PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 나노입자, 클로린 e6 효율적 섭취 및 에너지 전달 향상 입증

초록

디페닐옥사졸(PPO) 도핑 폴리스티렌(PS) 나노입자를 가교된 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드(PNIPAM) 쉘로 캡핑해 PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 나노시스템(NS)을 제조했습니다. 이 NS에 클로린 e₆을 첨가한 형광 연구에서 PS 코어와 내재된 PPO 모두에서 클로린 e₆ 수용체로 효율적인 전자 여기 에너지 전달(EEET)이 일어남을 확인했습니다. EEET 효율은 클로린 e₆ 첨가 후 첫 1시간 내 급격히 증가해 이 기간 동안 PNIPAM이 지속적으로 감광제를 포집함을 나타냅니다. PS-PPO-PNIPAM-클로린 e₆ NS를 21°C에서 39°C로 가열하면 EEET이 추가 향상되는데, 이는 PNIPAM 네트워크 열적 붕괴로 공여체-수용체 거리가 단축되기 때문과 일치합니다. 다만 자유 클로린 e₆ 중 PNIPAM과 결합하는 비율은 미미해 추가 최적화가 필요합니다.

배경

암 광역학 치료(PDT) 주요 한계는 여기광의 얕은 조직 투과 깊이입니다. X선 구동 광역학 치료(X-PDT)는 X선이 깊게 투과해 단일 산소 생성을 유도하는 감광제를 활성화할 수 있어 해결책이 됩니다. X-PDT 핵심은 신틸레이팅 구성요소와 감광제 간 효율적인 전자 여기 에너지 전달(EEET)입니다. 화학적 결합, 정전기적 인력, 계면활성제 층, 폴리머 쉘 등으로 최적 공여체-수용체 근접성 유지가 시도돼 왔습니다. 이전 연구에서 클로린 e₆을 도데실 황산나트륨 쉘로 PS-PPO에 부착한 PS-PPO-클로린 e₆ 나노입자 내 EEET을 조사했습니다.

폴리-N-이소프로필아크릴아마이드(PNIPAM)는 하부 임계 용해 온도(LCST) 32°C 이상에서 소수성화되고 수축하는 자극 반응성 폴리머입니다. 가교 PNIPAM의 경우 LCST가 더 높아 생리 온도에서 온도 구동 크기 변화가 가능합니다. PS-PPO 나노입자를 가교 PNIPAM 쉘로 감싸 PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 NS를 제조했습니다. 이 쉘이 클로린 e₆을 고정할 수 있는지, PNIPAM 온도 의존적 붕괴가 공여체-수용체 거리를 줄여 EEET과 종양 세포 사멸 효능을 높일 수 있는지 조사했습니다.

실험

재료

스티렌(ST, 우크라이나) p.a.급을 중합 전 표준법으로 정제했습니다. N-이소프로필아크릴아마이드(NIPAM, Sigma-Aldrich), N,N'-메틸렌비스아크릴아마이드(BIS, Sigma-Aldrich), 과황산칼륨(K₂S₂O₈, KPS, 우크라이나), 인산나트륨 일수화물(NaH₂PO₄×2H₂O, 우크라이나), 음이온 계면활성제 도데실 황산나트륨(SDS, Sigma-Aldrich)은 시약급으로 추가 정제 없이 사용했습니다. 클로린 e₆(Frontier Scientific Inc.)은 T.Y. Ohulchanskyy(뉴욕주립대 버팔로 레이저, 광자학, 생물광학 연구소) 제공입니다. 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.2)을 용매로 사용했습니다.

나노시스템 합성 및 특성 분석

PS-co-PNIPAM 코어 나노입자를 PPO 도핑 상태로 미세유화 중합으로 먼저 제조했습니다. 간단히, 0.2 g NIPAM, 0.2 g SDS, 0.01 g NaH₂PO₄×H₂O를 90 g 물에 녹였습니다. 이후 0.09 g PPO를 1.8 g 스티렌에 녹여 30분간 방울방울 첨가했습니다. 혼합물을 700 rpm으로 교반하며 30분간 Ar로 퍼지한 후 70°C로 가열했습니다. 1 mL 물에 녹인 0.01 g K₂S₂O₈로 중합 개시했습니다. 70°C에서 4시간 후 가교 단계를 위해 0.69 g NIPAM과 0.06 g BIS 수용액을 첨가하고 70°C 3시간, 90°C 1시간 추가 반응했습니다. 생성물을 실온으로 식히고 셀룰로오스 막(MWCO 3500 Da)으로 48시간 투석했습니다.

투과전자현미경(TEM) 이미지(그림 2)는 하이브리드 NS가 가교 PNIPAM 네트워크로 결합된 여러 PS-PPO 코어로 구성됨을 확인합니다.

분광 측정 및 시료 준비

흡수 스펙트럼은 Specord M40 분광광도계(Carl Zeiss, 독일)로 기록했습니다. 형광 여기 및 방출 스펙트럼은 Cary Eclipse 형광분광기(Varian, 호주)로 얻었습니다. 모든 측정은 1×1 cm 석영 셀에서 상온 수행했습니다. PS-PPO-PNIPAM 용액을 Tris-HCl 완충액에 100배 희석했습니다. DMF 중 10 mM 클로린 e₆ 스톡을 완충액 중 1 mM으로 희석하고, 최종 농도 2 µM 클로린 e₆을 NS 용액에 첨가했습니다(DMF ≤ 0.02%). 첨가 후 0, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100분에 형광 여기 및 방출 스펙트럼을 수집했으며, 약 80분 후 포화에 도달했습니다.

온도 의존성 연구를 위해 클로린 e₆ 첨가 NS 용액을 항온 홀더(23°C)에 놓았습니다. 약 88분 포화 후 시료를 39°C(가교 PNIPAM LCST 이상)로 가열했습니다. 가열 후 간격마다 형광 여기 스펙트럼(클로린 e₆ 방출 680 nm)을 기록했습니다. PNIPAM 구조 전이는 가열 약 3분 후 시작돼 약 18분 후 응고됐으며 냉각 시 가역적이었습니다. 실험을 3회 반복해 일관된 결과를 얻었습니다.

결과 및 고찰

50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.2) 중 PS-PPO-PNIPAM NS 흡수, 형광 여기, 방출 스펙트럼은 그림 3에 나타냈습니다. 흡수 프로파일은 스티렌(약 260 nm)과 PPO(약 307 nm) 밴드를 보입니다. 250 nm(스티렌 흡수) 여기 시 367 nm PPO 방출이 나타나 스티렌에서 PPO로 근완전 EEET 발생을 확인합니다. PPO 방출(380 nm) 여기 스펙트럼은 스티렌 밴드 기여를 추가로 보여줍니다. 수용액 PPO에서는 없는 PPO 방출 진동 구조가 PS 매트릭스 내 PPO 내재화를 확증합니다.

클로린 e₆(2 µM) 첨가 시 흡수 스펙트럼은 피크 광학 밀도 약간 감소 외 거의 변하지 않습니다(그림 4). 반면 클로린 e₆ 첨가는 PPO 형광을 현저히 퀜칭하며 이는 약 1시간 동안 심화됩니다(그림 5). 이 퀜칭은 EEET(공여체-수용체 에너지 전달)과 재흡수(공여체 방출과 수용체 흡수 중첩) 모두 기인합니다. 초기에는 재흡수가 지배적이나 시간이 지날수록 EEET이 주 기여자가 됩니다.

PS 여기(250 nm) 시 클로린 e₆ 방출이 나타나며 시간이 지남에 따라 장파장 쪽으로 이동해 약 60분 후 포화에 이릅니다(그림 6). 이 적색 편이는 PNIPAM 환경이 결합된 클로린 e₆ 분자에 미치는 영향을 나타냅니다. 클로린 e₆ 자체 소레 밴드(400 nm) 여기 시 방출 변화는 미미해 클로린 e₆ 소량만 용액 내 자유 상태로 남음을 시사합니다.

클로린 e₆ 여기 스펙트럼(방출 680 nm)은 초기에 약한 PS-PPO 밴드가 시간이 지남에 따라 강해짐을 보여줍니다(그림 7). 이는 공여체에서 수용체로 EEET 증가 반영합니다. 클로린 e₆ 방출(660 nm) 여기 스펙트럼에서 PS-PPO 밴드는 100분 후에도 약하게 유지돼 에너지 전달 대부분이 PS-PPO 공여체 경로로 발생함을 확증합니다.

종합적으로 이 결과들은 클로린 e₆이 PNIPAM 네트워크로 침투해 PS와 PPO에서 감광제로 EEET을 가능케 함을 보여줍니다. EEET 효율은 배양 첫 1시간 동안 상승하며, 가교 PNIPAM LCST 이상으로 가열해 폴리머 네트워크 수축과 공여체-수용체 거리 단축으로 추가 향상 가능합니다.

이전 연구에서 PS-PPO 나노입자가 X선 여기 하 PPO 형광 방출을 보임이 밝혀져, 여기서 자외선 조명 하 관찰된 EEET이 X선 조사 하에서도 작동할 것임을 시사합니다. 다만 X선 유도 방출 검출은 일반적으로 고농도 NP 필요하며, 중금속 함유 모이어티 도입으로 X선 흡수 증가와 감도 향상이 가능합니다.

온도 의존 실험(그림 8-9)에서 23°C에서 39°C로 가열(포화 후) 시 I_ex320/I_ex404 비율이 0.90에서 0.85로 소폭 감소했다가 1.02로 상승했는데, 이는 광산란 증가(=PNIPAM 붕괴)와 일치하며 공여체-수용체 근접 증가로 EEET 추가 향상을 나타냅니다.

요약하면 PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 NS는 클로린 e₆ 섭취와 EEET을 촉진하며, 약 1시간 배양으로 효율 포화, LCST 이상 가열로 추가 증가가 가능합니다. 다만 클로린 e₆ 제한적 비율만 PNIPAM에 결합해 향후 최적화 필요성을 시사합니다.

결론

형광 분석으로 클로린 e₆이 PS-PPO-PNIPAM 하이브리드 NS에 내재화되고 PS 매트릭스와 내재 PPO에서 클로린 e₆으로 EEET 발생을 확인했습니다. 섭취는 약 1시간 후 포화됩니다. 21°C에서 39°C로 가열 시 EEET 추가 향상되며, 이는 가교 PNIPAM 쉘 열적 붕괴로 공여체-수용체 근접 증가와 일치합니다. 클로린 e₆ 소량만 PNIPAM에 결합하지만, 이러한 발견은 X선 구동 광역학 치료 잠재력을 지지하며 감광제 로딩 향상 후속 연구를 보증합니다.

약어

EEET

전자 여기 에너지 전달

LCST

하부 임계 용해 온도

NS

나노시스템

PNIPAM

폴리-N-이소프로필아크릴아마이드

PPO

디페닐옥사졸

PS

폴리스티렌

TEM

투과전자현미경