광열 유발 종양 화학 요법을 위한 미토콘드리아 표적 및 레스베라트롤 탑재 이중 기능 이황화 티타늄 나노시트

초록

항암제의 세포내 소기관 표적 전달은 항암 효과를 최대화하고 부작용을 최소화하는 유망한 전략입니다. 여기에서 우리는 IR780 iodide(IR780)와 이황화티타늄(TiS₂) 기반의 미토콘드리아 표적 약물 전달 나노 플랫폼을 준비했습니다. ) 나노시트. TiS₂의 큰 비표면적 때문에 나노시트에서 나노플랫폼은 항암제 레스베라트롤(RV)을 많이 로드할 수 있습니다. 준비된 나노복합체(IR780-TiS₂ /RV)는 효과적인 광열 유발 종양 화학 요법에 사용되었습니다. IR780-TiS₂ /RV는 만족스러운 안정성과 생체적합성을 보였고, RV와 IR780의 loading 비율은 각각 약 112%와 56%였다. 근적외선(NIR) 조사 시 IR780-TiS₂에서 발생하는 열 /RV는 RV 릴리스를 트리거할 수 있습니다. 미토콘드리아 특이적 IR780, IR780-TiS₂와의 접합으로 인해 /RV는 미토콘드리아를 표적으로 삼고 축적할 수 있고 NIR에 의해 촉발될 때 RV를 방출하여 미토콘드리아 막 전위를 감소시키고, 시토크롬 c와 같은 주요 내재적 세포자멸 인자의 상향 조절을 빠르게 유도하고, 카스파제 캐스케이드를 개시하여 화학요법 효과를 달성할 수 있습니다. IR780-TiS₂ /RV 나노복합체는 시험관내 및 생체내에서 높은 항종양 효능을 갖고 있을 뿐만 아니라 현저한 조직 독성이 없는 것으로 입증되었습니다. 우리의 연구는 NIR 트리거 IR780-TiS₂ /RV 나노플랫폼은 임상에서 유망한 화학요법제가 될 수 있습니다.

소개

암은 여전히 생명을 위협하는 질병으로 전 세계적으로 높은 사망률을 차지합니다[1]. 수술, 화학 요법, 방사선 및 호르몬 요법은 여전히 임상 실습에서 사용되는 주요 치료 방법입니다 [2, 3]. 이들 방법 중 화학요법은 비교적 높은 효능 때문에 임상의와 환자 모두에게 널리 받아들여지는 치료 옵션이다[4, 5]. 화학 요법은 약물 내성, 종양 재발 및 비특이성과 같은 몇 가지 심각한 문제와 관련이 있습니다[5,6,7]. 따라서 이러한 장애를 극복하기 위한 새로운 화학요법제 및 전략의 개발이 매우 시급하다[8]. 최근에는 표적 전달과 약물의 조절 방출을 동시에 달성할 수 있는 기능화된 담체에 항암제를 로딩하는 것이 치료 효과를 극대화하고 부작용을 줄이기 위한 보편적인 접근 방식이 되었습니다[9,10,11]. . 우수한 약물 담체를 위해서는 더 나은 약물 로딩 비율을 제공할 수 있는 넓은 비영역이 필수적입니다[12].

또한, 약물의 특이성을 향상시키기 위해 일반적으로 세포 표면 수용체를 표적으로 하는 엽산 및 글루타티온과 같은 세포 표적 분자로 운반체를 변형시킨다[13,14,15,16,17]. 많은 화학 요법 약물이 특정 세포 소기관에 작용하기 때문에 세포 소기관 특이적 전달 시스템을 설계하면 치료 효과를 크게 높이고 부작용을 줄일 수 있습니다[18,19,20]. 결과적으로, 종양 세포 내부의 표적 위치 선택은 약물 전달 시스템에 매우 중요합니다. 미토콘드리아는 세포의 "에너지 공장"일 뿐만 아니라 미토콘드리아를 표적으로 하여 내재적 세포자멸사 경로를 시작하는 화학요법 약물의 주요 표적이기도 합니다[21,22,23]. 따라서 미토콘드리아를 표적으로 하는 항암제 전달 시스템을 개발하는 것은 보다 효과적인 암 화학요법에 필수적일 수 있습니다. 지금까지 메조포러스 실리카, 탄소 기반 물질, 단백질 등 다양한 종류의 약물 전달 시스템이 설계되었습니다[17, 24, 25, 26]. 이러한 운반체가 약물 전달 및 종양 치료에 효율적인 것으로 보고되었지만 보다 새로운 고효율 약물 전달 시스템이 여전히 많이 요구되고 있습니다.

이 연구에서 우리는 2차원 이황화티타늄(TiS₂ ) 제어되고 표적화된 종양 화학요법을 위한 나노시트. TiS₂ 큰 비 영역을 갖는 전이 금속 디칼코게나이드의 구성원이다[27,28,29]. 단백질 보조 초음파에 의한 박리 후 TiS₂의 표면 나노시트는 공유 또는 비공유 상호작용을 통해 다른 기능 분자에 의해 수정될 수 있습니다. 또한, 종양 미토콘드리아 특이적 분자 IR780(IR-780 요오드화물)이 TiS₂를 변형하도록 선택되었습니다. 나노시트. IR780은 유기 음이온 수송 폴리펩타이드 매개 능동 수송과 친유성 양이온 특징을 통해 미토콘드리아 표적화 능력을 나노시트에 부여합니다[30, 31]. 친유성 양이온인 IR780은 정상 세포보다 종양 세포의 미토콘드리아 막 전위가 크기 때문에 종양 세포의 미토콘드리아에 더 많이 축적되는 것으로 보고되었다[32, 33]. 또한 IR780은 근적외선 반응형 광열 작용제이기도 합니다. IR780-TiS₂라고 하는 준비된 나노 플랫폼 , 생체 적합성 확인 및 항암제 레스베라트롤(RV)(IR780-TiS₂) /RV) [24]. IR780-TiS₂ /RV는 미토콘드리아 표적화 능력과 광열 효과를 가지고 있습니다. 근적외선 조사 시 국소 약물 방출을 유발하기 위해 외부 자극으로 근적외선을 적용했습니다. 시험관 내 및 생체 내 실험에서 IR780-TiS₂ /RV는 매우 효율적인 화학 요법 효과가 있습니다. 메커니즘에 대한 추가 연구는 IR780-TiS₂에 의해 유도된 세포 사멸이 밝혀졌습니다. /RV는 미토콘드리아 매개 고유 세포자멸사 경로를 통해 이루어졌습니다. 이 미토콘드리아 표적 약물 전달 시스템(도식 1)은 향후 임상 적용에서 잠재적인 화학요법제가 될 수 있습니다.

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IR780-TiS₂의 준비 개략도 /RV는 내재적 세포자멸사 경로에 의해 매개되는 종양 화학요법을 위한 NIR 유발 약물 전달 시스템으로 사용되었습니다.

자료 및 방법

자료

Sigma-Aldrich는 IR-780 요오드화물(IR780), TiS₂ 제공 분말, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)(미국 미주리주 세인트루이스). 소 혈청 알부민(BSA ≥ 98.0%)은 BioSharp Co., Ltd.(한국)에서 구입했습니다. Cell Counting Kit-8(CCK-8)은 Dojin Chemical Laboratory Co., Ltd.(Kumamoto, Japan)에서 구입했습니다. DMEM 배지 및 태아 소 혈청(FBS)을 포함한 세포 배양 시약은 Gibco(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에서 제공했습니다. 화학 물질은 Sigma-Aldrich(중국 상하이)에서 구입했습니다.

IR780-TiS의 합성₂ /RV

첫 번째 단계는 수용성 TiS₂의 준비였습니다. 이전 보고서[34]에 따른 나노시트. 자세히, 5 mg 벌크 TiS₂ 5 mL 물과 혼합하고 20분 동안 교반하였다. TiS₂ 그런 다음 물 현탁액을 5 mg BSA에 첨가하고 6 시간 동안 500 W 및 20 kHz 팁 초음파 처리(Sonics, VCX130, USA)를 사용하여 해리된 얼음 수조 초음파 하에서 처리했습니다. 그 후, 준비된 혼합물을 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 TiS₂를 생성했습니다. 상층액의 나노시트.

둘째, TiS₂ 나노시트는 IR780과 접합되었습니다. 트리에틸아민(TEA)은 산 결합제로 적용되었습니다. 5mg의 IR780을 2mL DMSO에 용해시키고 TEA를 첨가하면서 60℃에서 8시간 동안 교반하였다. 혼합물 현탁액을 증류수에서 2일 동안 투석한 후, 9000 rpm에서 8분 동안 원심분리하여 응집된 생성물을 제거하였다. 상층액을 수집하여 IR780-TiS₂를 생성했습니다. .

마침내 RV가 IR780-TiS₂에 로드되었습니다. . IR780-TiS₂ (1 mg/ml)을 RV(2 mg/ml, DMSO에 용해)와 혼합하고 실온에서 밤새 약간 교반했습니다. 그 후, DMSO 및 유리 RV를 증류수에서 밤새 투석을 통해 제거하여 IR780-TiS₂를 제공했습니다. /RV. 문헌에 따르면 UV-vis 분광광도계(UV-2550, Shimadzu, Japan)로 감지하고 다음 방정식에 따라 계산한 RV 로딩 비율:

$$ \mathrm{RV}\ \mathrm{로딩}\ \mathrm{ratio}\ \left(\%\right)=\frac{A_a-{A}_b}{A_c}\times 100\% $$

여기서 A _아 (mg), A _b (mg) 및 A _ㄷ (mg)는 초기의 바인딩되지 않은 RV 및 IR780-TiS₂를 나타냅니다. , 각각.

Bruker TENSOR 27 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR) 분광계(Bruker Optics Ltd., Coventry, UK)는 TiS₂의 화학 구조를 감지하는 데 사용되었습니다. , IR780-TiS₂ 및 R780-TiS₂ /RV. BET(Brunauer-Emmett-Teller) 분석을 수행하여 N₂에서 계산된 샘플의 비표면적을 결정했습니다. BET 방정식에 기초한 표면적 분석기(Quantachrome ChemBET-3000)를 통한 흡착 결과.

세포주 및 세포 배양

마우스 결장암 세포 CT26은 Chinese Academy of Sciences Cell Bank of Type Culture Collection(Shanghai, China)에서 입수했습니다. 세포를 5% CO2가 포함된 가습 인큐베이터에서 완전한 DMEM 배지(10% FBS + 90% DMEM)에서 배양했습니다. 37 °C에서.

IR780-TiS의 체외 현지화₂ /RV

FITC는 IR780-TiS₂ 라벨에 사용되었습니다. /RV 또는 TiS₂ /RV. 간단히 말해서, FITC를 에탄올 용액(2.0 mg/mL)에 용해시키고 IR780-TiS₂와 혼합했습니다. /RV 또는 TiS₂ /RV 수용액(1.0 mg/mL)을 실온의 어두운 환경에서 4시간 동안 교반합니다. 혼합물을 증류수에서 밤새 투석하여 중복된 FITC 및 에탄올을 제거하여 FITC로 표지된 IR780-TiS₂를 생성했습니다. /RV 또는 TiS₂ /RV 솔루션. 시험관 내에서 나노입자의 미토콘드리아 공동 국소화를 확인하기 위해 FITC로 표지된 IR780-TiS₂로 처리한 세포 /RV 또는 TiS₂ 5 h 동안 /RV 및 미토콘드리아 특정 염료 MitoTracker로 염색. 그 후, IR780-TiS₂의 세포 내재화 /RV 또는 TiS₂ /RV는 CLSM(Ix81-FV1000, Olympus, Co.)을 사용하여 관찰되었습니다. 간단히 말해서, CT26 세포는 FITC로 표지된 TiS₂와 함께 배양되었습니다. /RV 및 IR780-TiS₂ 5 h 동안 /RV(FITC의 동일한 농도 사용). 그런 다음, 세포를 MitoTracker Red FM 용액(100 nM)으로 37 °C에서 30분 동안 처리했습니다. PBS로 3회 세척한 후 CLSM으로 세포를 관찰하였다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 세포의 형광 강도를 분석했습니다.

체외 NIR 유발 종양 화학 요법 및 세포 사멸 연구

4 × 10³ 96웰 배양 플레이트의 세포/웰 CT26 세포를 유리 RV, IR780-TiS₂로 처리했습니다. , IR780-TiS₂ /RV 및 TiS₂ 5 h 동안 다른 RV 농도로 /RV를 조사한 다음 3분 동안 NIR을 조사하거나 조사하지 않았습니다(808 nm, 0.3 W/cm2 ). 추가 24시간 인큐베이션 후, 처리된 세포의 생존력을 CCK-8 분석에 의해 분석하였다. 처리된 세포도 Rhodamine123(Sigma)으로 염색하고 FCM(FC 500 MCL; Beckman Coulter, USA)으로 분석하였다. 이전에 설명한 대로 Annexin V-FITC/PI apoptosis detection kit(Bender MedSystems, Vienna, Austria)를 사용하여 FCM 분석을 통해 세포 사멸 검출을 수행했습니다.

서부 얼룩

CT26 세포는 PBS(대조군), RV, TiS₂로 처리되었습니다. /RV, IR780-TiS₂ /RV 및 IR780-TiS₂ /RV + NIR(동가 RV, 30 μg/mL, 등가 IR780, 0.5 μg/mL) 5시간 배양. 추가로 24시간 동안 배양한 후, 이전에 보고된 프로토콜을 기반으로 하는 웨스턴 블롯으로 세포를 각각 수집했습니다[23]. 간단히 말해서, 세포는 프로테아제와 Triton X-100에 의해 용해되고 억제되었습니다. 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 사용하여 단백질을 회수하고 분리한 다음 PVDF 멤브레인으로 이동하고 5% 무지방 우유를 사용하여 차단했습니다. 그 후, 희석된 1차 항체를 4 °C에서 12 시간 동안 배양했으며, 여기에는 시토크롬 c(1/1000, Boster, 무한, 중국), 절단된 카스파제-3(1/1000, CST), 절단된 카스파제-9(1/ 1000, CST) 및 액틴(1/1000, Mouse, Boster, Wuhan, China)을 처리한 다음 2차 항체와 함께 배양합니다. 마지막으로 ECL 시약을 사용하여 단백질을 검출했습니다.

동물 모델

CT26 피하 종양 모델을 설정하려면 1 × 10⁷ CT26 세포(100 μL, PBS 중)를 Balb/c 누드 마우스의 등에 피하 주사했습니다. 종양 부피 =길이 × 너비² /2. 모든 동물 절차는 국립 보건원의 실험 동물 관리 및 사용 지침에 따라 수행되었으며 Zhumadian 중앙 병원(중국 허난)의 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다.

체내 생체 내 분포

IR780-TiS₂의 생체분포 종양이 있는 누드 마우스에서 /RV는 IR780-TiS₂를 꼬리 정맥 주사 후 24시간째에 검출되었습니다. /RV(150 μL, 6 mg/kg). 심장, 간, 비장, 폐, 신장 및 종양을 포함한 주요 장기의 무게를 측정하고 왕수 용액으로 소화하였다. 이 조직의 Ti 원소 함량은 ICP-OES에 의해 정량화되었습니다.

체내 NIR 유발 종양 화학요법

CT26 종양 보유 마우스를 무작위로 6개 그룹으로 분리했습니다(n =6), 식염수, 식염수 +NIR, RV, IR780-TiS₂ 포함 /RV, TiS₂ /RV 및 IR780-TiS₂ /RV + NIR(RV 등가, 1 mg/kg, IR780 상당, 0.5 mg/kg). NIR 조사 조건은 808 nm, 0.3 W/cm² , 그리고 3 분. 치료 30일 동안 종양 부피와 마우스 무게를 3일마다 기록했습니다. 치료 후 다양한 그룹의 심장, 간, 비장, 폐, 신장을 포함한 장기를 고정하고 H&E로 염색하였다.

통계 분석

결과는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 학생의 t 테스트는 두 그룹 간의 유의한 차이를 조사하는 데 사용되었습니다. 피 <0.05는 유의미한 것으로 간주되었고 P <0.01은 매우 중요한 것으로 간주되었습니다.

결과 및 토론

IR780-TiS의 준비 및 특성화₂ /RV

IR780-TiS₂를 준비하려면 /RV, 첫째, 생체 적합성 TiS₂ 나노시트는 이전에 보고된 바와 같이 소 혈청 알부민(BSA) 및 초음파 보조 박리 방법을 통해 준비되었습니다[34, 35]. 다음으로 IR780-TiS₂ IR780의 염소 원자와 TiS₂에 흡수된 BSA의 아미노기 간의 치환 반응으로 합성되었습니다. 산 결합제 TEA를 사용한 나노시트. 마침내 IR780-TiS₂ 나노플랫폼은 물리적 흡수를 통해 항암제 RV를 탑재했다. IR780-TiS₂의 개략도 /RV는 계획 1에 표시됩니다. 추가 파일 1:그림 S1은 단백질 보조 박리 TiS₂의 TEM 이미지를 보여줍니다. , 표시된 나노시트 구조였다. TiS₂의 XRD 패턴 나노시트도 검출되었으며, 이는 준비된 TiS₂의 우수한 결정성을 나타냅니다. 나노시트, TEM의 관찰 결과와 일치합니다(추가 파일 1:그림 S2). 기능화 후 IR780-TiS₂ /RV 나노복합체는 투과전자현미경(그림 1a, b)에서 볼 수 있듯이 격자 간격이 0.25 nm이고 평균 직경이 약 123.6 nm이고 제타 전위가 - 37.2 mV인 플레이크 같은 형태를 Nanosizer(Malvern 기구)(그림 1c, d). 물, FBS 또는 식염수에서 2주 보관 후 IR780-TiS₂의 평균 크기 /RV는 IR780-TiS₂의 안정성을 나타내는 약 123 nm에서 일정하게 유지되었습니다(그림 1e). /RV, 아마도 TiS₂ 표면의 BSA 접착으로 인한 것일 수 있습니다. 나노시트. 그림 1f는 유리 IR780, 유리 RV, TiS₂의 흡광도 스펙트럼을 보여줍니다. 나노시트 및 IR780-TiS₂ /RV. IR780-TiS₂의 흡수 스펙트럼 /RV는 유리 IR780과 유리 RV의 피크를 보여 IR780과 RV가 모두 TiS₂와 성공적으로 접합되었음을 나타냅니다. 나노시트. IR780-TiS₂의 RV 로딩 비율 약 112%(W /와 ), 비공유 상호작용(예:π –π 스태킹 및 소수성 상호 작용). 또한 BET 결과에 따르면 표면적은 15.2 m² 로 계산되었습니다. /g 및 122.1 m² /g 대량 TiS₂ 및 TiS₂ 각각 나노시트. 박리된 TiS₂ 나노시트는 벌크 TiS₂보다 훨씬 더 높은 BET 표면적을 나타냅니다. , 약물 로딩을 위한 넓은 활성 영역을 제공합니다. 하중은 IR780-TiS₂의 큰 비표면적과 BSA 접착력으로 인해 높았을 가능성이 높습니다. 나노시트[23]. 추가로 RV 및 IR780이 TiS₂에 로드되었는지 확인하기 위해 나노시트, TiS₂의 FTIR 스펙트럼 나노시트, IR780-TiS₂ 및 IR780-TiS₂ /RV를 측정했습니다. 추가 파일 1:그림 S6에서 TiS₂의 모든 특성 피크 IR780-TiS₂의 FTIR 스펙트럼에서 나노시트가 나타났습니다. /RV. 또한 3개의 새로운 피크가 나타났습니다(~ 3191 cm⁻¹ , ~ 1510 cm⁻¹ , 1230 cm⁻¹ ) IR780-TiS₂ 스펙트럼에서 /RV, RV 및 IR780 [36, 37]의 존재를 나타냅니다.

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아 IR780-TiS₂의 TEM 이미지 /RV. ㄴ IR780-TiS₂의 고해상도 TEM 이미지 /RV. ㄷ 크기 분포 및 d IR780-TiS₂의 제타 전위 분포 /RV. 이 IR780-TiS₂의 유체역학적 입자 크기 변화 /RV in water, FBS, saline 2주 이상. 에 RV, IR780, TiS₂의 흡수 스펙트럼 나노시트 및 IR780-TiS₂ /RV

3분 동안 저전력 NIR 조사(808 nm, 0.3 W/cm² ), IR780-TiS₂ /RV 용액 온도는 IR780-TiS₂의 농도에 비례하여 증가했습니다. /RV(0, 5, 10 μg/ml) 및 10 μg/ml IR780-TiS₂ /RV 용액은 47.6 °C의 최고 온도에 도달했습니다(그림 2a). 또한 IR780-TiS₂ /RV는 5주기의 NIR 조사 후에도 초기 광열 효과를 유지한 반면, 유리 IR780은 감소된 광열 효과를 나타냈습니다(그림 2b). 이 결과는 IR780-TiS₂를 나타냅니다. /RV 나노복합체는 광안정성이 뛰어납니다.

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아 IR780-TiS₂의 광열 효과 NIR 조사에서 /RV(808 nm, 0.3 W/cm² ) 3분 동안 ㄴ IR780 및 R780-TiS₂의 온도 변화 NIR 조사(808 nm, 0.3 W/cm² )의 5회 주기 후 /RV , 3 분). ㄷ 광열 트리거 RV 방출의 개략도. d IR780-TiS₂에서 RV의 방출 역학 NIR 조사(808 nm, 0.3 W/cm² )가 있거나 없는 PBS 버퍼(pH =4 및 6.5)의 /RV ). **P <0.01, pH =7.4 및 pH =6.5 그룹과 비교

다음으로, 다양한 pH 및 NIR 조사 조건에서 RV 방출 비율을 측정했습니다(그림 2c, d). 24시간 후 RV 방출율은 생리적 조건(pH 7.4)에서 8.56%였으나 pH 6.5에서 16.2%로 크게 증가하여 약산성 조건에서도 RV 방출을 증가시킬 수 있음을 나타냅니다. 또한, RV 방출 비율은 pH 6.5 및 3분 NIR 조사(808 nm, 0.3 W/cm2 )에서 44.8%로 다시 크게 증가했습니다. ). 이러한 결과는 NIR 조사가 IR780-TiS₂에서 RV의 방출을 유발하는 제어 가능한 외부 자극이 될 수 있음을 보여줍니다. /RV. 이 효과는 IR780-TiS₂에서 발생하는 열 때문일 수 있습니다. NIR 조사에서 RV와 IR780-TiS₂ 사이의 비공유 흡착 상호 작용을 약화 표면 [35]. 또한 산성 환경에서 H+는 TiS₂의 표면 전하를 변경할 수 있습니다. 나노 입자의 친수성/소수성 균형을 변경하는 [38, 39].

IR780-TiS의 체외 현지화₂ /RV

IR780-TiS2/RV의 세포 흡수 및 세포 내 분포를 조사하기 위해 IR780-TiS₂ /RV 나노입자는 FITC로 표지되었고, CLSM은 세포내 형광을 가시화하는데 사용되었다. 5시간 배양 후 TiS₂ /RV 및 IR780-TiS₂ /RV는 세포질에서 유사한 형광 강도를 보여(그림 3a, b), 두 나노복합체가 세포내이입을 통해 세포에 들어갈 수 있음을 나타냅니다. 그러나 IR780-TiS₂ /RV 나노복합체는 FITC 신호가 MitoTracker 라벨링과 병합될 때 더 큰 강도의 황색 및 녹색 형광을 나타냈습니다(그림 3a, c). 이 결과는 IR780-TiS₂ /RV는 고효율로 미토콘드리아를 표적으로 삼을 수 있습니다. 또한 IR780-TiS₂ 배포 세포질 내의 /RV는 일부 미토콘드리아에 보유된 나노 입자를 나타내는 TEM을 사용하여 추가로 확인되었습니다(그림 3d). 함께 이러한 결과는 IR780-TiS₂가 /RV는 우수한 미토콘드리아 표적화를 달성하여 미토콘드리아 약물 축적을 더욱 촉진하여 즉각적인 세포 독성을 유발합니다. 미토콘드리아 표적화는 유기 음이온 수송 폴리펩타이드 매개 능동 수송 및 친유성 양이온 특징 모두에 의해 매개되었을 가능성이 있으며, 이는 나노입자를 종양 세포의 미토콘드리아에 고도로 축적하게 만들었다[30,31,32,33].

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아 FITC 라벨이 붙은 TiS₂와 함께 배양된 CT26 세포의 형광 이미지 /RV 또는 IR780-TiS₂ /RV 5 h. 녹색 형광은 FITC 신호이고 빨간색 형광은 MitoTracker 신호입니다. ㄴ FITC로 표지된 TiS₂의 해당 평균 형광 강도(MFI) 분석 /RV 또는 IR780-TiS₂ /RV는 그림 3a의 셀에 있습니다. ㄷ FITC 라벨이 붙은 TiS₂의 해당 co-localization 계수 /RV 또는 IR780-TiS₂ /RV 및 그림 3a의 세포 내 미토콘드리아. M은 미토콘드리아를 의미합니다. **피 <0.01, TiS₂와 비교 /RV 그룹 단독

체외 NIR 유발 종양 화학 요법

먼저, 광열 효과를 시험관 내에서 평가했습니다. 5시간 배양 후 IR780-TiS₂ /RV는 약 17 °C의 온도 상승을 보인 반면, TiS₂ /RV는 약 10 °C의 온도 상승을 나타냈습니다(그림 4a). 광열 효과는 IR780 및 TiS₂에 기인합니다. 나노시트. 약물 로딩을 위한 나노 플랫폼으로서 생체 적합성 입증, IR780-TiS₂ 300 μg/ml 농도 이하에서는 뚜렷한 세포독성을 나타내지 않았습니다(그림 4b). 또한 NIR 조사 유무에 관계없이 RV는 유사한 농도 의존적 세포 사멸 효과를 보였습니다(그림 4c). 동일한 RV 농도에서 RV는 IR780-TiS₂에 의해 로드될 때 최고의 세포 사멸 효과를 달성했습니다. 다른 모든 조건, 즉 유리 RV, 유리 IR780-TiS₂와 비교하여 NIR 조사 , TiS₂에 의해 로드된 RV (그림 4d). 흥미롭게도 언로드된 IR780-TiS₂ 플랫폼은 NIR 조사가 없는 것과 비교하여 NIR 조사에 노출되었을 때 현저한 항암 효과를 나타내지 않았으며(그림 4d), 이는 IR780-TiS₂에서 발생하는 열을 나타냅니다. NIR 조사 자극은 주로 약물 방출을 유발하여 세포를 죽이는 데 사용되었습니다. 이 결과는 IR780-TiS₂ /RV는 NIR 조사에 의해 촉발될 때 미토콘드리아에서 RV를 방출할 수 있으므로 미토콘드리아 내에서 RV의 국소 농도를 현저하게 향상시키고 더 큰 종양 억제 효과를 달성합니다.

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아 PBS(대조군), TiS₂의 온도 변화 곡선 /RV 또는 IR780-TiS₂ /RV 처리된 세포에서 3분 NIR 조사(808 nm, 0.3 W/cm² ) ). ㄴ 다양한 농도의 IR780-TiS₂로 처리된 CT26 세포에 대한 시험관내 세포독성 . ㄷ NIR 조사(808 nm, 0.3 W/cm² )가 있거나 없는 RV로 처리된 세포의 세포 생존율 ) 3 분 동안. d IR780-TiS₂로 처리된 세포의 세포 생존율 , RV, TiS₂ /RV 또는 IR780-TiS₂ /RV NIR 조사 유무(808 nm, 0.3 W/cm² ) ) 3 분 동안. **P <0.01, IR780-TiS₂와 비교 NIR 그룹이 없는 /RV 단독

세포 사멸 메커니즘

IR780-TiS₂의 NIR 유발 화학요법의 기본 메커니즘을 설명하기 위해 /RV, 우리는 세포 사멸 유형, 미토콘드리아 막 전위(Ψm) 및 주요 세포자살 관련 단백질의 발현 수준을 분석했습니다. 첫째, FCM은 Annexin V-FITC/PI 염색을 사용하여 세포 사멸 유형을 감지하는 데 사용되었습니다(그림 5a). 동일한 RV 농도에서 자유 RV, TiS₂ /RV, IR780-TiS₂ /RV 및 IR780-TiS₂ /RV + NIR은 주로 RV의 존재로 인해 모두 세포자멸사를 유도할 수 있습니다. 실제로, RV는 세포 사멸을 유도하는 능력이 있는 것으로 보고되었습니다. 이러한 처리 중 IR780-TiS₂ /RV + NIR은 90.8%로 가장 높은 세포사멸률을 보였다. 다음으로 Apoptosis 신호 전달 경로가 조사되었습니다. Ψm의 감소는 미토콘드리아(고유) 세포자멸 경로의 주요 사건으로 보고되었습니다[40]. 동일한 RV 농도에서 IR780-TiS₂ /RV + NIR은 Ψm을 약 85% 감소시켰으며, 이는 IR780-TiS₂에 의해 유도된 Ψm 감소보다 더 중요합니다. , TiS₂ NIR이 있거나 없는 /RV 및 무료 RV(그림 5b). 이 실험은 IR780-TiS₂ /RV + NIR은 미토콘드리아(고유) 세포사멸 경로를 통해 매개되는 세포 사멸을 유도합니다[41]. 다음으로, 세포 사멸에 중요한 단백질, 특히 시토크롬 c(사이토 c), 카스파제 9 및 카스파제 3의 발현을 웨스턴 블롯 분석을 통해 검출했습니다. IR780-TiS₂로 처리된 세포 /RV + NIR은 RV, IR780-TiS₂로 처리된 것보다 더 많은 세포질 세포 c를 발현했습니다. /RV 또는 IR780-TiS₂ /RV(그림 5c). cyto c의 전위는 caspase cascade의 가장 중요한 개시자이다[42,43,44]. 결과적으로 IR780-TiS₂에서 절단된 caspase 9와 cleaved caspase 3의 발현이 상당히 증가했습니다. /RV + NIR 처리된 세포. 종합하면, 이러한 데이터는 세포자멸사가 미토콘드리아(내인성) 경로에 의해 매개된다는 것을 분명히 시사합니다.

<그림>

아 PBS(대조군), RV, TiS₂로 처리된 CT26 세포의 세포 사멸 /RV, IR780-TiS₂ /RV 및 IR780-TiS₂ /RV + FCM에 의한 NIR. ㄴ PBS(대조군), RV, TiS₂로 처리한 CT26 세포의 미토콘드리아 막 전위 변화 /RV, IR780-TiS₂ /RV 및 IR780-TiS₂ FCM에 의한 NIR 조사 유무에 관계없이 /RV. ㄷ PBS(대조군), RV, TiS₂로 처리된 CT26 세포에서 세포사멸 관련 단백질의 발현 /RV, IR780-TiS₂ /RV 및 IR780-TiS₂ /RV + NIR. 시토크롬 c, 절단된 카스파제-3 및 절단된 카스파제-9를 웨스턴 블롯으로 테스트했습니다. **P <0.01, IR780-TiS₂와 비교 /RV, TiS₂ /RV + NIR 및 IR780-TiS₂ 그룹

생체 내 NIR 유발 종양 화학 요법

생체 내 NIR 유발 화학 요법의 효능을 평가하기 위해 CT26 종양 보유 마우스를 식염수, 식염수 + NIR, RV, IR780-TiS₂로 처리했습니다. /RV, TiS₂ /RV + NIR 및 IR780-TiS₂ /RV + NIR. IR780-TiS₂의 종양 크기 /RV + NIR군은 치료 30 일 후 유의하게 감소하였고 종양은 거의 소실된 반면, 나머지 군에서는 종양 부피가 증가하는 경향을 보였다(Fig. 6a). 치료 기간 동안 체중에는 그룹 간에 유의한 차이가 없었습니다(그림 6b). 마지막으로 H&E 영상은 모든 테스트 그룹에서 눈에 띄는 조직 독성이나 이상을 나타내지 않았습니다(그림 6c). 이 결과는 IR780-TiS₂ /RV 나노복합체는 NIR 유발 항종양 효능이 탁월하고 전신 독성이 낮습니다. 또한 IR780-TiS₂의 생체 분포 /RV는 생체 내에서 평가되었습니다. 추가 파일 1:그림 S4에서 볼 수 있듯이 나노 입자는 대부분 간 시스템으로 들어가고 시스템에서 대사될 수 있습니다[45].

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아 식염수(대조군), RV, TiS₂ 정맥 주사 후 CT26 이종이식 종양의 성장 프로필 /RV 및 IR780-TiS₂ /RV(3분 NIR 조사 포함 또는 제외)(808 nm, 0.3 W/cm² ) ). ㄴ 다양한 처리 후 종양 보유 마우스의 체중. ㄷ 처리 30일 후 처리된 모든 마우스의 주요 기관의 H&E 이미지. **P <0.01, 식염수, 식염수 + NIR, RV, TiS₂와 비교 /RV + NIR 및 IR780-TiS₂ /RV 그룹

결론

요약하면, 우리는 TiS₂ 기반의 미토콘드리아 표적 및 RV 탑재 나노플랫폼을 개발했습니다. nanosheets for a NIR-triggered drug release and enhanced tumor chemotherapy. The as-prepared IR780-TiS₂ /RV with flake-like morphology showed good stability and biocompatibility. Owing to the mitochondria-targeted ability of IR780, IR780-TiS₂ /RV could selectively accumulate in tumor cell mitochondria and where it could release RV when triggered by the NIR irradiation. The released RV facilitated the mitochondrial membrane potential decrease, cyto c release, and, subsequently, initiated a cascade of caspase reactions to promote tumor cell apoptosis through the mitochondrial signaling pathway. In vitro and in vivo results demonstrated that IR780-TiS₂ /RV exhibited an efficacious NIR-triggered tumor chemotherapy without a significant tissue toxicity. These results suggest that IR780-TiS₂ /RV could be a promising chemotherapeutic agent in clinical practice.