암배아 항원을 극도로 민감하게 감지하기 위한 새로운 자기탄성 면역센서

초록

암배아 항원의 초고감도 검출을 위한 새로운 무선 면역 센서가 개발되었습니다. 자기탄성 민감 단위인 마이크로칩의 최적 치수는 시뮬레이션 및 실험을 통해 평가되었습니다. 독특한 효과 신호 증폭 및 금 입자의 생체 적합성은 센서의 안정성과 감도에 기여합니다. 또한 민감도를 높이기 위해 항체와 BSA의 작업 농도를 각각 50mg/mL 및 0.1%로 선택합니다. 원자간력현미경 이미징은 생물학적 분석에 빛을 발합니다. 나노 자기탄성 면역센서는 0.1~100ng/mL 범위의 암배아항원(CEA) 농도 대수에 대해 선형 반응을 나타내며 검출 한계는 2.5pg/mL입니다. 설계된 바이오센서는 안정성과 CEA에 대한 감도가 우수한 장점이 있습니다.

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배경

암은 전 세계적으로 치명적인 질병 중 하나입니다[1]. 환자의 암은 종양 바이오마커의 농도가 혈청 내 일정량에 도달하면 임상적으로 검출할 수 있다[2]. 따라서 암 진단을 위한 효과적인 전략을 제공하는 종양 표지자에 대한 민감하고 빠르고 정확한 분석을 달성하는 것이 매우 필요합니다[3]. 암배아 항원(CEA)은 180~200 kDa의 분자량을 갖는 세포 표면 당단백질 계열입니다. 1965년 인간의 대장암 조직에서 처음 발견되었다[4, 5]. CEA는 일반적으로 건강한 성인의 혈액에서 매우 낮은 수준(0~5ng/mL)으로 나타납니다[6]. 일반적으로 CEA의 비정상적인 수치는 위암[7], 췌장암[8], 결장직장암[9], 폐암[10], 유방암[11]과 같은 암의 징후로 간주될 수 있습니다. 이는 CEA가 종양 바이오마커로 사용될 수 있음을 의미합니다. 혈액 내 CEA 수치 모니터링은 암을 사전에 경고, 선별 및 진단하는 데 활용될 수 있습니다. 한편, CEA는 임상 치료를 받은 사람들의 후속 연구에도 사용할 수 있습니다. CEA의 종양 재발에 대한 민감도는 80% 이상으로 임상 및 병리학적 검사보다 빠릅니다. 따라서 CEA의 지속적인 관찰은 치료 효과의 진단 및 예후를 위한 중요한 기초가 됩니다[12].

바이오센서는 특정 분야에서 생물학적 분자 출력 측정 가능한 신호의 특정 인식에 응답하여 빠른 응답, 높은 감도 및 저렴한 비용을 허용합니다. 최근에는 효소 면역 측정법[13], 불소 면역 측정법[14], 전기화학적 면역 측정법[15,16,17]과 같은 면역학적 바이오센서가 집중적으로 연구되고 있다. 면역 센서는 뛰어난 특이성과 감도로 인해 표적 화합물의 농도가 매우 낮은 경우에도 종양 바이오마커 분석에 유망한 수단을 제공했습니다[18,19,20,21].

나노기술은 바이오센싱 기술에 나노입자(NP)를 적용하기 위한 새로운 방법을 제공하고 있습니다. 금속 나노입자는 생체 인식 요소를 연결하기 위한 놀라운 플랫폼을 제공하는 많은 특별한 특성을 나타냅니다[22, 23]. NP에 기반한 면역분석은 연구자들에게 큰 관심을 끌었다[24,25,26]. 자기탄성 바이오센서는 높은 응답 감도로 주변 온도와 pH의 영향을 받지 않습니다. 따라서 본 연구에서는 금 나노입자(AuNPs)와 자기탄성 마이크로칩을 기반으로 한 자기탄성 면역분석법을 제안하였다. CEA 바이오마커를 검출하기 위한 면역센서가 성공적으로 개발되었습니다.

결과 및 토론

자기탄성(ME) 마이크로칩의 리본 모양의 관점에서 볼 때 투자율은 길이를 따라 가장 크다[27]. 예비 결과는 ME 칩의 최적 너비와 두께가 각각 1mm와 28μm임을 보여주었다[28]. 시뮬레이션은 그림 1b와 같이 칩의 길이를 최적화하는 데 사용되었습니다.

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ME 칩의 최적 길이. 아 상대 변위는 길이의 변화에 따라 다릅니다. ㄴ 칩의 길이를 최적화하기 위해 시뮬레이션이 사용되었습니다.

상대 변위는 그림 1a에서 길이의 변화에 따라 다릅니다. 최대 상대 변위는 1차 모달 해석에서 길이가 6mm일 때 구합니다. 이론적으로 가장 높은 감도를 의미합니다. 따라서 본 논문에서는 칩의 최적 치수를 6mm × 1mm × 28μm로 설계하였다.

Nano-ME 바이오센서의 개략도를 Fig. 2에 나타내었다. 먼저 Nano-ME 칩을 화학적으로 시스테인 처리하여 표면에 자기조립분자(SAM) 필름을 형성하여 고정화 기능층으로 사용하였다. CEAAb. 그런 다음, 소 혈청 알부민(BSA)은 비특이적 결합 및 입체 장애를 감소시켜 CEAAb의 성능을 촉진합니다. 칩의 표면 형태를 관찰하기 위해 원자간력현미경(AFM) 이미지를 수행하였다. 도 3a에 나타난 바와 같이 SAM 층의 두께는 120 nm였다. 그림 3b의 영상은 CEAb가 거칠기가 증가하면서 SAM 층에 공유적으로 부착되었음을 보여줍니다. CEA가 약 200nm의 높이와 더 큰 크기로 구체적으로 인식되고 효과적으로 결합되었음을 그림 3c에서 명확하게 표시했습니다.

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구성된 Nano-ME 바이오센서의 구성

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SAM 레이어의 AFM 이미지(a ). CEAAb-SAM 레이어(b ). CEA-CEAAb의 복합체(c )

칩의 특정 차원에서 항체의 농도는 면역 센서의 감도와 관련된 중요한 요소입니다. 따라서 다양한 농도의 CEAAb(20, 50, 70, 100μg/mL, 그림 4a 참조)의 반응 신호를 평가할 필요가 있었습니다. 결과는 CEAAb의 농도가 50μg/mL일 때 약 448Hz(그림 4b)에서 최적의 반응이 얻어졌음을 보여줍니다. CEAAb의 농도가 70μg/mL로 증가하면 입체장애와 정전기적 반발로 인해 반응이 떨어지기 시작한다[29].

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아 주파수 응답 대 CEAAb의 곡선. ㄴ 주파수 히스토그램

원칙적으로 CEA는 항체로 특이적으로 인식되어 반응 빈도가 감소합니다. 그림 5a는 CEA에 대한 면역 센서의 실시간 응답 곡선을 보여줍니다. 한편, 그림 5b에서 선형 피팅 곡선을 얻습니다.

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실시간 응답(a ) 및 피팅 곡선(b ) 바이오센서 대 CEA

일반적으로 센서의 안정적인 응답은 40분에 달성되었습니다(그림 5a). 공명 주파수의 변화는 해당 농도의 CEA로 기록되었습니다. Hz의 변화는 0.1에서 100ng/mL(R) 범위의 CEA 농도의 로그에 선형적으로 의존합니다. ² =0.9688), 검출 한계는 2.5pg/mL입니다(그림 5b). 우리가 아는 한 선형 범위와 검출 한계는 이전 방법보다 분명히 낮습니다[28]. 결과는 CEA에 대한 무선 및 매우 민감한 방법이 성공적으로 확립되었음을 보여주었습니다.

결론

이 기여에서, CEA의 고감도 검출을 위한 Nano-ME 면역 센서는 ME 칩을 기반으로 성공적으로 개발되었습니다. AuNP와 BSA는 감도와 안정성을 효과적으로 개선했습니다. 제안된 Nano-ME 면역센서는 2.5 pg/mL의 낮은 검출 한계와 함께 0.1 ~ 100 ng/mL의 넓은 CEA 측정 범위를 나타냅니다. 따라서 준비된 면역 센서에 의한 정확한 CEA 측정은 만족스러운 결과를 얻었습니다. 특이성, 단순성 및 재현성으로 인해 제안된 플랫폼은 비침습적 암 탐지 개발에 유망한 응용 프로그램을 보여줍니다.

방법

시변 자기장 하에서 ME 마이크로칩은 길이를 따라 진동합니다. ME 마이크로칩을 진동시키기 위한 변조 자기장에서 자기장의 에너지는 최대값에 도달하기 위해 탄성 위치 에너지로 변환된다. 리본과 같은 센서 칩의 모양으로 인해 투자율은 길이에 따라 가장 큽니다. 따라서 입사 자기장은 센서의 기저면에 수직인 것을 제외한 거의 모든 방향에서 센서에 세로 방향 진동을 생성합니다. 식에 의해 주어진다. (1):

$$ {f}_0=\frac{1}{2L}\sqrt{\frac{E}{\rho \left(1-{\nu}^2\right)}} $$ (1)

여기서 E 탄성 계수를 나타냅니다. v 포아송 비, ρ 는 센서 재료의 밀도이고 L 칩의 세로 치수입니다. 시험 온도, 습도 및 기타 환경 매개변수가 일정할 때 자기탄성 센서의 공진 주파수 변화는 질량 변화(△m ) 식에 의해 주어진 것처럼 표면에 (2)

$$ \frac{\triangle f}{\triangle m}=-\frac{f_0}{2M} $$ (2)

식을 기반으로 합니다. (2) 공진 주파수의 변화는 CEA의 양에 비례한다. 따라서 CEA 농도는 주파수의 변화에 의해 달성될 수 있습니다. 여기서 f ₀ 초기 공진 주파수, M 는 초기 질량, △m 는 질량 변화이고 △f 센서의 공진 주파수의 이동입니다. 수학식 2는 센서 감도(△f /△m )는 센서의 초기 자기탄성 질량(M)에 반비례합니다. 물리적 치수가 더 작은 센서는 초기 질량이 낮아 감도가 높아집니다. 방정식의 음수 기호는 주파수의 감소를 나타냅니다(△f ) 비 자기탄성 질량 추가(△m ) 센서에. 따라서 표적 유기체가 바이오센서 표면에 결합하면 기본 공명 주파수가 감소함에 따라 질량이 증가합니다.

Metglas 합금 2826MB(Fe40Ni38Mo4B18)의 자기탄성 베이스는 Honey well Corporation(미국 뉴저지주 모리스타운)에서 가공되었습니다. CEA, CEA 항체, 소 혈청 알부민(BSA, 99%) 및 인산 완충 식염수(PBS, pH =7.4)는 Sangon(Shanghai, China)에서 구입했습니다. 아세톤, 이소프로판올, 에탄올, 1-에틸-3-카르보디이미드(EDC) 및 N -히드록시술포숙신이미드(NHS)는 Sigma-Aldrich Corporation(Saint Louis, MO, USA)에서 구입했습니다. 다른 모든 시약은 분석 등급이었습니다. 초순수는 Mill-Q system(Milli-pore, USA)에서 얻었다. AFM Park System(ND-100, 한국), 플라즈마(P3C, 중국 상하이), 가우스 저항계(GM500), ZNB 벡터 네트워크 분석기(독일 R&S), 레이저 커터(AV3620A, 중국 청도), HT20 가우스 미터 (Hengtong, Shanghai)를 사용했습니다.

합금 ME 베이스를 6mm × 1mm × 28μm 마이크로칩으로 레이저 절단한 다음, 아세톤, 이소프로판올, 에탄올 및 탈이온수로 5분 동안 초음파 세척하고 질소로 건조시켰다. 세정된 마이크로칩의 표면 개질 활성화는 플라즈마 방식으로 처리된다. 마이크로칩의 양면을 크롬층(100nm)으로 스퍼터링한 후 AuNP층(40nm)으로 코팅하여 나노-ME 칩을 제작하였다. Nano-ME 칩은 고순도 산소(0.9999)로 플라즈마를 처리한 다음 40mM 시스테아민 용액에 담그고 실온에서 12시간 동안 유지합니다. 그 후, Nano-ME 칩을 생물학적으로 변형하고 1-에틸-3-카르보디이미드(EDC) 및 N의 존재 하에 37°C에서 1시간 동안 다양한 농도의 CEAAb와 함께 인큐베이션했습니다. -히드록시술포숙신이미드(NHS). CEAAb는 먼저 10 mg/mL EDC 및 10 mg/mL NHS로 활성화되었습니다. 마지막으로 CEAAb로 변형된 Nano-ME 칩을 0.1% BSA로 30분 동안 추가로 수행했습니다.

Nano-ME 바이오센서는 다음과 같이 구성되었습니다:유리관을 코일로 감싸고 벡터 네트워크 분석기에 연결했습니다. 한편, 자기장을 추가하면 코일이 교류 자기장을 생성하도록 교류를 제공했습니다. Nano-ME 바이오센서의 공진 주파수는 벡터 네트워크 분석기로 얻을 수 있다. 다른 농도의 CEA(0-100ng/mL)를 시험관에 첨가하고 40분까지 5분마다 주파수 이동을 기록했습니다. 그 후, AFM 특성화를 위해 Nano-ME 칩을 PBS로 헹구었습니다.

약어

AFM:: 원자간력현미경
AuNP:: 금 나노 입자
BSA:: 소 혈청 알부민
CEA:: 암배아 항원
CEAAb:: CEA 항체
EDC:: 1-에틸-3-카보디이미드
Hz:: 빈도
저:: 자기탄성
NHS:: 아니 -히드록시술포숙신이미드
PBS:: 인산염 완충 식염수
샘:: 자기 조립 분자

용액 처리된 나노결정질 p형 CuAlO2 박막 트랜지스터의 준비 및 특성화 염료 분해를 위한 새로운 p-Ag3PO4/n-BiFeO3 이종 접합 복합 재료의 손쉬운 합성 및 향상된 가시광 광촉매 활성

나노물질