를 낮출 수 있는 평형에 이어 장기간 목욕 초음파 처리로 처리되었습니다. 장기간 초음파 처리 후 평형은 효과적이지 않았지만 이러한 결과는 DOX 용액과 ERL 캡슐화된 나노리포좀의 혼합물의 순차적 처리와 같은 DOX 로딩 과정(T _ㄷ 인지질, 목욕 초음파 처리, T 이하의 평형 _ㄷ 예를 들어, 실온에서 야간 투석은 평형 치료를 하지 않는 다른 과정보다 EE를 증가시키는 더 효과적인 방법입니다[33,34,35].

다양한 약물 로딩 조건에 따른 이중 약물 캡슐화 나노리포좀에서 DOX의 캡슐화 효율:각 실험군에 대한 약물 로딩 조건(a ) 및 실험군의 약물 캡슐화 효율(b ) (n =3, 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됨)

이중 약물 캡슐화 나노리포좀의 형태 및 물리적 안정성

그림 6은 TEM으로 관찰한 나노리포좀의 형태를 보여줍니다. TEM 관찰을 위한 샘플은 탄소 코팅된 구리 그리드에 ERL- 및 DOX-공동 캡슐화된 나노리포좀을 드롭-캐스팅하고 실온에서 공기 중에서 건조하여 준비했습니다. 이중 약물이 봉입된 리포좀과 단일 약물이 봉입된 리포좀의 특성을 비교하기 위해 ERL 봉입 또는 DOX 봉입 나노리포좀의 형태를 TEM으로 관찰하였다. 도 6a에 도시된 바와 같이 이중 약물이 봉입된 나노리포좀의 직경은 200nm 미만이었고 모양은 거의 구형이었다. TEM 분석을 통해 관찰된 리포솜 직경은 동적 광산란을 이용한 입도 분석기로 측정한 값과 일치하였다. 그림 6b는 리포솜 내부에 DOX-황산염 복합체를 포함하는 단일 나노리포솜의 이미지를 보여줍니다. 착물은 양성자화된 DOX 양이온과 2가 황산염 음이온 사이의 인력에 의해 형성된 결정으로 가정되었습니다[36]. 그림 6c는 고해상도(HR-) TEM 이미지로 그림 6b에 존재하는 나노리포솜의 최외곽 영역에 약물 결정을 나타냅니다. 이미지는 nanoliposome의 내부 구획에 있는 높은 결정성 격자와 덜 결정성인 도메인이 그리드의 탄소에 가까운 무정형 도메인을 가지고 있음을 보여주었습니다[37]. 나노리포좀의 가장 바깥쪽 영역에 있는 비정질 도메인은 높은 에너지로 전자빔에 노출되었을 때 지질 이중층의 불안정성 때문일 수 있다. 그림 6d에 있는 SAED(Selected Area Electron Diffraction) 패턴은 밝은 회절 반점의 규칙성을 보여 그림 6c에 표시된 결정이 고도로 정렬된 결정 격자를 가지고 있음을 나타냅니다[38]. 이중 약물 캡슐화 나노리포좀의 TEM 분석 결과를 단일 약물 캡슐화 나노리포좀과 비교하기 위해 ERL 캡슐화 나노리포좀을 TEM으로 관찰하고 이미지를 그림 6e에 나타내었다. 도 6e에 존재하는 나노리포좀의 최외곽 영역을 HR-TEM으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 6f에 나타내었다. From the result, it was found that the outermost region was composed of a number of small crystals and amorphous domains adjacent to the carbon on the grid. Figure 6g shows a SAED pattern of the crystals shown in Fig. 6f. The SAED pattern exhibited a ring made up of small spots arising from the individual crystals. Therefore, it is considered that the ERL intercalated between the lipid bilayer are present as small crystals with less ordered orientation [39]. On the other hand, as the other comparison, TEM analysis of the DOX-encapsulated nanoliposomes was carried out and the result is shown in Fig. 6h. The morphology and the diameter of the nanoliposome observed by TEM were similar to those of the dual drug-encapsulated nanoliposome. The HR-TEM image shown in Fig. 6i confirmed the crystalline lattice of the DOX-sulfate formed inside of the DOX-encapsulated liposome. The SAED pattern shown in Fig. 6j suggest that the crystals inside the liposome have a highly ordered crystalline lattice. These results verify that the diffractions of the ERL- and DOX-encapsulated nanoliposome by the electron beam were originated predominantly not by the ERL crystals in the lipid bilayer but by the DOX-sulfate crystals inside the nanoliposome. In summary, the morphology of the dual drug-encapsulated nanoliposomes and the crystals of each drug formed in the liposomes were identified by TEM, HR-TEM, and SAED analyses [40].

Transmission electron microscopy (TEM) and selected area electron diffraction (SAED) analyses of dual drug- or single drug-encapsulated nanoliposomes:ERL- and DOX-encapsulated nanoliposomes (scale bar, 200 nm) (a ), a single nanoliposome containing ERL and DOX-sulfate complexes (scale bar, 50 nm) (b ), a high resolution- (HR-) TEM image representing DOX-sulfate crystals present inside the nanoliposome and ERL crystals in an outermost region of the nanoliposome (sale bar, 10 nm) (c ), a SAED pattern of DOX-sulfate crystals and ERL crystals present in a nanoliposome (d ), a single nanoliposome encapsulated with ERL (scale bar, 50 nm) (e ), a HR-TEM image representing small crystals of ERL and amorphous domains in an outermost region of the nanoliposome (sale bar, 10 nm) (f ), a SAED pattern of ERL crystals present in an outermost region of the nanoliposome (g ), a single nanoliposome encapsulated with DOX (scale bar, 100 nm) (h ), a HR-TEM image representing crystalline lattices of DOX-sulfate inside the nanoliposome (sale bar, 5 nm) (i ), and a SAED pattern of DOX-sulfate crystals present inside the nanoliposome (j )

As a result of a physical stability study on the dual drug-encapsulated nanoliposomes, Fig. 7 shows the percent change in diameter of the nanoliposomes incubated in PBS (pH 7.4) at 4, 25, and 37 °C, respectively, as a function of the time. When incubated at 4 °C, in comparison with the initial diameter at day 0, the diameter of the nanoliposomes increased by 14.8% on day 5 and varied thereafter in a smaller extent of change in the diameter. The overall change of the diameter, however, was in a range of ± 15.0% during the stability test period. At 25 °C, the diameter of the nanoliposomes increased by 10.9% on day 5 and then decreased − 8.0% on day 19, indicating that the overall change was in a range of ± 10.0% during the test period. In addition, at 37 °C, the overall change in the diameter of the nanoliposomes was in a range of ± 6.0% during the test period, showing the smallest degree of change compared with the other test conditions. Based on the fact that in all three conditions tested, there was no significant change in the diameter of the nanoliposome, it is considered that the nanoliposomes prepared in our study have the physical stability in PBS (pH 7.4) for at least 3 weeks without aggregation or flocculation, which can affect therapeutic efficacy, targeting, and toxicity of the drug(s) encapsulated in the nanoliposomes. It has been acknowledged that the two important factors determining physical stability of nanoliposomes are T _ㄷ of phospholipid(s) and a content of cholesterol constituting the nanoliposomes [41]. The high stability of the nanoliposomes at 37 °C may be due to the low probability of phase transition of the phospholipid bilayer made up of DSPC, which has a high T _ㄷ and is utilized in general as a main lipid component in various liposome formulations. Also, a high composition ratio such as 40 wt% of cholesterol in the nanoliposomes seems to contribute to enhance the physical stability of the nanoliposomes [42]. On the other hand, nonetheless a low T _ㄷ (− 2 °C) of POPG having a double bond in its one acyl chain, a very low composition ratio such as 3 wt% of POPG had little effect on the stability of the nanoliposomes.

Stability of dual drug-encapsulated nanoliposomes incubated in PBS (pH 7.4) at different temperatures of 4, 25, and 37 °C, respectively:percent change in nanoliposome diameter relative to initial diameter as a function of incubation time

Time-Differential Drug Release

There are a number of systems that can carry two kinds of drugs with different physicochemical properties on one vehicle. The representative examples are a micelle system containing the two drugs in the same compartment of the system, a polymer matrix system composed of different compartments containing each drug, and a liposome or a polymersome system containing each drug in the core and shell of the system, respectively [43,44,45,46]. In particular, when sequential actions of the two drugs are essential to cause a synergistic effect of the drugs, the time-differential release of each drug from the dual drug-encapsulated carrier is highly important. The in vitro time-differential release of DOX and ERL from the dual drug-encapsulated nanoliposomes was investigated, and the results are shown in Fig. 8. The releases of DOX and ERL from the nanoliposomes were monitored against a test medium, PBS (pH 7.4), under continuous stirring. The released amount of DOX or ERL after designated release test period was calculated measuring the fluorescence intensity of DOX and the absorbance of ERL with the fluorescence spectrometer and the UV-Vis spectrometer, respectively.

In vitro release profiles of ERL and DOX from dual drug-encapsulated nanoliposomes:time-differential release (a ) and release rates of ERL and DOX (b ) (n  = 3, the data are presented as mean ± SEM)

As shown in Fig. 8, the ERL release was 36 ± 0.01%, while the DOX release was less than 10% until 8 h of the release test period. In particular, during this period, the release rate of ERL was much faster than that of DOX. By 48 h, 65 ± 0.07% of ERL were released from the nanoliposomes in contrast to 30 ± 0.01% release of the DOX. The release rates of ERL and DOX are shown in Fig. 8b. Until 8 h, the release rate of ERL was more than 4% per hour in contrast to less than 1% per hour of the DOX release rate. After 8 h, the release rate of ERL was slowed down. Compared with the release of ERL, DOX showed a slow release and had an almost zero-order release rate. These results suggest that during the initial period of release test, much more amounts of ERL were released from the liposomes than those of DOX and there was a time-differential release between ERL and DOX. The sequential release of the drugs was thought to be originated from the difference between the physicochemical states of each drug in the liposomes [28, 32, 47]. These results on the dual drug-encapsulated nanoliposome system can contribute to translation of in vitro synergistic effects of two kinds of drugs into the clinic through overcoming both the difference between PK properties of each drug and the difficulty in targeting the same cancer cells in proper temporal sequence.