전자 여기 에너지 전달에 의해 연구된 폴리스티렌-디페닐옥사졸-폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 하이브리드 나노시스템에 의한 염소 e6 광감작제의 흡수

초록

가교된 폴리-N-이소프로필아크릴아미드(PNIPAM) 사슬이 부착된 폴리스티렌(PS)-디페닐옥사졸(PPO) 나노입자가 얻어져 PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 나노시스템(NS)이 생성되었습니다. 염소 e₆의 형광 스펙트럼 PS-PPO-PNIPAM 하이브리드에 추가된 NS는 PS 매트릭스 및 캡슐화된 PPO에서 염소 e₆로의 전자 여기 에너지 전달(EEET)을 나타냅니다. . EEET 효율성은 chlorin e₆ 후 1시간 동안 크게 증가했습니다. 또한, chlorin e₆의 흡수를 나타냅니다. PNIPAM에 의해 하이브리드 NS의 일부는 이 시간 동안 계속 진행됩니다. PS-PPO-PNIPAM-chlorin e₆ 가열 21~39°C의 NS는 EEET 효율성을 향상시킵니다. 이는 PS-PPO 기증자와 chlorin e₆ 사이의 거리를 줄이는 PNIPAM 형태 전환과 일치합니다. 수용자. 한편, chlorin e₆의 비교적 작은 부분 솔루션에 존재하는 PNIPAM에 의해 바인딩됩니다. 따라서 이 방향에 대한 추가 연구가 필요합니다.

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배경

암의 광역학 요법의 주요 단점은 조직으로의 여기빔 침투 깊이가 낮다는 것입니다[1]. 따라서 암 치료에 대한 방사선 역학 요법 접근법(신체 깊숙이 침투할 수 있는 X-선으로 감작제가 효율적으로 여기될 수 있는 곳)이 제안되었고[2] 지난 몇 년 동안 집중적으로 연구되었습니다[3,4,5]. 연구 범위 중 하나는 X선 여기에서 일중항 산소를 생성하는 증감제의 개발이다[5,6,7,8]. 이러한 X선 증감제의 핵심 프로세스는 섬광 및 증감 구성요소 사이의 전자 여기 에너지 전달(EEET)입니다[2, 6, 9,10,11]. 언급된 X선 증감제의 또 다른 중요한 구성 요소는 EEET에 최적인 거리에서 섬광 및 증감 부품을 함께 유지하는 방법입니다. 화학적 접합[2, 3], 정전기적 인력[8, 12], 계면활성제[11] 또는 폴리머 쉘[4]이 언급될 수 있습니다. 이전에 일중항 산소의 X선 여기된 과민성을 위한 나노시스템(NS) 설계 프레임에서 우리는 폴리스티렌(PS)-디페닐옥사졸(PPO)-염소 e₆에서 EEET를 연구했습니다. NS, 광감작제 chlorin e₆ 계면활성제(sodium dodecylsulphate) 쉘[15]을 통해 PS-PPO 나노입자(신틸레이터[13, 14]로 사용될 수 있음)에 결합되었습니다.

폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PNIPAM)는 내부 또는 외부 자극에 반응하여 특성이 변화하는 자극 반응성 물질에 속합니다[16]. 선형 PNIPAM은 가열 시 형태 전환을 겪는 것으로 알려져 있습니다. 즉, 선형 PNIPAM의 경우 32°C와 동일한 낮은 임계 용액 온도(LCST) 이상의 온도에서 중합체가 수축합니다(소수성이 되어 물 분자를 배출하기 때문에) [17] . LCST를 통한 온도 전이 시 PNIPAM 쉘 너비의 상당한 감소는 [17]에서 PS-PNIPAM 나노입자에 대해 표시되었습니다. 동시에, 덱스트란에 접합된 PNIPAM 사슬의 경우 구조 전환 온도가 구조를 방해하는 PNIPAM 사슬 간의 입체 상호작용으로 인해 유사한 분자량 및 다분산성의 선형 PNIPAM에 비해 2-4°C 더 높은 것으로 나타났습니다. 전환 [18].

이 작업에서 가교된 PNIPAM 껍질로 덮인 PS-PPO 나노 입자(그림 1 및 2)가 얻어져 PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 NS가 생성되었습니다. chlorin e₆ 부착을 위한 가교 PNIPAM 사용 가능성 PS-PPO NP 신틸레이터에 대한 증감제가 연구되었습니다. 이 폴리머는 생리학적 온도에서 형태 전환이 있습니다(가교된 PNIPAM의 경우 LCST는 32°C 이상이어야 함). 따라서, 여기 하에 가열 후 가교된 PNIPAM 네트워크의 축소는 PS-PPO 공여자와 chlorin e₆ 사이의 거리를 감소시킬 수 있습니다. EEET의 효율성을 증가시켜 종양 파괴의 효율성을 높이는 수용체입니다.

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PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 나노시스템과 chlorin e₆의 구성요소 구조

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획득한 PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 나노시스템의 낮은(왼쪽) 및 높은(오른쪽) 배율의 TEM 이미지

실험

자료

P.a.의 스티렌(ST, 우크라이나) 품질은 중합 직전에 표준 방법을 통해 정제되었습니다. N-이소프로필아크릴아미드(NIPAM, Sigma-Aldrich Inc.), N,N'-메틸렌비스아크릴아미드(BIS, Sigma-Aldrich Inc.), 과황산칼륨 K₂ S₂ O₈ (KPS, 우크라이나), 인산나트륨 일염기성 탈수화물 NaH₂ PO₄ × 2H₂ O(우크라이나) 및 음이온성 계면활성제 소듐 도데실 설페이트(SDS, Sigma-Aldrich Inc.)는 시약 등급이었고 추가 정제 없이 사용되었습니다. 염소 e₆ (Frontier Scientific Inc.)은 T.Y.에서 친절하게 제공되었습니다. Ohulchanskyy(뉴욕주립대학교 Buffalo 소재 레이저, 광자 및 생체 광자 연구소). 50밀리몰의 TRIS-HCl 완충액(pH 7.2)을 용매로 사용했습니다.

나노시스템의 합성 및 특성화

PPO(PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 NS)로 도핑된 폴리스티렌-폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 하이브리드 나노시스템은 다음과 같이 합성되었습니다. 먼저, PPO로 도핑된 PS-co-PNIPAM 코어 나노입자는 마이크로에멀젼 중합에 의해 제조되었다[13, 14, 19, 20]. 간단히 말해서, NIPAM 0.2g, 도데실황산나트륨 0.2g, NaH 0.01g₂ PO₄ × H₂ O는 90g의 H₂에 용해되었습니다. O. 그런 다음, 0.09g의 PPO를 1.8g의 스티렌에 녹이고 얻어진 혼합물도 30분 동안 적가하였다. 혼합물을 700rpm에서 교반하고, Ar을 혼합물에 30분 동안 버블링했습니다. 온도가 70°C로 상승한 후 0.01g의 K₂ S₂ O₈ 1ml의 H₂에 용해 중합을 개시하기 위해 O를 주입하였다. 둘째, PNIPAM 쉘 레이어는 70°C에서 4시간 가열 후 제작되었습니다. 이를 위해 단량체 NIPAM(0.69g)과 가교제 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드(BIS)(0.06g)의 수용액을 주사기를 사용하여 반응기에 첨가했습니다. 반응을 70°C에서 3시간 동안 계속하고 90°C에서 추가로 1시간 동안 방치했습니다. 혼합물을 실온으로 냉각하고 MWCO 3500Da가 포함된 셀룰로오스 막을 사용하여 48시간 동안 투석했습니다.

얻어진 나노시스템의 전이 전자 현미경(TEM) 이미지가 그림 2에 나와 있습니다. 샘플 준비를 위해 일반 탄소 필름이 있는 400 메쉬 Cu 그리드가 글로우 방전 처리(Elmo, Cordouan Technologies Bordeaux France)에 의해 친수성이 되었습니다. 5μl 한 방울을 떨어뜨리고 1분 동안 흡착시킨 다음, 여분의 용액을 여과지로 제거했습니다. PS-PPO-PNIPAM 나노시스템의 관찰은 두 개의 TEM, 즉 Tecnai G2 또는 CM12(FEI, Eindhoven, Netherlands)에서 수행되었으며 Tecnai의 ssCCD Eagle 카메라와 CM12의 Megaview SIS 카메라로 이미지를 획득했습니다. 그림 2에서 얻은 하이브리드 나노시스템은 여러 개의 결합된 구형 PS-PPO NP로 구성되어 있음을 알 수 있습니다. 우리는 그들이 가교된 PNIPAM 폴리머 그물에 의해 묶여 있다고 믿습니다. 따라서 PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 나노 시스템이 얻어졌습니다.

스펙트럼 측정 및 샘플 준비

Specord M40 분광광도계(Carl Zeiss, Germany)를 사용하여 흡수 스펙트럼을 측정하였다. 형광 여기 및 방출 스펙트럼은 Cary Eclipse 형광 분광 광도계(Varian, Australia)의 도움으로 등록되었습니다. 흡수 및 형광 측정은 실온에서 1 x 1 cm 석영 셀에서 수행되었습니다. 50밀리몰의 TRIS-HCl 완충액(pH 7.2)을 용매로 사용했습니다. 스펙트럼 측정을 위해 얻은 PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 NS 용액을 완충액에 100회 용해했습니다. 염소 e₆의 원액 농도에서 10mM을 DMF에서 제조하고 완충액에서 1mM 농도로 추가 희석했습니다. 이 1mM chlorin e₆ 용액의 소량 이어서 NS의 100배 용해된 완충 용액에 첨가하였다; 염소 e₆의 최종 농도 따라서 DMF 혼합물은 2μM이었고, 따라서 DMF 혼합물은 0.02%였습니다. chlorin e₆를 포함하는 PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 NS 용액의 형광 여기 및 방출 스펙트럼 chlorin e₆ 첨가 후 0, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100분 후에 측정되었습니다. PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 NS의 솔루션입니다. 거의 80분 만에 포화 상태에 도달했습니다.

온도 의존적 측정의 경우 chlorin e₆이 있는 PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 NS 용액 온도 조절된 셀 홀더(T =23°C). 시료 준비 후 88분, chlorin e₆ 흡수 후 PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 NS에 의해 포화에 도달하고 샘플을 39°C로 가열할 때 수조의 물 흐름이 전환되었습니다(이 온도는 가교된 PNIPAM의 경우 LCST를 초과해야 함). chlorin e₆의 형광 여기 스펙트럼 (680nm에서 방출)은 가열이 시작된 후 다른 시간 간격으로 측정되었습니다. 실험 결과에 따르면 가열이 시작된 후 약 3분 후에 형태 전환이 시작됩니다. 가열이 시작된 후 약 18분 후에 NS의 응고가 발생하여 거시적인 응고가 발생했습니다(그러나 용액이 냉각된 후에 사라지므로 응고는 되돌릴 수 있음). 온도 실험을 3회 실시한 결과 비슷한 경향을 보였다.

결과 및 토론

50mM Tris-HCl 완충액(pH 7.2)에서 얻은 PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 나노시스템의 흡수, 형광 여기 및 형광 방출 스펙트럼이 그림 3에 나와 있습니다. 흡수 스펙트럼에는 스티렌(최대 260nm 부근)에 해당하는 밴드가 포함되어 있습니다. ) 및 PPO(최대 307nm 부근). 동시에, 250 nm(스티렌 흡수 범위)에서 여기 시 형광 방출 스펙트럼은 PPO(최대값이 367 nm)에 독점적으로 속하는 스펙트럼을 생성한 반면, 스티렌 방출(307 nm에서 기인) [15] )는 관찰되지 않았다. 따라서 스티렌에서 통합 PPO까지의 EEET는 거의 완료되었습니다. EEET는 또한 260nm 부근의 스티렌 밴드가 명확하게 관찰되는 PPO 방출(380nm)의 여기 스펙트럼에 의해 뒷받침됩니다(그림 3). PPO 방출 스펙트럼(PPO 수용액 [14]에서는 관찰되지 않음)에서 명확한 진동 구조가 관찰될 수 있다는 점을 추가해야 합니다. <그림><그림>

에서 얻어진 PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 나노시스템의 흡수(검은색 실선), 형광 여기(380 nm에서 방출, 정규화됨, 검은색 짧은 파선) 및 방출(250 nm에서 여기, 정규화됨, 빨간색 실선) 스펙트럼 50mM Tris-HCl 완충액(pH 7.2)

또한, 얻어진 PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 나노시스템을 50mM Tris-HCl 완충액(pH 7.2)에 녹인 용액에 감광제인 chlorin e₆ 추가되었습니다. 염소 e₆의 흡수 스펙트럼 최대 광학 밀도의 작은 감소를 제외하고 완충 용액과 비교하여 하이브리드 나노 시스템의 존재에서 거의 변화를 보여주지 않습니다(그림 4).

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염소 e₆의 흡수 스펙트럼 (2 μM) 유리(검은색 선) 및 PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 나노시스템이 있는 경우(빨간색 선) 50mM Tris-HCl 완충액, pH 7.2

동시에 chlorin e₆ 첨가 효과 형광 스펙트럼에 대한 PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 NS는 흡수 스펙트럼에 비해 훨씬 더 눈에 띕니다. 우선, chlorin e₆의 존재 PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 NS의 PPO 형광 방출의 켄칭으로 이어지며 이 켄칭은 약 1시간 동안 향상됩니다(그림 5). 일반적으로, 그러한 퀜칭은 EEET(모든 방출 파장에서 도너 방출의 퀜칭을 유도함) 또는 재흡수(어셉터 흡수의 파장에서 도너 방출의 퀜칭을 유도함)로 인한 것일 수 있습니다. PPO 방출 스펙트럼의 차이(그림 5)는 chlorin e₆ 직후 또한 PPO 배출 냉각에 대한 재흡수의 기여는 상당합니다(그러나 EEET도 발생함). 동시에 재흡수의 기여도는 시간이 지남에 따라 더욱 감소하고 EEET의 이는 증가합니다.

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PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 NS free(검은색 실선) 및 chlorin e₆ 첨가 시 형광 스펙트럼 0분(검은색 짧은 파선) 및 80분(검정색 점선)에 측정됩니다. 여기 파장은 250nm입니다. 50밀리몰의 Tris-HCl 완충액(pH 7.2)이 용매로 사용됩니다. 스펙트럼의 차이(실선, 짧은 점선 및 점선 빨간색 선)는 방출 냉각에 대한 재흡수 및 전자 여기 에너지 전달(EEET)의 기여도를 나타냅니다.

chlorin e₆ 첨가의 또 다른 효과 PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 NS에 chlorin e₆ 등장 유리 염소 e₆와 비교하여 장파장 영역으로 이동하는 방출(250nm에서 PS의 여기 시); 강도와 이동 모두 시간이 지남에 따라 증가하고 약 1시간 내에 포화 상태에 도달합니다(그림 6). 이 이동은 chlorin e₆의 결합 분자에 대한 PNIPAM 주변의 영향을 나타냅니다. . 동시에 염소 방출 e₆ 자체 흡수(400nm에서)에 대한 여기 시 PS-PPO-PNIPAM NS가 있는 경우에만 약간만 변경됩니다. chlorin e₆의 작은 변화와 함께 흡수(그림 4), 이는 chlorin e₆의 작은 부분만 분자는 PS-PPO-PNIPAM NS에 결합됩니다.

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염소 e₆의 형광 스펙트럼 무료 및 PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 NS에 추가됨(추가 후 0, 5, 10, 20, 40 및 80분에 측정됨). 여기 파장은 250 및 400nm입니다. 50mM Tris-HCl 완충액, pH 7.2를 용매로 사용했습니다. 짧은 점선 화살표는 250 및 400nm에서 여기된 스펙트럼을 나타냅니다. 실선 화살표는 chlorin e₆ 첨가 후 증가하는 시간(t)을 나타냅니다. 250nm에서 여기된 스펙트럼의 경우

마지막으로 PS-PPO 밴드는 chlorin e₆의 여기 스펙트럼에 나타납니다. PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 NS에 추가(680nm에서 방출, 여기서 PNIPAM 결합 chlorin e₆의 기여도) 총 염소 배출량 대비 e₆ 최대에 가깝습니다). 이 밴드는 처음에는 약하지만 시간이 지남에 따라 강도가 크게 증가합니다(그림 7). 동시에 이 PS-PPO 밴드는 chlorin e₆의 여기 스펙트럼에서 매우 약합니다. 660nm에서 방출 시(즉, 최대 유리 염소 e₆ 스펙트럼) chlorin e₆ 첨가 후 100분 후에도 .

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chlorin e₆의 형광 여기 스펙트럼 PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 NS(추가 후 0, 10, 80, 100분 후 측정) 및 PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 NS 자체에 무료로 추가되었습니다. 염소 e₆의 방출 파장 660nm(정규화된 강도) 및 680nm입니다. PS-PPO-PNIPAM NS의 방출 파장은 380nm(정규화된 강도)입니다. pH 7.2의 Tris-HCl 완충액 50밀리몰을 용매로 사용

따라서 chlorin e₆ PS 매트릭스 및 캡슐화된 PPO에서 염소 e₆로 EEET를 유발하는 PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 NS에 결합 . EEET 효율은 시간이 지남에 따라 향상됩니다(chlorin e₆ 후 약 1시간 동안). 추가), 염소 e₆의 흡수를 나타냅니다. PNIPAM 네트워크에 의한 PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 NS는 이 시간 동안 계속 진행됩니다. 동시에 상대적으로 적은 양의 chlorin e₆ 솔루션에 존재하는 것은 PNIPAM에 의해 구속됩니다.

PS-PPO NP는 X선으로 여기될 때 PPO[14] 또는 부착된 포르피린[13]의 형광을 방출하는 것으로 나타났습니다. 따라서 PS에서 염소 e₆로의 EEET PS의 UV 여기에서 PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 NS에서 관찰된다는 것은 X선의 에너지가 chlorin e₆에도 전달될 수 있음을 의미합니다. 연구된 NS에서. 동시에 이러한 나노입자의 X선 유도방출을 직접 관찰하기 위해서는 다소 높은 농도의 PS-PPO 나노입자가 필요하다[13, 14]. 이러한 NS의 X선 민감도를 높이는 방법 중 하나는 무거운 원자를 포함하는 구성 요소를 추가하는 것일 수 있습니다.

PNIPAM은 32°C와 동일한 LCST에서 형태 전환을 경험하는 것으로 알려져 있습니다. 가교 중합체의 경우 LCST 값은 여전히 높아야 합니다. PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 NS가 PS-PPO NP와 chlorin e₆를 둘러싼 가교 PNIPAM 네트워크로 구성된 경우 PNIPAM 네트워크에 결합되어 있으므로 PPO-chlorin e₆의 감소를 기대할 수 있습니다. 거리 및 따라서 전체 하이브리드 NS 가열 시 EEET 효율 증가.

이 아이디어를 확인하기 위해 chlorin e₆ 존재하에서 PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 NS의 가열 효과 chlorin e₆의 형광 여기 스펙트럼 연구되었다. 가열 실험은 세 번 수행되었습니다. 유사한 경향을 보였다. 이들 실험 중 하나의 결과가 도 5에 제시되어 있다. 8 및 9. 따라서, 염소 e₆의 존재하에 PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 NS의 용액 39°C의 온도로 가열되었습니다(이 온도는 가교된 PNIPAM의 경우 LCST를 초과해야 함). chlorin e₆ 흡수 후 가열 시작 PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 NS에 의해 포화 상태에 도달했습니다. 가열하는 동안 염소 e₆의 비율 320nm에서 여기 시 형광 강도(680nm에서 방출)(I _ex320; 그것은 염소 e₆입니다 PPO-to-chlorin e₆로 인한 방출 EEET) 및 404nm(I _ex404; 그것은 염소 e₆입니다 자체 Soret 대역으로의 여기 시 방출)이 연구되었습니다(그림 8 및 9). 우리는 이 비율이 PPO-to-chlorin e₆의 효율성을 반영한다고 믿습니다. 에잇. 따라서 가열이 시작된 후 처음 3분, 나는 _ex320 /나 _ex404 아마도 chlorin e₆의 감소로 인해 0.9에서 0.85로 감소했습니다. -온도 증가 시 PNIPAM에 대한 결합 친화도. 또한 나의 가치는 _ex320 /나 _ex404 비율은 1.02까지 증가했으며, 이는 광산란 증가를 동반했습니다(그림 8, 660nm 근처에서 강도가 증가함에 따라 산란이 나타남). 이것은 교차 연결된 PNIPAM 네트워크 볼륨의 감소로 이어지는 PNIPAM의 구조 전환으로 설명될 수 있습니다. 이로 인해 PS-PPO 기증자와 chlorin e₆ 사이의 거리가 감소합니다. PNIPAM 네트워크에 결합된 수용체 분자는 EEET 효율성을 증가시킵니다.

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chlorin e₆의 형광 여기 스펙트럼(404nm에서 정규화됨) PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 NS에 23°C(검은색 선) 및 39°C(가열을 켠 후 14분 후, 빨간색 선)에서 추가했습니다. 방출 파장 680nm; 50mM Tris-HCl 완충액, pH 7.2를 용매로 사용했습니다.

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39°C로 가열한 후 시간에 대한 의존성 chlorin e₆의 방출 강도 비율 320nm에서 여기 시 680nm에서 PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 NS에 추가됨(추가 EEET와 함께 PPO에 의해 흡수되어 염소 e₆ ) 404 nm에서 여기 시(chlorin e₆의 직접 여기) ). 오차 막대는 등록된 여기 스펙트럼의 노이즈를 설명합니다.

요약하면, chlorin e₆의 존재하에 PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 NS 용액의 공정 추가는 다음과 같이 설명될 수 있습니다. 첫째, chlorin e₆ 첨가 완충액의 PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 NS 용액(그림 10, 공정 1)은 chlorin e₆의 작은 부분을 침투시킵니다. 하이브리드 NS의 PNIPAM 네트워크로; 이로 인해 PS 및 PPO에서 chlorin e₆로 EEET가 발생했습니다. . 이러한 침투는 EEET 효율성의 증가와 함께 약 1시간 동안 진행됩니다(그림 10, 프로세스 2). LCST를 초과하는 온도로 샘플을 추가로 가열하면 PS-PPO와 chlorin e₆ 사이의 거리가 감소하는 PNIPAM 네트워크 구조 전환이 발생합니다. 분자, 따라서 PS-PPO-to-chlorin e₆의 더 높은 증가 EEET 효율성(그림 10, 프로세스 3).

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