이 연구에서 우리는 생물 의학 응용 분야에 사용하기 위해 단백질과 하이브리드 나노 복합재 사이의 두 가지 다른 상호 작용을 감지하기 위해 수정된 금 나노 입자-그래핀 산화물 시트(AuNP-GO) 나노 복합재를 제안합니다. GO 시트는 생체 친화도가 높아 카르복실기에 생체 분자의 부착을 촉진하고 감지 메커니즘 개발에 사용되었습니다. GO 시트가 AuNP로 장식될 때 스펙트럼 변화의 공명 에너지 전달에서 국소 표면 플라즈몬 공명(LSPR)을 도입합니다. 우리의 결과는 질병 바이오마커를 감지하고 감염성 질병을 신속하게 진단하기 위한 AuNP-GO 기반 무표지 면역분석의 유망한 미래를 제안합니다. 결과는 1.45nM~145fM 범위의 동적 반응과 145fM의 LOD를 갖는 10ng/ml의 hCG 비특이적 간섭 단백질에서 antiBSA가 검출되었음을 보여줍니다. 다양한 나노 입자의 호스트 재료로서 GO 시트의 광범위한 잠재적 응용을 고려할 때 여기에서 개발된 접근 방식은 혈액 감지를 위한 GO 나노시트와 나노 입자의 미래 통합에 유용할 수 있습니다. 우수한 간섭 방지 특성으로 인해 신속한 면역 분석 제품의 임상 분석 및 현장 진단 테스트(POCT) 진단에 바이오센서를 사용할 수 있으며 인간 혈청의 바이오마커 측정을 위한 잠재적 도구가 될 수도 있습니다.
<섹션 데이터-제목="배경">탄소나노튜브[1, 2], 탄소볼(buckminsterfullerene, C60)[3], 2차원 그래핀[4,5,6], 그래핀옥사이드(GO)[7,8,9]와 같은 탄소 분자 기반 재료 ,10,11] 바이오 센서에 널리 사용되었습니다. 그 중 그래핀의 2차원 시트 구조는 높은 전도성[12, 13], 우수한 광투과성[14] 특성 및 높은 생체적합성[15, 16]을 갖는 박막을 가능하게 하는 이상적인 재료이다[15, 16]. 이러한 이유로 그래핀 기반 물질은 생의학 및 전기화학 센싱 기술에 널리 사용된다[17, 18]. 또한 광전 방식의 생물학적 감지 기술은 주로 GO를 기반으로 한다[19,20,21]. 산화물 그룹은 빛 밴드 갭을 흡수하고 방출하도록 조정할 수 있기 때문에 [22, 23] 형광 [24], 표면 플라즈몬 공명 (SPR) [8,9,10,11, 19,20,21]에 일반적으로 사용됩니다. ] 및 국부 표면 플라즈몬 공명(LSPR) [25, 26] 감지 기술. 특히, GO는 생체 분자의 친화성과 공유 결합을 향상시키는 독특한 화학적 작용기(에폭시 브릿지, 히드록실기, 쌍으로 카르복실기(카르복실 및 카르보닐))를 가지고 있습니다.
Pt, Au, Ag, Pd 및 ZnO와 같은 나노 입자와 결합한 그래핀 재료의 합성은 새로운 나노 복합 기술 개발을 위해 널리 연구되었습니다. 특히, 금 나노입자(AuNPs)의 사용은 비색 및 흡수 분광학의 에너지 전달을 위한 메커니즘으로 사용되었습니다. 또한 지난 10년 동안 가시광선에서 AuNP에 대한 연구는 독특한 플라즈몬 공명 특성을 강조했습니다. AuNPs의 크기와 모양을 조정하면 광 흡수 파장 이동이 변경될 수 있으므로 AuNPs는 향상된 플라즈마 흡수 및 신호 증폭에 사용할 수 있습니다[27, 28]. 따라서 AuNP는 광 추출 [29, 30] 및 광 흡수 반응 [31, 32, 33]을 향상시키는 특별한 광학 및 광전자 특성으로 인해 광전자 부품과 같은 광범위한 응용 분야에서 광범위하게 사용되었습니다. 또한, AuNPs는 생체적합성이며, 화학적 감지, 생체의학 영상, 암 치료[34, 35], 약물 운반체[32, 33], 광열 치료[36,37,38], 조영제[39], 방사선감작제[40] 및 바이오센싱[33, 41,42,43] 응용 프로그램입니다.
AuNPs의 기능은 산화를 방지하고 식물 화학 물질 또는 벡터의 운반체 역할을 하기 위해 가교제를 추가하여 수정되었습니다. 따라서 이 조합은 생체 적합성과 생체 활성을 증가시킬 수 있습니다[44,45,46]. 시스타민(Cys)이나 8-메르캅토옥탄산(8-mercaptooctanoic acid, MOA)과 같은 교차 링커는 변형된 Au 표면의 카르복실산 말단 티올 자체 조립 단층(SAM)에 의해 활성화됩니다. MOA는 티올 링커(-SH 말단)를 통해 Au 표면에 결합하여 단층을 생성합니다.
또한 플라즈몬 금속 재료에 대한 연구도 널리 보고되고 있다. 예를 들어, 플라즈몬 금속 코어 쉘 나노입자[47], 나노스타[48], 불소가 도핑된 산화주석 나노입자[49]는 에너지 밴드 갭을 향상시키는 것으로 나타났습니다. 피>
또한, 화학 합성[50,51,52] 및 정전기 자가 조립[53]에 기반한 AuNP-GO 하이브리드의 사용이 센서, 에너지 및 촉매 응용 분야에서 보고되었습니다. 최근 몇 년 동안 바이오센서에서 AuNP-GO 하이브리드의 사용에 대한 연구가 증가하고 있습니다. 이러한 하이브리드는 전기화학적 [54,55,56,57,58,59] 및 표면 강화 라만 산란(SERS) [56, 59] 플랫폼 기술을 개발하여 생물학적 분석의 응용을 개선하는 데 유용한 것으로 나타났습니다. 그러나 현재 육안 또는 비색 급속 면역분석 바이오센서 기술의 사용에 대한 관련 보고서는 없습니다. 예를 들어, AuNP-GO 하이브리드를 기반으로 하는 전기화학적 DNA 바이오센서는 조기 진단을 가능하게 하기 위해 유방암 바이오마커를 검출하는 데 사용되었습니다. 이 바이오센서를 사용하여 ERBB2 바이오마커에 대해 378nA/nM의 감도와 0.16nM의 검출한계(LOD)를 얻었습니다[54]. 또한, AuNP dotted reduction graphene oxide(rGO-AuNP) 나노복합체 기반 전기화학적 앱타센서를 사용하여 1pg L - 1 및 10μg L − 1 , LOD가 0.1 pg L − 1 인 경우 [55]. 또한 AuNP-GO 하이브리드는 과산화수소(H2 O2 ), 식품 역학 응답 범위는 0.1~2.3mM이고 LOD는 0.01mM입니다[57]. 또 다른 좋은 예는 AuNP-GO[56, 59]와 AuNP-graphene[59] 하이브리드를 다양한 응용 분야에서 SERS 기반 바이오센서와 SERS 측정 바이오 이미징에 활용하는 것입니다.
이 연구에서 우리는 층별 자가 조립을 사용하여 AuNP-GO 하이브리드의 화학적 합성 및 정전기적 자가 조립의 대체 방법을 제안합니다. 우리는 또한 변형된 결합된 AuNP와 GO 시트의 생물학적 검출 감도와 단백질 면역 반응을 분석합니다. 우리는 두 종류의 AuNP-GO 기반 단백질 표지가 없는 면역 분석법을 설계하고 항원-항체 상호 작용에서 반응 시간과 민감도를 평가했습니다. 그래핀-AuNP 복합재료의 우수한 감지 기능은 초고감도와 높은 특이도로 다양한 생체 분자의 검출에 영향을 미치는 생체 분자 상호 작용의 친화도를 포함합니다. 이러한 특징은 이러한 복합 재료가 미래 응용 분야에서 유망한 역할을 하고 임상 진단 응용 프로그램에서 질병 감지의 선호 경로가 될 가능성이 있음을 의미합니다.
Graphite는 Graphene Supermarket(Graphene Laboratories Inc., Reading, MA, USA)에서 구입했습니다. GO 시트는 수정된 Hummer의 방법[60]을 사용하여 그래파이트 플레이크에서 얻은 후 플레이크 크기가 0.1–1 μm이고 두께가 1.1 nm인 경우 5시간 동안 초음파 분쇄를 수행했습니다. 시스타민 이염산염(Cys, 96%), 사염화금수소(III) 삼수화물(HAuCl4 ·3H2 O), ACS, 99.99%(금속 기준) 및 Au 49.5% min은 Alfa Aesar Co.(미국)에서 구입했습니다. 시트르산나트륨(HOC(COONa)(CH2) 쿠나)2 ·2H2 O) J.T.에서 구입했습니다. Baker Chemical Co.(미국). 소 혈청 알부민 (BSA, SI-B4287, Sigma-Aldrich, USA), 토끼에서 생산된 항-소 알부민 항체 (antiBSA, SI-B1520, Sigma-Aldrich, USA), N -히드록시숙신이미드(NHS) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)는 Sigma-Aldrich Inc.(미국)에서 구입했습니다. 항BSA 항체 구조의 면역글로불린(Ig)은 B 림프구에서 생성되어 혈장으로 분비됩니다. Ig 분자의 단량체 형태는 분자량이 약 150kDa인 당단백질이었습니다. 각 Ig 단량체는 2개의 항원 분자에 결합할 수 있었습니다. 모든 시약 및 용매는 추가 정제 없이 사용되었습니다.
나노 입자의 감소를 제어하기 위해 끓는 시간이 각각 5분, 5분, 120분인 550, 400, 100°C의 세 가지 온도 조건을 사용했습니다. 이러한 서로 다른 온도는 나노입자를 감소시켜 추가 파일 1:그림 S1에서 명확하게 볼 수 있는 것처럼 520nm에서 동일한 흡수 스펙트럼을 얻습니다.
AuNPs를 얻기 위해 사용된 방법은 물에서 테트라클로로아우레이트 타우린 이온을 환원시키기 위한 환원제로 시트르산나트륨을 사용하는 것을 기반으로 했습니다. 15mL의 HAuCl4 용량 ·3H2 1mM의 Au가 포함된 O 용액을 환류하고 1.8mL의 38.8mM 시트르산나트륨(Na3 C6 H5 O7 ) 용액을 끓는(550 °C, 1100 rpm) 용액에 첨가했습니다. 구연산염 이온에 의한 금 이온의 환원은 5분 후에 완료되었으며, 용액을 30분 동안 더 끓인 다음(400°C, 900rpm) 실온으로 냉각되도록 두었다[36, 61, 62]. 이 방법은 평균 직경이 약 15nm인 구형 AuNP를 생성하며, 0.8mL의 38.8mM 시트르산나트륨의 감소된 농도를 사용하여 평균 직경이 약 60nm인 AuNP를 생성할 수 있습니다[63, 64]. 화학 반응은 다음과 같습니다:HAuCl4(aq) + C6 H5 O7 나3(수성) → Au(s) + CO2 + HCOOH.
우리는 그림 1과 같이 GO 시트를 제조하기 위해 면역 분석 방법을 설계했습니다. 0.1g/l 농도의 200μL GO 시트 용액을 사용하고 공유 결합을 위해 GO 시트 표면의 카르복실 말단기 활성화 탄화수소 사슬을 고정화하기 위한 형성은 1:1의 부피비에서 400μM(EDC)/100μM(NHS)의 혼합물을 사용하여 수행되었습니다. BSA 단백질은 EDC/NHS를 사용하여 GO 시트의 끝에 고정되어 GO의 카르복실기와 -HN2 사이의 공유 결합 반응을 활성화하고 촉진합니다. BSA의. 활성화된 -COOH 표면은 아민(NH2 )-100μg/ml 농도에서 20μl의 BSA 단백질과의 커플링 반응. 마지막으로 원심분리기를 사용하여 GO 표면에서 고정되지 않은 BSA 단백질을 반복적으로 제거했습니다. GO-BSA 항원 표적 절차는 그림 1에 나와 있습니다.
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GO-BSA 상호 작용. GO 시트의 카르복실기는 EDC/NHS 반응 및 GO-BSA에 대한 항원 표적 기반 GO 준비를 사용하여 활성화할 수 있습니다.
우리는 200μL의 부피에서 15nm AuNP와 함께 Cys를 사용하여 표면 기능화를 수행했습니다. AuNP는 Cys의 유도체화된 티올 자가 조립 단층을 사용하여 화학적으로 변형되었습니다. AuNP를 실온에서 2시간 동안 Cys(10mM) 용액에 담그었습니다. 강한 AuNP-S 결합(티올 결합)으로 인해 Cys는 AuNP 및 –NH2에 쉽게 연결할 수 있습니다. AuNPs–Cys–NH2 표면에 노출된 그룹 . 그런 다음 AuNPs의 표면을 고정하기 위해 100μg/ml 단백질의 항체(antiBSA) 20μl를 추가한 다음 AuNPs 표면에서 고정되지 않은 Cys를 제거하기 위해 원심분리를 반복했습니다. 그런 다음 탈이온수를 사용하여 고정되지 않은 AuNP(Cys는 EDC/NHS에 의해 활성화될 필요가 없는 아미노 티올 구조임)를 제거했습니다. AuNP에 부착된 Cys에는 아민(–NH2 ) antiBSA의 표면에 있는 carboxyl(–COOH) 그룹과 공유 결합된 그룹. 마지막으로, 우리는 AuNP의 표면에서 고정되지 않은 항BSA 단백질을 제거하기 위해 반복된 원심분리를 사용했습니다. 100μg/ml에서 1pg/ml로 연속 희석하여 일련의 항BSA 단백질 농도를 준비했습니다. 다양한 농도의 항체에서 AuNP-antiBSA 프로브의 준비는 그림 2a에 나와 있습니다.
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AuNP-antiBSA 및 AuNP-GO-antiBSA 상호 작용. a 준비 AuNP 및 b 항체 프로브 기반 AuNP-GO
우리는 AuNP-GO 나노복합체를 수정하기 위해 GO 시트 방법을 사용하여 준비된 AuNP를 사용했습니다. AuNPs는 sodium citrate reduction 방법을 사용하여 제조되었으며 60nm AuNPs의 크기는 Cys(5mM)를 사용하여 수정되었습니다. 그런 다음 EDC/NHS를 사용하여 GO 시트 표면의 -COOH 그룹을 활성화했습니다. AuNP에 부착된 Cys는 -NH2를 포함했습니다. GO 시트 표면의 -COOH 그룹과 공유 결합된 그룹. GO 시트 표면의 AuNPs는 AuNPs와 GO 사이의 공유 결합 반응을 촉진하기 위해 Cys 링커를 사용하여 고정되었습니다. 공유 결합은 GO 시트에 표면 기능화를 결합하기 위한 안정적이고 쉬운 방법을 제공합니다. GO 시트는 AuNP-링커 표면에서 결합되지 않은 GO를 제거하기 위해 탈이온수로 완전히 헹구었습니다. AuNP-Cys는 AuNP-GO의 새로운 복합물을 형성한 다음 그림 1에 표시된 것처럼 100μg/ml에서 1pg/ml의 항체(antiBSA) 프로브 단백질의 다양한 희석 농도로 고정화하여 AuNP-GO-antiBSA를 형성합니다. 2b.
AuNP-GO 시트의 분산 및 형태는 300kV 전계 방출 총 투과 전자 현미경(FEG-TEM; Tecnai G2F30S-Twin, Philips-FEI, Amsterdam, Netherlands) 및 고해상도 투과 전자 현미경( FEI Tecnai G20 시스템(Hillsboro, OR, USA)에서 HR-TEM). AuNP-GO 및 GO 시트의 분산 및 형태는 JEOL JSM-7800F Prime Extreme-resolution Analytical Field Emission Scanning Electron Microscope(JEOL Inc., USA)를 사용하여 특성화되었습니다. 이중 빔 분광 광도계의 자외선 가시광선(UV-vis) 투과 스펙트럼은 UV-vis 분광 광도계(U-2900, Hitachi High-Technologies Corporation, Tokyo, Japan)를 사용하여 실온에서 200~1100nm 파장에서 관찰되었습니다. . 라만 측정은 현미경 라만 시스템(MRI, Protrustech Co., Ltd., 대만)을 사용하여 수행되었습니다. 1800lines/mm 격자와 50μm 슬릿이 있는 공랭식 분광계(AvaSpec-ULS2048L)를 검출기로 사용했습니다. 푸리에 변환 적외선 분광계(FTIR) 측정은 감쇠 전반사(ATR) 모드의 Bruker Vertex 80v 분광계와 2cm − 1 분해능의 DTGS 검출기(64 스캔)를 사용하여 이루어졌습니다. 약 6Pa의 압력으로 진공 상태의 KBr 펠릿에서. National Tsing Hua University의 Instrumentation Center에서 이 작업을 지원했습니다. X선 광전자 분광법(XPS)은 대만 신주에 있는 국립 싱크로트론 방사선 연구 센터의 시설을 사용하여 수행되었습니다. 광전자 분광학 실험은 XPS용 09A2 U5 분광 빔라인을 사용하여 수행되었습니다. 380 및 900eV의 고정 에너지를 갖는 광자는 코어 수준 광전자 분광학 실험 전반에 걸쳐 C(1s) 및 Co(2p)에 사용되었습니다. 실험은 6m 고에너지 구형 격자 모노크로메이터에서 총 전자 수율 모드로 수행되었습니다. 광자는 법선면에 입사되었고, 광전자는 법선면에서 58° 각도로 수집되었다. Au 4f 7/2 에 언급된 모든 스펙트럼의 결합 에너지 84.0 eV에서 코어 레벨 선형 배경을 뺀 후 스펙트럼은 비선형 최소제곱 알고리즘을 기반으로 하는 혼합 가우시안-로렌츠 함수로 맞춰졌습니다[65].
AuNPs의 크기는 환원제의 특성과 형성 및 저장 조건에 따라 다릅니다. SEM 분석은 GO 시트와 AuNP가 평균 AuNP 크기가 60nm인 GO 표면에 균일하게 부착되었음을 나타냅니다(그림 3). 그림 3a는 Au 필름에 있는 GO 시트의 SEM 이미지와 GO 시트가 1μm 미만임을 보여줍니다. GO와 AuNP-GO를 비교하면 AuNP-GO 합성물에서 금 원소를 관찰할 수 있다. 이것은 AuNP가 주름진 GO 표면에 성공적으로 흡착되었음을 나타냅니다. 합성된 AuNP-GO 하이브리드는 그림 3b와 같이 TEM을 사용하여 특성화되었습니다. 그림 3b, c는 합성 조건을 보여줍니다. 10ml GO 시트 용액의 농도는 0.1g/l이었고, AuNP 용액 200μl의 농도는 2.2nM이었다. 100nm 눈금 막대가 있는 그림 3a의 TEM 이미지와 0.5μm 눈금 막대가 있는 그림 3b는 크기의 다른 증폭을 보여주고 AuNP가 GO 시트 표면에 고정되어 있음을 분명히 보여줍니다. AuNPs는 구형을 가졌으며, 이는 GO 시트 표면의 카르복실 기능이 그림 2b와 같이 AuNPs와의 화학적 공유 결합 형성에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다.
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나노복합체의 표면 형태 분석. 아 GO 시트 및 b의 SEM 이미지 AuNP-GO 합성물의 TEM 이미지. ㄷ ERGO AuNP-GO 필름의 TEM 이미지
그림 4a는 GO 시트의 고해상도 C 1s XPS 스펙트럼 분석을 보여줍니다. 284.6 eV의 결합 에너지에서 가장 높은 강도의 C1은 C–C(sp2)의 카르보닐 작용기에 해당하고 285.6, 286.6, 288.2, 289.4 eV의 피크는 방향족 고리의 C–C(sp3)에 해당합니다. , 하이드록실 및 에폭시 그룹의 C–O, 카보닐 그룹의 C=O 및 카르복실 그룹의 O–C=O. 금 필름 기판 위의 GO 시트의 C 1s XPS 스펙트럼은 C–C(sp2), C–C(sp3), C–O, C=O 및 O–C=O의 상대 원자 백분율이 다음과 같다는 것을 보여주었습니다. 각각 77.44, 2.16, 18.14, 1.77, 0.49%[66]. 그림 4b는 1614cm − 1 에서 스펙트럼 특징 피크가 있는 NaCl 용액에서 GO 시트의 라만 스펙트럼 분석을 보여줍니다. (G 밴드), 1355cm − 1 (D 밴드), 2714cm − 1 (2D 밴드), 2947cm − 1 (G + D 밴드) 및 ~ 3240cm − 1 (2D' 밴드) [38, 67]. GO 시트의 형성은 그림 4c와 같이 ATR-FTIR 스펙트럼을 사용하여 다양한 산소 종의 특성을 설명하기 위해 추가로 분석되었습니다. 이 ATR-FTIR 스펙트럼은 또한 GO의 몇 가지 특징적인 피크를 드러냈습니다. 850cm에서 C–O − 1 (C–O–C) 에폭사이드 진동으로 인한 1080cm − 1 에서 C–O (C–O) 알콕시 신축 진동으로 인해 1500~1600cm에서 C=C − 1 방향족 C=C 결합 및 1260cm − 1 에서 C-O로 인해 (C–O–C) 에폭사이드 비대칭 진동 때문입니다. GO 시트 가장자리의 카르복실기는 1652 및 1731cm − 1 에서 피크와 함께 –COOH 신축 진동을 나타냈습니다. 카르보닐기의 C=O 신축 진동에 해당합니다. 스펙트럼은 또한 2900cm − 1 에서 3개의 피크를 보여주었습니다. -CH2의 비대칭 및 대칭 신축 진동 관련 1462cm − 1 에서 변형 피크 GO 평면에 위치한 알켄 그룹(C–H) 때문입니다. GO의 FTIR 스펙트럼은 넓은 범위의 C-OH 및 H2 흡수 광대역 피크를 나타냅니다. O 3370cm에서 진동 − 1 스트레칭 진동으로 인해 [67].
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GO 시트의 스펙트럼 분석. 아 C1 영역의 XPS 고해상도 스캔, b 라만, c FTIR
단백질 상호작용 분산이 있는 수성 GO 및 AuNP의 UV-vis 스펙트럼이 그림 5에 나와 있습니다. AuNP는 표면 플라즈몬(SP) 흡수 밴드에 따라 높은 흡광 계수와 고유한 크기를 가졌습니다. 두 가지 다른 치수의 수정된 AuNP는 SP 흡수 스펙트럼의 520 및 540nm에 대해 15 및 60nm였습니다[68, 69]. 그림 5a는 AuNP-Cys 소광 대역으로 5mM 농도에서 Cys로 변형된 AuNP(520nm) 용액을 보여줍니다[69]. 수성 GO 분산액의 UV-vis 스펙트럼은 두 개의 흡수 피크를 산출했습니다. 즉, 서로 다른 크기의 방향족 sp2 클러스터에서 방향족 C–C 결합의 π–π* 플라즈몬 피크에 해당하는 230nm의 최대값과 n–π* 플라스몬 피크는 에폭사이드와 카르보닐(C=O) 결합의 존재로 인한 것입니다(그림 5b)[9, 20]. GO-EDC/NHS 및 GO-EDC/NHS-BSA 용액의 UV-vis 스펙트럼(그림 5b)은 GO-EDC/NHS 및 GO-EDC/NHS-BSA가 약 270nm에서 피크를 나타냄을 보여주었습니다. 아마도 GO와 아민 그룹 사이의 강한 상호작용 때문일 것입니다[70, 71]. 그림 5c는 AuNP(60nm)가 있는 다양한 농도의 antiBSA에 대한 결합의 흡수 스펙트럼을 보여줍니다. 그림 1b는 AuNP-antiBSA 프로브(샘플 B1)의 합성 용액을 보여줍니다. 파장은 540 및 755nm에서 명백한 흡수 피크를 나타냈으며 540nm의 파장은 주로 AuNP(60nm)에 의해 발생했으며 755nm의 피크는 AuNP+Cys+antiBSA 조합 흡수 피크에 해당합니다. 이 결과는 antiBSA 농도의 증가가 540nm에서 흡광도의 점진적인 증가를 유도하고 755nm에서 근적외선 흡수의 지속적인 증가를 유도함을 보여주었습니다. AuNPs의 표면에서 서로 다른 항BSA-결합 상호작용은 표면 굴절률의 변화를 일으켰고, 이는 차례로 LSPR의 흡광도 강도로 변환되었습니다. LSPR 밴드는 입자 크기의 영향을 받았습니다. AuNPs는 가시 영역에서 강한 SPR 밴드를 보였다. 중간 크기 입자의 굴절률이 증가함에 따라 SPR 피크 위치의 이동은 가시광선에서 근적외선으로 조정될 수 있습니다. 단백질 상호 작용 실험 결과에서 우리는 그림 5d와 같이 AuNP-antiBSA를 혼합했습니다. 감도는 측정된 굴절률의 함수로 500~760nm 대역의 LSPR 파장을 표시하여 결정했습니다. 그런 다음 1.45nM에서 145fM까지 다양한 농도의 antiBSA 단백질을 희석하여 사용하고 200μl 부피로 혼합했습니다. 540 및 760nm 흡수의 변화는 antiBSA와 AuNP의 농도가 다르기 때문에 발생했습니다. 그런 다음 5분 후에 스펙트럼 측정이 이루어졌으며, 이는 광 강도 흡수의 농도가 달랐고 AuNP에 대한 60nm의 흡수 피크는 540 및 755nm에서 관찰되었습니다. 이러한 결과는 AuNP-antiBSA 흡수 보정 곡선과 일치했습니다. 보정 곡선은 y =2.43 + 0.25× (상관 계수, R 2 =0.91) 540nm 흡수 피크의 경우, y =2.56 + 0.31× (상관 계수, R 2 =0.96) 760nm 흡수 피크의 경우, 여기서 x 는 antiBSA 및 y의 농도입니다. 는 광학 흡광도입니다.
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항BSA 상호작용 반응을 갖는 AuNP에 대한 UV-vis 흡수 스펙트럼 분석. 아 AuNP의 SP 흡수 스펙트럼, b GO-바운드 BSA, c AuNP-항-BSA 프로브 및 d 1.45nM~145fM의 다양한 농도의 항BSA 단백질을 희석했을 때 항BSA 상호작용 반응이 있는 AuNP에 대한 보정 곡선
GO 및 AuNP-GO 나노복합체의 면역학적 검출 메커니즘을 이해하기 위해 결합 반응에 대한 스펙트럼 분석을 그림 6과 같이 수행했습니다. 그림 6a는 AuNP-GO 및 GO-BSA 나노복합체의 UV-vis 흡수 스펙트럼을 보여줍니다. GO 시트(0.1g/l) 용액의 경우 약 230nm에서 피크가 있었고[70] 약 300nm에서 숄더가 있었고, GO-BSA 접합체는 약 270nm에서 흡수 피크와 약 270nm에서 피크를 보였습니다. 230nm [9, 20, 70]. AuNP-GO 나노복합체의 조합에서 각각 230, 300, 540nm에서 3개의 흡수 피크가 나타났습니다. AuNP와 GO 시트 표면 사이의 π-π 적층 또는 공유 결합 상호 작용은 AuNP를 생체 적합성이 높은 GO 재료에 고정시키는 주요 원동력이었습니다. GO 시트는 AuNP에 모이도록 만들어 200~300nm의 강력한 흡수 밴드를 생성했습니다. 따라서 GO 시트의 흡수는 가시광선 대역에서 AuNP의 흡수보다 훨씬 컸다. 그림 6b는 AuNP 흡수 피크의 UV-vis 스펙트럼이 540nm에 있음을 보여줍니다[50, 68, 69]. 흡수 피크는 AuNP+Cys 접합체의 경우 540 및 660nm에 있었습니다. AuNP+Cys+GO 접합체의 경우 230, 300, 540, 660nm; AuNP+Cys+GO+항BSA 접합체의 경우 230, 270, 540 및 660nm입니다. GO 시트는 230nm(π–π* 플라즈몬 피크)와 300nm(n–π* 플라즈몬 피크)에서 두 개의 흡수 피크를 가졌습니다. 흡수 파장의 이동이 관찰되었으며, 이러한 흡광도 이동은 AuNP+Cys+GO 표면에 대한 항BSA(0 fM ~ 1.45 nM) 흡수의 확인을 나타내는 것으로 간주되었습니다. 그림 6c는 그림 2b와 같이 AuNP+Cys+GO+antiBSA 프로브(샘플 B2) 용액의 합성을 보여줍니다. antiBSA 농도의 증가는 540nm에서 상대적으로 높았습니다. 그림 6c는 다양한 농도의 광강도 흡수를 보여주며 AuNP에 대한 60nm의 흡수 피크는 540nm에서 관찰되었습니다. antiBSA 농도의 증가는 540nm에서 상대적으로 높았습니다. 이 결과는 AuNP-GO가 antiBSA 농도가 증가할 때 540nm에서 플라즈몬 흡수 특성을 향상시킬 수 있음을 보여주었습니다. 또한 면역 분석 실험에서 GO-BSA(1.52μM) 표적(샘플 A)과 AuNP+Cys+GO+항BSA 프로브를 그림 6d와 같이 혼합했습니다. GO 시트의 소수성 및 π-π 상호 작용 특성 외에도 GO 시트의 단백질과 카르복실 그룹 사이의 공유 결합은 표면 접착을 지원합니다. 이 결과는 AuNP+GO-antiBSA 하이브리드 구조가 GO-BSA 상의 다른 단백질과 안정적인 면역 반응을 형성하기 때문인 것으로 보인다. 파장은 260nm에서 명백한 흡수 피크를 보였습니다. GO 시트의 소수성 및 π-π(π-π* 플라스몬 피크) 상호 작용 특성 외에도 GO 시트의 단백질과 카르복실기 간의 공유 결합은 표면 접착을 지원합니다. BSA 및 antiBSA 결합 전후에 GO(230 및 270nm)의 π–π* 플라스몬 피크 값이 크게 이동하여 BSA와 antiBSA가 양의 결합임을 입증했습니다.
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면역 반응에 대한 UV-vis 흡수 스펙트럼 분석. 아 AuNP 결합 GO 및 GO 결합 BSA, b AuNP 및 GO 결합 항-BSA, c AuNP-GO-antiBSA 프로브 및 d 면역 반응을 위한 AuNP-GO-antiBSA 프로브 및 GO-BSA 표적
그림 7은 이러한 결과가 보정 곡선과 잘 일치함을 보여줍니다. 위의 실험 결과(그림 6c, d)를 자세히 분석한 결과 흡광도의 평균 부정확도에 대한 감지 응답은 1.3487, 1.1776, 1.0698, 0.8755, 0.8588(그림 7a) 및 0.9226, 0.80764, 0.80764로 나타났습니다. , 및 0.695(그림 7b), 각각 1.45nM, 145pM, 14.5pM, 1.45pM, 145fM 단백질 농도에 해당합니다. 그림 7a는 교정 곡선의 선형 회귀가 f(x)임을 보여줍니다. =0.918 + 0.124× (상관 계수, R 2 =0.94) 항BSA 상호작용이 있는 AuNP-GO 프로브의 경우, 여기서 x 는 단백질 농도이고 y 는 광학 흡광도입니다. 또한 그림 7b는 적합 곡선의 선형 회귀 방정식이 f(x)임을 보여줍니다. =0.791 + 0.057× (상관 계수, R 2 =0.954) 면역분석에 기초한 GO 및 AuNP-GO의 경우
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다양한 단백질 농도에서 얻은 감지 반응의 보정 곡선 비교. 아 AntiBSA 상호 작용이 있는 AuNP-GO 프로브에 대한 보정 곡선. ㄴ 면역 분석에 기반한 GO 및 GO-AuNP에 대한 보정 곡선
정량 실험 중에 간섭 물질로 작용하기 위해 10ng/ml의 인간 융모막 성선 자극 호르몬(hCG) 단백질의 고정 농도를 추가했습니다. 결과는 면역분석 교정 곡선의 고정 간섭자 hCG 단백질이 f(x) =0.843 + 0.113× (상관 계수, R 2 =0.89) 항BSA 상호작용이 있는 AuNP-GO 프로브의 경우(그림 7a) 및 f(x) =0.722 + 0.051× (상관 계수, R 2 =0.73) 면역분석에 기초한 GO 및 AuNP-GO의 경우(그림 7b).
또한, 우리의 실험 결과는 검출 전략이 특이성의 손실 없이 표면 재생을 허용하고(4회 재생) 1.45nM, 145pM, 14.5pM, 1.45pM 범위의 동적 반응을 갖는 항BSA 단백질을 검출하는 데에도 사용될 수 있음을 보여주었습니다. , 145 fM 및 0 fM. The results demonstrated that with a decreased concentration of antiBSA (from 1.45 nM to 145 fM) and even without the presence of antiBSA (0 fM), the spectral absorption intensity did not change the minimum level of quantitation. The hCG protein interfered with the antibody recognition in the immunoassay to a limited extent, possibly due to non-specific adsorption. This implies a very low cross-reactivity of the hCG protein and non-specific interactions at a low adsorption. In the practical quantitative analysis with immunoassays, a LOD of 145 fM for antiBSA was achieved in both buffer and interference protein samples.
We successfully demonstrated a GO-bound AuNP biocompatible nanocomposite in a biosensing mechanism in a rapid and label-free immunoassay for biomolecule interactions. The results showed that the AuNP-GO nanocomposite was biocompatible and exhibited LSPR extinction to biomolecules, which could promote the absorption spectra characteristic peaks, accelerate the reaction of molecules, and enhance the stability of chemical covalent bonds during immobilization. For the detection of antiBSA protein, the limit of detection of the GO and AuNP-GO based on the immunoassay was as low as 145 fM. Among the AuNP-GO biosensors, GO immobilized in the AuNP-GO nanocomposite showed the highest bioaffinity, with good sensitivity, low detection limit, and fast response toward the protein immunoassay. The results of our experiments showed that a fixed concentration 10 ng/ml of hCG protein as an interferer did not affect the test response. Given the growing trend of applying biosensors in POCT, LSPR for AuNP-GO nanocomposite technology is a highly promising and versatile tool for use in immunoassays. Combining the properties of AuNPs and GO sheets to develop new nanocomposites for the synthesis of smart materials shows promise for the development of user-friendly diagnosis applications. In the future, AuNP-GO nanocomposites may be used in innovative immunoassays, rapid detection reagents, and miniaturization, which may in turn make LSPR technology an irreplaceable tool for routine clinical analysis and POCT diagnostics.
Silver
Bovine serum albumin antibody
Gold
Gold nanoparticle
Bovine serum albumin
Cystamine
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide
Field-emission gun transmission electron microscope
Fourier-transform infrared spectrometer
Graphene oxide sheet
High-resolution transmission electron microscope
Limit of detection
Localized surface plasmon resonance
8-Mercaptooctanoic acid
N -Hydroxysuccinimide
Palladium
Point-of-care testing
Platinum
Reduction graphene oxide
Self-assembled monolayers
Surface-enhanced Raman scattering
Ultraviolet-visible
X-ray photoelectron spectroscopy
Zinc oxide
나노물질
초록 고성능 포도당 바이오센서는 건강 관리에 매우 요구됩니다. 이러한 요구를 충족시키기 위해 포도당 바이오센서, 특히 무효소 포도당 바이오센서가 많은 주목을 받고 있다. 높은 표면적, 우수한 전기적 특성, 우수한 생체적합성을 지닌 그래핀과 같은 2차원 재료는 지난 10년 동안 바이오센서 연구의 주요 초점이었습니다. 이 리뷰는 MoS2 기반의 무효소 포도당 바이오센서의 최근 진행 상황을 보여줍니다. 나노복합체. 전기화학적 포도당 바이오센서에 중점을 두고 포도당 검출을 위한 두 가지 다른 기술이 도입되었습니다. MoS2의 도전과 미래
초록 MoSe2 결합 다른 전이 금속 디칼코게나이드와 함께 하이브리드 나노구조를 형성하는 것은 수소 발생 반응(HER)에 대한 전기 촉매 활성을 향상시키는 효과적인 경로입니다. 이 연구에서 MoSe2 -Ni3 Se4 꽃과 같은 형태를 가진 하이브리드 나노전기촉매는 종자 유도 용액 접근법에 의해 합성됩니다. 별도의 나노결정을 형성하기 위해 독립적으로 핵을 형성하는 대신 Ni3 Se4 구성 요소는 MoSe2의 초박형 나노 플레이크 표면에서 핵 생성 및 성장하는 경향이 있습니다. 하이브리드 나노 구조를 형성합니다. 모스2 –Ni3 Se
