동결 건조 단상 용액 방법을 ​​사용한 글리시레틴산 리포솜의 제조:사전 제형화, 최적화 및 시험관 평가

결과 및 토론

예비 공식 연구

용해성 연구

리포솜은 동결건조 단상 용액법을 사용하여 제조되기 때문에, 약물 및 담체 물질이 동결건조 전에 TBA/물 용액에 용해될 수 있는지 확인하기 위해 용해도 연구를 수행했습니다.

그림 1은 부피 백분율이 다른 TBA/물 공용매 시스템에서 GA의 포화 용해도 변화를 보여줍니다. 25°C ~ 45°C 내에서 GA의 포화 용해도는 TBA 부피 백분율이 10%에서 60%로 증가함에 따라 지속적으로 증가했으며 TBA 부피 백분율이> 40%일 때 GA의 포화 용해도는> 0.5mg/ml였습니다. 반면에, GA의 포화 용해도는 동일한 부피 백분율을 유지했을 때 TBA/물 용액의 온도가 증가함에 따라 증가했습니다. 상이한 온도에서 용해도의 차이는 TBA의 부피 백분율이 30%에 도달했을 때 점점 더 분명해졌습니다. TBA/물 공용매 시스템에서 대두 인지질 및 콜레스테롤의 용해도는 누적 기둥 그래프에 표시됩니다(그림 2). 그림 2a, b는 인지질과 콜레스테롤 단위(1mg)가 각기 다른 온도에서 포화 용해도에 도달하는 데 필요한 TBA/물 혼합물의 부피를 나타냅니다. 회색 영역은 물의 부피를 나타내고 검은색 영역은 TBA의 부피를 나타냅니다. 온도가 25°C에서 45°C로 점차 증가함에 따라 TBA/물 공용매의 총 부피와 1mg의 인지질을 용해하는 데 필요한 TBA의 부피 백분율(칼럼에 표시)이 점차 감소했습니다(그림 2a). 온도가 35°C 이상으로 증가함에 따라 필요한 TBA의 부피가 크게 감소하여 0.15ml 미만이었습니다. 마찬가지로 온도가 25°C에서 45°C로 점차 증가함에 따라 콜레스테롤 1mg을 용해하는 데 필요한 TBA 부피가 감소한 반면 TBA 부피 백분율은 점차 감소하는 경향을 보였습니다. 위의 결과는 온도와 TBA 부피 백분율이 인지질, 콜레스테롤 및 GA의 용해도에 큰 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다.

다양한 부피 백분율(mean ± SD, n)을 갖는 TBA/물 공용매에서 GA의 포화 용해도 =3)

SPC의 용해도(a ) 및 콜레스테롤(b ) 다른 부피 백분율을 갖는 TBA/물 공용매 중

부피 비율이 다른 TBA/물 공용매 시스템의 승화율 비교

승화 속도는 동결 건조 분말의 생산 효율에 직접적인 영향을 미칩니다. 승화 속도가 빠를수록 경제적이며 재료의 붕괴를 방지할 수 있습니다[16]. 이 연구에서 우리는 TBA/물 시스템의 다양한 농도의 승화율을 조사했습니다. Fig. 3에서 보는 바와 같이 TBA의 부피%가 10%에서 90%로 증가함에 따라 혼합용매의 승화율은 점차 증가하였다. 또한, 부피 백분율이 60%를 초과함에 따라 승화 속도가 10μl/min 이상에 도달했습니다.

다른 부피 백분율을 갖는 TBA/물 공용매의 승화율(mean ± SD, n =3)

부피 백분율에 따른 TBA의 승화율 차이의 원인을 확인하기 위해 먼저 냉동 샘플의 표면 형태를 조사했습니다. 그림 4는 40%~80% 부피 비율의 TBA/물 용액의 광학 현미경 이미지를 포함합니다(<30% 부피 비율의 TBA는 광학 현미경으로 빠르게 녹기 때문에 검사할 수 없음). 40% 체적%의 TBA와 비교하여> 50% 체적의 TBA는 투명하고 흩어져 있는 바늘 모양의 구조를 가지고 있습니다. TBA의 부피 백분율이 증가할수록 침상 결정의 직경이 작아지고 비표면적이 증가하여 승화율이 증가하는 것으로 추측됩니다.

광학현미경(× 100배율)에 의한 다양한 TBA 부피 백분율의 TBA/물 공용매의 표면 형태. 아 40%. ㄴ 50%. ㄷ 60%. d 70%. 이 80%

또한 25°C에서 다른 부피 백분율로 TBA/물 공용매 시스템의 포화 증기압도 측정했습니다. 그림 5는 TBA 부피 백분율이 다른 TBA/물 공용매 시스템의 포화 증기압 변화에 대한 막대 그래프입니다. 그림에서 보는 바와 같이 혼합용매의 포화증기압은 TBA의 부피비율이 증가할수록 점차 증가하는 경향이 있다. 온도는 포화 증기압과 양의 상관 관계가 있으므로 Antoine 방정식(Eq. 2)에 따라 동결 건조 온도(− 50 °C)에서 공용매 시스템의 포화 증기압이 부피 백분율로 증가할 것이라고 추론할 수 있습니다. 의 TBA가 증가하고, 이것이 승화율이 점진적으로 증가하는 이유 중 하나일 수 있습니다.

여기서 p 는 증기압, T 온도, A 그리고 B 구성 요소별 상수입니다.

다른 부피 백분율을 갖는 TBA/물 공용매의 포화 증기압(mean ± SD, n =3)

용적 비율이 다른 TBA/물 공용매 시스템에서 GA의 물리적 및 화학적 특성에 대한 동결건조 효과

TBA/물 공용매 시스템에서 동결건조가 GA의 물리화학적 특성에 미치는 영향을 조사하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. GA 10mg을 TBA 부피 백분율(40%, 50%, 60%, 70%, 80%)이 다른 8ml TBA/물 공용매에 용해했습니다. 단상 용액을 0.22μm 기공을 통해 여과하여 멸균한 후, 이를 2.0ml의 충전 부피로 10ml 동결 건조 바이알에 채웠습니다. 동결 건조기를 사용하여 - 50°C에서 24시간 동안 동결 건조를 수행했습니다.

TBA 부피 백분율이 다른 TBA/물 공용매 시스템에 GA를 용해한 후 동결건조된 분말의 DSC 스펙트럼은 그림 6a에 나와 있습니다. 원료의약품의 DSC 곡선은 GA의 융점인 301°C에서 명백한 흡열 피크를 보여줍니다. TBA 부피 백분율이 다른 TBA/물 공용매 시스템의 동결건조로 인해 GA 용융 피크가 앞으로 이동했습니다. 용융 피크 이동의 크기는 TBA 부피 백분율이 감소함에 따라 증가했습니다.

DSC(a ), XRD(b ) 및 FTIR(c ) 상이한 부피 백분율을 갖는 TBA/물 공용매에서의 동결건조 후 GA; (a) GA, (b) 40% 미정, (c ) 50% 미정, (d) 60% 미정, (e) 70% 미정, (f) 80% 미정

이전 연구에서는 TBA의 농도가 결정질, 비정질 또는 준안정상의 복잡한 혼합물 형성에 깊은 영향을 미칠 수 있음을 이미 보여주었습니다[28]. 경우에 따라 TBA를 사용하면 결정도가 저하될 수 있으며 반대의 경우도 있습니다[29].

TBA 부피 백분율이 다른 TBA/물 공용매 시스템에 GA를 용해한 후 동결건조된 분말의 X선 회절(XRD) 스펙트럼이 그림 6b에 나와 있습니다. 원료 약물의 XRD 스펙트럼은 5°와 20° 사이에서 몇 가지 뚜렷한 결정 회절 피크를 보여줍니다. TBA 부피 백분율이 다른 TBA/물 공용매 시스템의 동결건조로 인해 샘플의 XRD 스펙트럼에서 5°~20°에서 회절 피크가 사라졌습니다. 이것은 원래의 약물 결정이 무정형이 되었음을 나타냅니다.

TBA 부피 백분율이 다른 TBA/물 공용매 시스템에 GA를 용해한 후 동결건조된 분말의 FTIR 스펙트럼은 그림 6c에 나와 있습니다. 원료 의약품의 FTIR 스펙트럼 모양은 4000–400cm ⁻¹ 내에서 TBA 부피 백분율이 다른 TBA/물 공용매 시스템의 동결건조 분말과 일치합니다. 범위. 새로운 작용기에 대한 특징적인 피크의 출현은 없었으며, 이는 GA의 화학 구조가 TBA에서 다른 부피 백분율로 동결건조 후에도 동일하게 유지되었음을 보여줍니다.

결정질에서 무정형으로의 변화는 약물 용해도를 변화시켜 수화된 재건 동안 프로리포솜 캡슐화에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 연구에서는 25°C에서 동결건조된 GA 분말의 수용해도를 측정했습니다. TBA 부피 백분율이 40%에서 80%로 증가함에 따라 물에서 동결건조된 GA의 포화 용해도가 64.10에서 19.27μg/ml로 점진적으로 감소한다는 것을 발견했습니다. 그러나 여전히 원료의약품의 물에 대한 용해도(6.36μg/ml)보다 훨씬 높았으며, 이는 동결건조 중 결정질 구조에서 무정형 구조로의 변화가 원료의약품의 용해도에 영향을 미친다는 것을 의미합니다(그림 7). <그림>

다른 부피 백분율(mean ± SD, n)로 TBA/물 공용매에서 GA 동결건조의 수용성 =3)

단일 요인 실험

리포솜의 품질에 영향을 줄 수 있는 많은 요인이 있습니다. 인지질/약물 비율이 약물의 캡슐화 품질에 영향을 미친다는 것은 잘 알려져 있습니다[30]. 적당한 양의 콜레스테롤은 지질막의 정렬된 배열과 안정성을 증가시킬 수 있습니다. However, high content of cholesterol in the liposome can decrease the flexibility of membrane and thereby hinder the penetration of drug into the lipid bilayer [31]. In this study, we selected three factors that impact on liposome quality and performed a single-factor study to determine the appropriate values for subsequent optimization tests, including quantity of SPC, quantity of cholesterol, and volume percentage of TBA in the co-solvent. The quality of liposomes was evaluated in terms of encapsulation efficiency and mean diameter. Each experiment was performed in triplicate with all other parameters set to constant value, GA 60 mg, pre-freeze temperature − 40 °C, pre-freeze time 12 h. In this study, we compared the results via a scoring system, giving equal weight to both encapsulation rate and mean diameter. Scoring was conducted as follows:

where EE is encapsulation efficiency, MEE is maximum encapsulation efficiency of the group, MD is mean diameter, and MMD is maximum mean diameter of the group.

The experimental design and result are shown in Table 1. As can be seen in the table, within the range tested in this experiment, the highest score can be obtained separately when the amount of SPC is 480 mg (drug-SPC ratio of 1:8, w /와 ), the amount of cholesterol is120 mg (cholesterol-SPC ratio of 1:4, w /와 ), and volume percentage of TBA in the co-solvent is 50%. Therefore, these parameters were chosen as the center level of response surface optimization design, respectively.

Parameter Optimization by Box-Benhnken Design

To further study the interactions between the various factors, parameter optimization was performed by Box-Benhnken design. Based on the results of single-factor experiments, we investigated and optimized the interactions between the parameters, including quantity of SPC (X ₁ ), quantity of cholesterol (X ₂ ), volume percentage of TBA (X ₃ ) by Box-Benhnken design (BBD). Encapsulation efficiency (Y ₁ ) and mean diameter (Y ₂ ) were selected as responses. Optimization process was undertaken with desirability function to optimize the two responses simultaneously. We suppose that Y ₁ and Y ₂ have the same weightiness (importance). Y ₁ had to be maximized, while Y ₂ had to be minimized. The desirable ranges are from 0 to 1 (least to most desirable). Experimental design and results are shown in Table 2. To find the most important effects and interactions, analysis of variance (ANOVA) was calculated by statistical software, Design Expert trial version 8.03 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, USA). Two quadratic models were selected as suitable statistical model for optimization for two responses encapsulation efficiency and mean diameter. The results of ANOVA relating encapsulation efficiency as response were shown in Table 3, indicating that the model was significant for all factors investigated with F value of 12.81 (P <0.05). In this case, X ₁ , X ₂ , X ₁ X ₂ , X ₁ X ₁ , X ₂ X ₂ were significant model terms (P  < 0.05), demonstrating that the influences of the factors (X ₁ and X ₂ ) on encapsulation efficiency were not simply linear. The interaction terms were notably significant, indicating good interactions between the factors. On the contrary, the ANOVA results relating mean diameter as response (Table 3) indicated that the model was not significant for all factors investigated with F value of 1.9 (P> 0.05). In this case, X ₃ were significant model terms (P  < 0.05), demonstrating that volume percentage of TBA have significant influence on mean diameter, while quantity of SPC (X ₁ ) and quantity of cholesterol (X ₂ ) do not have a significant effect (P> 0.05). Moreover, there were no significant interactions between the three variables.

In order to provide a better visualization of the effect of the independent variables on the two responses and desirability value, three-dimensional profiles of multiple non-linear regression models are depicted in Fig. 8. Figure 8a–f presented the interaction of X ₁ , X ₂ , and X ₃ under encapsulation efficiency and mean diameter as response respectively. The three-dimensional profiles demonstrated how three pairs of parameters affect the encapsulation efficiency and mean diameter of reconstituted liposomes. For encapsulation efficiency, all the three surfaces are upper convex (Fig. 8a–c), with a maximum point in the center of the experimental domain, which demonstrated that there are good interactions between the three variables. For mean diameter, the shape of Fig. 8d is similar to flat surface, indicating that X ₁ and X ₂ have less effect on mean diameter. The surface contours of Fig. 8e, f both showed a slope; the mean diameter was decreased by increasing the volume percentage of TBA, indicating that factor X ₃ had an obvious effect on mean diameter but there was no obvious interaction between X ₃ and the other two factors.

Three dimensional plots of the effect of X X (a ), X X (b ) and X X (c ) on encapsulation efficiency and the effect of X X (d), X X (e) and X X (f) on mean diameter

Based on the quadratic model, the optimal conditions for liposomes preparation calculated by software were as follows:508 mg phospholipid quantity, 151 mg cholesterol quantity, and 55% volume percentage of TBA. Under these conditions, the encapsulation efficiency and mean diameter were found to be 68.55% and 220 nm, respectively.

Selection of the Type and Dosage of Lyoprotectant

Competition for liquid water between the growing ice crystals and the hydrophilic substances (including the hydrophilic portion of the lipid membrane) during freezing leads to adhesion of ice crystals to the phospholipid groups. This can result in damage to the lipid membrane. Lipid membrane fusion following rehydration causes an increase in particle size and leakage of encapsulated drug. Lyoprotectant can reduce liposomal damage during the freeze-thaw process [32]. In this study, we investigated the effect of various types (lactose, sucrose, trehalose, mannitol) and dosage (lyoprotectant to SPC ratio was 1:2, 1:1, 2:1, 4:1, and 6:1 w /와 ) of lyoprotectant on scores of reconstituted liposome. Single-factor experiments were performed while maintaining all other variables constant:GA amount of 60 mg, SPC amount of 508 mg, cholesterol amount of 151 mg, volume percentage of TBA in the co-solvent of 55%, pre-freeze temperature of − 40 °C, pre-freeze time of 12 h. Experimental results are shown in Fig. 9. The encapsulation efficiency increases firstly and then decreases by decreasing lyoprotectant/SPC weight ratio from 1:2 to 1:6, wherein lactose, sucrose, and mannitol are respectively used as lyoprotectant. However, the encapsulation efficiency of the trehalose group increases constantly with decreasing lyoprotectant/SPC weight ratio (Fig. 9a). In terms of the mean diameter (Fig. 9b), it was found that the mean diameter was greater than 218 nm for lactose, sucrose, and mannitol group in the range from 1:2 to1:6. Nevertheless, the mean diameter of trehalose group can be reduced to less than 190 nm when lyoprotectant/SPC weight ratio is more than 4:1; obviously, the protective effect of trehalose is better than other lyoprotectants tested. Trehalose has a good protection ability for membrane, perhaps because of the formation of hydrogen bonds with the polar head groups of lipids, and disruption of the tetrahedral hydrogen bond network of water [33]. According to scores (Fig. 9c), the highest score (0.24) was obtained when trehalose/SPC weight ratio is 4:1 and 6:1. Finally, we choose trehalose and 4:1 (trehalose/SPC weight ratio) for following experiments from the perspective of cost and increasing drug loading.

The effect of mass ratio between cryoprotectant and SPC on encapsulation efficiency (a ), mean diameter (b ) and scores (c ) of reconstituted liposomes (mean  ±  SD, n =3)

Through the above Box-Benhnken design and lyoprotectant screening experiment, the experimental conditions were determinated:GA amount of 60 mg, SPC amount of 508 mg, cholesterol amount of 151 mg, volume percentage of TBA in the co-solvent of 55%, weight ratio of trehalose to SPC was 4:1. Under these conditions, the encapsulation efficiency and mean diameter were 74.87% and 191 nm, respectively.

Transmission Electron Microscopy

In this study, TEM of liposomes suspension was taken at the same time point (same hydration time). We have observed different states in the sample, which could explain the self-assembly behavior of the liposomes. Figure 10a shows the initial state of hydration; it can be seen that a large amount of GA (black dots) is wrapped in dispersed phospholipids (translucent material), and spontaneous aggregation of the phospholipid fragments occurs. Figure 10b shows the morphology of fully assembled liposomes (average diameter of about 200 nm), which were nearly spherical with a phospholipid bilayer structure (the light-gray portion). Moreover, the drug particles (dark gray dots) were entrapped in the lipid bilayer.

Transmission electron micrographs of reconstituted liposomes, (a ) initial state of hydration of proliposomes, (b ) fully assembled liposomes

Stability of GA Proliposome

After 6 months, the proliposome powders have a good mobility and an unaltered appearance. The liposome suspension formed automatically when in contact with purified water. The entrapment efficiency and particle size of the reconstituted liposome were 72.82% and 198 nm. There is no significant difference from the data of the reconstituted liposome 6 months before. Therefore, the GA proliposome could be considered stable at 25 °C for over 6 months.

In Vitro Drug Release Studies

Evaluation of in vitro drug release from encapsulated liposome was done by dialysis method. The in vitro release profiles of GA from GA-loaded liposomes at 37 °C in PBS (pH 7.4) and physiological saline solution are shown in Fig. 11. The release profile of both group showed a fast release (the larger slope) within 1 h, then curve slope becomes smaller after 1 h, the release rate begins to slow down. The drug-release curve shapes of physiological saline solution group are similar to PBS group. The in vitro release of GA from the GA-loaded liposomes was 65.25 ± 4.82% and 69.46 ± 4.32% from PBS and physiological saline solution in 12 h. No significant difference (P  = 0.088, paired t test, SPSS software17.0) was found for the release of GA at different release medium over the entire study period, which demonstrated that the reconstituted liposomes have both sustained-release performance in two kinds of release medium.

In vitro dissolution profiles of GA from GA-loaded liposomes in a PBS and b physiological saline solution (mean ± SD, n =3)

In Vitro Cell Uptake

Figure 12a showed that the uptake process of GA-liposomes by Hep G2 cells is time-dependent under the experimental concentrations. After incubation for 30 min, the uptake amounts of drug-loaded liposomes (unit mass protein) by Hep G2 cells were 1480 ng. In the range from 30 to 240 min, the uptake amounts of drug-loaded liposomes (unit mass protein) were gradually increased from 1480 to 2030 ng. Figure 12b–e showed fluorescence microscopy images of Hep G2 cells at 30, 60, 120, and 240 min after ingestion of drug-loaded liposomes, and it is observed that the fluorescence intensity is also gradually increased over time. This result indicates that the reconstituted liposomes prepared by monophase solution method can be effectively uptaken by the hepatoma cells.

In vitro cellular uptake of GA-loaded liposomes by Hep G2 cells. 아 The uptake amount versus incubation time. ㄴ –이 Fluorescence microscopy images at 30, 60, 120, and 240 min