생체내 CT 이미징 및 신장 제거 특성을 위한 새로운 생체 ​​적합성 Au Nanostars@PEG 나노입자

방법

관련 세부 정보를 포함한 모든 실험 프로토콜은 중국 랴오닝성 진저우 의과대학 지역 윤리 위원회의 승인을 받았습니다.

재료 및 도구

모든 화학 물질은 Sigma-Aldrich(미주리주 세인트루이스)에서 구입했으며 달리 명시되지 않는 한 직접 사용했습니다.

합성된 나노 입자는 200kV 가속 전압(Tecnai G2 Twin, FEI, Hillsboro, OR)을 사용한 투과 전자 현미경(TEM) 및 에너지 분산 X선(EDX) 분석으로 특성화되었습니다. TEM 샘플은 formvar/carbon-coated copper grid에서 희석된 나노입자 용액을 건조하여 준비되었습니다. 샘플은 탄소 그리드에 희석된 콜로이드 용액 한 방울을 떨어뜨리고 액체를 실온에서 공기 중에서 건조시켜 준비했습니다. UV-vis 흡착 스펙트럼은 Shimadzu UV-2450 UV/Vis/NIR 분광광도계에서 기록되었습니다. 동적 광산란(DLS) 측정은 Malvern Zetasizer NANO ZS에서 25°C에서 수행되었습니다.

금 나노스타/PEG(AuNS@PEG) 나노입자 합성

Au 나노별(Au NS)은 이전 보고서[20,21,22]에 따라 약간의 조정과 함께 종자 매개 성장 방법을 통해 합성되었습니다. 일반적으로 10nm 직경으로 형성된 Au 종자는 HAuCl₄의 화학적 환원에 의해 합성되었습니다. 이전 보고서에 따르면 [23]; 6ml HAuCl₄ 솔루션(w /v 1%)를 140ml의 초순수에 첨가하고 교반하면서 끓을 때까지 가열하였다. 그런 다음 0.75ml의 올레일아민을 빠르게 주입하고 생성된 혼합물을 2시간 더 끓였습니다. Au 콜로이드는 자연적으로 실온으로 냉각되었습니다. 60ml의 사이클로헥산을 콜로이드에 첨가하고, 용액을 추가로 1시간 동안 자기 교반하였다. 이어서, 1.5ml의 NaOH(4M)를 추가 30분 동안 격렬하게 교반하면서 혼합물에 주입하였다. 혼합물은 계층적으로 남겨졌습니다. 에탄올을 첨가하여 상층에 포함된 Au 나노시드를 침전시켰다. 침전물을 에탄올과 물로 한 번 더 교대로 정제하고 물에 분산시켰다.

이전 연구에 따라 AgNO₃를 신속하고 동시에 혼합하여 직경이 약 50nm인 Au 나노스타를 합성했습니다. (1 ml, 3 mM) 및 아스코르브산(500 μl, 0.1 M)과 0.25 mM HAuCl₄을 포함하는 용액 100ml , 1mM HCl 및 1.5ml의 금 나노스피어 시드. 그런 다음, 티올화 폴리에틸렌 글리콜(PEG, 6kDa) 폴리머를 과량으로 첨가하여 나노입자 표면을 부동태화했습니다. 혼합물 용액을 24시간 동안 계속 교반한 후, 얻어진 AuNS@PEG 나노입자를 원심분리/물 재분산의 3주기를 통해 수집하였다. 형성된 AuNS@PEG 나노입자는 추가 사용을 위해 물에 재분산되었습니다.

세포 배양 및 AuNS@PEG 나노입자 노출

신경교 세포는 쥐의 척수 조직에서 수집되었습니다. 세포는 5% CO가 있는 가습 인큐베이터에서 37°C에서 10% 소 태아 혈청, ml 페니실린 100U, 스트렙토마이신 100μg이 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM)(Gibco, USA)에서 배양되었습니다. 하위>2 . 세포를 배양 플레이트에 접종한 다음 특정 농도(50, 100, 200, 500, 1000ppm)에서 2시간 동안 AuNS@PEG 나노입자에 노출시켰습니다. AuNS@PEG 나노입자가 없는 DMEM을 대조군으로 사용하였다.

동물 및 치료

이 작업은 국립 보건원의 실험 동물 관리 및 사용에 대한 지침의 권장 사항에 따라 엄격하게 수행되었습니다. 이 프로토콜은 중국 진저우 의과대학 동물 실험 윤리 위원회(허가 번호:LMU-2013-368)의 승인을 받았습니다. 수컷 Sprague Dawley 쥐(180–200g)는 Jinzhou 의과대학 동물 센터(라이선스 번호:SCXK 2009-0004)에서 구입했습니다. 모든 쥐는 12시간/12시간 명/암 광주기 및 50% 습도가 있는 특정 병원체 없는 실험실의 온도 조절실(25.0±0.2°C)에서 먹였습니다. 쥐는 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있었습니다.

인도적 종말점은 안락사를 통해 실험 동물의 고통이나 고통을 최소화하거나 종료하기 위해 선택되어 흡입제, 비흡입 약제 및 물리적 방법을 포함합니다. 이 연구에서 쥐를 두 그룹으로 나누었습니다. (1) 대조군:쥐에게 염소수화물 용액(10wt%)을 복강 내 주사하여 마취한 다음 꼬리 정맥을 통해 800μL의 인산완충식염수를 주입했습니다. (2) 시험:쥐에게 염소수화물 용액(10wt%)을 복강내 주사하여 마취시킨 후 꼬리정맥을 통해 AuNS@PEG 나노입자 용액(200μg/ml) 800μL를 주입하였다. H&E 연구를 위해 쥐를 사전 마취 없이 경추 탈구로 희생시켰고, 심장, 간, 신장, 비장 및 내장을 즉시 해부하여 - 80°C에 보관하고 추가 시간까지 드라이아이스에서 이소펜탄으로 급속 냉동했습니다. 처리되었습니다.

세포 생존 분석

대수기 신경교 세포를 96웰 플레이트에 1×10 ⁴ 로 시딩했습니다. 100μl 세포 현탁액에서 웰당 세포. 인산염 완충 식염수(PBS)를 주변 웰에 추가했습니다. 플레이트를 37°C 및 5% CO₂에서 배양했습니다. 24시간 동안 세포가 부착되도록 합니다. 그런 다음 세포를 4개의 그룹으로 할당했습니다:대조군의 세포는 10% 소태아 혈청을 함유하는 DMEM에서 인큐베이션되었고; AuNS@PEG 나노입자 그룹에서 0, 25, 50, 100, 200, 500 또는 1000ppm AuNS@PEG 나노입자를 배양 배지에 첨가했습니다. 세포는 도립 위상차 현미경(Leica, Heidelberger, Germany)에서 24시간 후에 관찰되었습니다. 그 후, 20μl MTT(Sigma, St. Louis, MO, USA)를 4시간 동안 각 웰에 첨가했습니다. 배지를 제거하고 세포를 37°C에서 10분 동안 150μl의 디메틸 설폭사이드와 함께 인큐베이션했습니다. 광학 밀도(OD) 값은 마이크로플레이트 리더(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 490nm에서 측정되었습니다.

유세포분석

세포를 6웰 플레이트에서 24시간 동안 배양한 다음 위에서 설명한 대로 그룹화하고 처리했습니다. 트립신을 사용하여 단일 세포 현탁액을 만들고 300g에서 원심분리했습니다. 3분 동안 상층액을 제거한 후 세포를 미리 냉각된 PBS로 두 번 세척하고 1ml annexin V(Tianjin Sungene Biotech Co, Ltd., Tianjin, China)에서 10분 동안 원심분리했습니다. 셀이 10 ⁵ 으로 조정되었습니다. /ml. 세포 현탁액을 원심분리하고 PBS로 3회 세척하였다. 샘플(100μl)을 5μl annexin V-APC(Tianjin Sungene Biotech Co., Ltd.) 및 7-AAD(Tianjin Sungene Biotech Co, Ltd.)가 포함된 Eppendorf 튜브에 첨가하고 혼합했습니다. PBS로 부피를 최대 500μl로 만들고, 튜브를 암실에서 15분 동안 실온에서 인큐베이션했습니다. 세포 사멸은 유세포 분석법(BD FACSCanto II, BD Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)에 의해 정량화되었습니다. 세포 사멸률은 세포 사멸 세포 수/총 세포 수 × 100%로 계산되었습니다.

CT 이미징

CT 영상은 General Electric Company(GE)에서 생산한 128행 64슬라이스 나선 CT를 사용하여 획득했습니다. 이미징 매개변수는 다음과 같습니다. 슬라이스 두께는 0.625입니다. 매체는 누드 마우스입니다. 튜브 에너지, kvp는 120μA 및 100mA입니다. CTDIVOL은 6.53mGy입니다. 반경은 4.8cm입니다. 모든 동물은 낮은 가슴에서 골반까지 두개골에서 꼬리 방향으로 스캔되었습니다. CT 데이터는 영상과 후처리로 분석하였다.

조직학적 분석

장기를 제거하고 4% 파라포름알데히드에 고정한 다음 2일에 한 번 30% 파라포름알데히드 자당 용액으로 고정하고 절편하고 표준 기술을 사용하여 조직학적 검사를 위해 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색했습니다. 섹션은 도립 위상차 현미경으로 검사되었습니다.

신장 기능 평가

BUN, Crea, β₂를 평가하기 위해 생화학 분석기(Jinzhou Medical University)를 사용했습니다. -MG 및 CO₂ 혈액에서. BUN, Crea, β₂의 혈청 수치 변화로 신장 기능 평가 -MG 및 CO₂ 쥐에 AuNS@PEG 나노입자 주입 전후.

통계 분석

데이터는 평균 ± SD로 표현되었으며 GraphPad Prism 5.0 소프트웨어(GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) 및 SPSS를 사용하여 분석되었습니다. 일원 분산 분석과 최소 유의차 검정을 사용하여 그룹을 비교했습니다. 피 <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

결과 및 토론

AuNS@PEG 나노입자의 합성 및 특성화

나노물질은 인체에 들어가 감지하는 역할을 한다. 나노 입자의 물리적 및 화학적 특성은 순환계에 들어가기 전에 먼저 고려됩니다[24, 25]. 우리가 알고 있듯이 생체 내 CT 이미징 및 신장 청소 특성을 위한 고성능 나노프로브의 개발에는 두 가지 핵심 요소가 있습니다. 하나는 추가 표면 기능화입니다. 다른 하나는 크기 조절입니다.

AuNS@PEG 나노입자의 구조를 확인하기 위해 대규모 TEM(Transmission Electron Microscopy) 이미지(그림 1a)를 사용하여 AuNS@PEG 나노입자의 별 구조가 명확하게 확인되었으며 이러한 나노입자는 이상적인 크기를 가졌습니다. 균일성이 높은 50nm 그런 다음 AuNS@PEG 나노입자의 에너지 분산 X선(EDX) 스펙트럼에서 발견되는 Au의 요소도 Au 나노별의 제조를 증명합니다(그림 1c). 또한, AuNS@PEG 나노입자 표면의 조성은 XPS 스펙트럼에 의해 추가로 특성화되었으며, Au 나노스타와 PEG에서 유래한 Au4f, C1s 및 O1s가 그림 1b에 명확하게 나타나 AuNS의 형성을 확인했습니다. @PEG 나노입자.

<사진>

AuNS@PEG 나노입자의 투과 전자 현미경 사진(a ), XPS(b ) 및 EDX(c ) AuNS@PEG 나노입자

위의 특성은 AuNS@PEG 나노입자의 성공적인 합성을 입증했습니다.

CT AuNS@PEG 나노입자의 가치

Au 나노 입자는 기존의 요오드 기반 저분자 CT 조영제보다 우수한 X선 감쇠 특성으로 인해 CT 조영제로 널리 사용되었습니다. 요오드(Z =53)은 역사적으로 CT 영상 분야에서 첫 번째 선택의 원자였습니다. X선 컴퓨터 단층 촬영 영상을 위한 AuNS@PEG 나노 입자의 가능성을 평가하기 위해 CT 값(Hounsfield 단위, HU)을 측정했습니다. 그림 2a는 AuNS@PEG 나노입자가 동일한 농도의 요오드 및 탈이온수에 비해 CT 값이 더 높음을 보여줍니다. AuNS@PEG 나노입자 농도가 증가하면 CT 영상 강도도 영상이 밝아짐에 따라 지속적으로 증가하였다. 농도의 함수로 AuNS@PEG의 CT 값(HU)을 플로팅함으로써(그림 2b), 농도가 다른 AuNS@PEG 나노입자의 CT 값의 선형 감쇠를 볼 수 있습니다. 이러한 결과는 AuNS@PEG 나노입자가 양성 CT 이미징 나노프로브에 이상적인 후보임을 보여줍니다.

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Au 농도의 함수로서 AuNS@PEG 나노입자의 X선 감쇠 강도(a ) 및 다양한 농도(각각 요오도히드린, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.75, 15.625 및 7.8125ppm)에서 AuNS@PEG 나노입자의 CT 이미지(b )

세포독성 분석

조영제로 생체 내 CT 영상화에 사용되기 전에 시험관 내 AuNS@PEG 나노 입자의 생체 적합성을 조사하는 것이 중요했습니다. MTT 분석은 신경교 세포에 대한 세포 독성을 평가하기 위해 수행되었습니다. 24시간 동안 다양한 농도(각각 25, 50, 100, 200, 500, 1000ppm)에서 AuNS@PEG 나노입자와 배양한 후 신경교 세포의 MTT 생존력 분석을 수행했습니다. 연구된 농도 범위에서 AuNS@PEG 나노입자로 처리한 후 세포의 생존력은 대조군과 매우 유사하다는 것을 알 수 있었습니다. . 비교적 고용량의 나노입자(1000ppm)에서도 세포 생존율은 여전히 ​​90% 이상을 유지했습니다(그림 3a).

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다양한 농도의 AuNS@PEG 나노입자와 함께 24시간 동안 배양한 신경교세포의 세포 생존력(a ); AuNS@PEG 나노입자에 의해 유도된 세포의 아폽토시스는 유세포 분석:대조군(bi ), 25ppm(ii ), 50ppm(iii ), 100ppm(iv ), 200ppm(v ), 500ppm(vi ) 및 1000ppm(vii )

AuNS@PEG 나노입자의 세포적합성은 2시간 동안 다른 농도에서 AuNS@PEG 나노입자로 처리된 세포의 유세포 분석을 통해 추가로 확인되었습니다. 유세포 분석에서 PBS 및 AuNS@PEG 나노입자로 처리한 후 세포를 annexin V-APC 및 7-AAD로 염색하였다. 염색하지 않고 PBS로 처리한 신경교세포를 대조군으로 사용하였다(그림 3b). AuNS@PEG 나노입자를 각각 25, 50, 100, 200, 500, 1000ppm 농도로 처리한 세포를 볼 수 있습니다(그림 3bi-vii). MTT 분석 결과와 함께 우리의 결과는 AuNS@PEG 나노 입자가 우수한 세포 적합성을 가지며 AuNS@PEG 나노 입자로 처리한 후 명백한 세포 형태 변화가 없음을 보여주었으며 이는 MTT 데이터와 일치했습니다.

체내 CT 이미징 및 생체 분포

시험관 내 실험에서 높은 CT 조영제 성능에 고무되어 우리는 생체 내 CT 조영제로서 AuNS@PEG 나노 입자의 가능성을 추가로 확인했습니다. AuNS@PEG 나노입자(200ppm)를 쥐의 꼬리 정맥에 정맥 주사했습니다. 이러한 AuNS@PEG 나노입자의 투여량은 MTT 및 유세포 분석의 낮은 독성 및 세포자멸사 비율 및 CT의 높은 감도의 결과로 인해 선택되었습니다. 중요한 장기 영역의 CT 영상은 꼬리 정맥 주사 전과 꼬리 정맥 주사 후 다른 시점에 기록되었습니다(그림 4). 우리의 연구는 CT 영상 및 신장 청소 능력을 테스트하는 것을 목표로 합니다. 그래서 우리는 CT 영상에서 신장과 방광의 장기 변화를 강조한다. 그림 4a는 주사 전 쥐의 신장 CT 이미지입니다. 주입 전과 비교하여 신장 영상이 0.5시간에서 2시간으로 크게 향상되었습니다(그림 4b-d). 쥐에서 AuNS@PEG 나노입자의 시간 의존적 분포는 또한 정맥 주사 후 CT 신호 값에 의해 추적되었습니다. 신장 및 방광 영상은 0.5시간에서 2시간으로 크게 향상되었으며 HU 값은 95에서 464로, 105에서 664로 증가했습니다. 주사 후 6시간 후 쥐의 신장에서 CT 조영제 강도는 시간이 지남에 따라 분명히 감소했습니다( 그림 4e). 주사 후 24시간 후, 방광 기관의 CT 영상은 완전히 명확하여 AuNS@PEG 나노입자의 우수한 신장 제거 특성을 보여줍니다(그림 4f). 최적의 입자 크기와 표면 기능화로 인해 순환 중 혈액에서 AuNS@PEG 나노 입자가 제거되는 속도는 매우 느릴 수 있습니다. 따라서, 이러한 결과는 준비된 AuNS@PEG 나노입자가 생체내 실시간 CT 이미징을 제공하는 독특하고 유망한 나노프로브가 될 수 있음을 나타냅니다. 이는 병원에서 환자에게 조영제를 투여할 수 있기 때문에 향후 임상 적용에 유용합니다.

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주사 전 쥐의 CT 이미지(a ) 및 다른 시점(0.5, 1, 2, 6, 24시간)(b –f ) AuNS@PEG 나노입자(200ppm)의 정맥 주사 후

H&E 염색

마우스 장기의 조직학적 변화는 AuNS@PEG 나노입자 주입 후 24시간 후에 수행되었으며, 그 결과를 Fig. 5에 나타내었다. 그리고 가장 중요한 것은 이들 기관에 잔류 AuNS@PEG 나노입자가 남아 있지 않다는 것입니다. 위의 결과를 바탕으로 AuNS@PEG 나노입자는 생체 적합성이 우수하고 생체 내 독성이 뚜렷하지 않아 생물학 응용 ​​분야의 새로운 CT 영상 조영제로 유망합니다.

<그림>

H&E로 염색된 조직 섹션:a 심장, b 간, c 비장, d 폐, 신장 및 f 장. 눈금 막대는 100mm를 나타냅니다.

AuNS@PEG 나노입자의 신장 기능 연구

AuNS@PEG 나노 입자의 생체 내 독성을 추가로 평가하기 위해 BUN, Crea, β₂의 매개변수 -MG 및 CO₂ 신장 기능 연구를 위해 측정되었습니다. 혈청을 분석했습니다. 이 값은 쥐의 신장 기능이 좋은지 아닌지를 평가할 수 있습니다. BUN 값은 쥐의 비뇨기 기능을 평가할 수 있습니다. Crea의 변화하는 가치는 쥐의 몸에 생기는 다양한 질병을 나타냅니다. β₂ -MG 농도는 주로 신세뇨관 기능과 관련이 있습니다. 그리고 CO₂의 값 세뇨관의 산성화 기능을 평가할 수 있습니다. 쥐에게 200ppm 농도의 AuNS@PEG 나노입자를 제공했습니다. 이러한 결과의 수준은 주사 후 24시간 후에 조사되었으며, AuNS@PEG 나노입자를 쥐에 주사하기 전과 후 사이에 차이가 없었습니다(표 1).

결론

요약하면, 우리는 CT 이미징에 응용하기 위해 손쉬운 AuNS@PEG 나노입자를 개발했습니다. 형성된 AuNS@PEG 나노입자는 주어진 농도 범위에서 초소형 크기, 낮은 독성, 우수한 수분산성, 혈액적합성 및 세포적합성을 갖는다. CT 값은 AuNS@PEG 나노 입자가 좋은 밝은 영상을 가지고 있음을 보여줍니다. 시험관내 영상화 결과는 AuNS@PEG 나노입자가 생체내 쥐 신장의 CT 영상화에 의해 입증된 CT 영상화 응용을 위한 새로운 조영제로서 강력한 X선 감쇠 특성을 가지고 있음을 나타냅니다. 또한, 생물학적 연구의 분포와 생체 내 독성 연구는 AuNS@PEG 나노 입자가 대사될 수 있고 높은 생물학적 적합성을 가질 수 있음을 보여줍니다. 따라서 AuNS@PEG 나노입자는 의학적 응용을 위한 유망한 후보가 될 수 있습니다.

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