고함량 5-아미노레불린산-스쿠알렌 나노입자: 세포 모델에서 종양 광검출 및 치료 향상

초록

5-아미노레불린산(5-ALA) 투여 후 생성되는 내인성 광감작제 프로토포르피린 IX(PpIX)는 여러 악성 종양의 광진단(PD)과 광역학 치료(PDT)의 초석이다. 그러나 5-ALA의 양쪽성 이온 특성은 생물학적 장벽 투과를 제한해 전신적 임상 유용성을 저해한다. 여기서는 평균 직경 70 nm, 낮은 분산도 지수(0.12), +36 mV 제타 전위, 놀라운 26% 약물 적재량을 가진 나노어셈블리(NAs)로 자기조립되는 새로운 스쿠알레놀화 5-ALA(5-ALA-SQ)를 기술한다. 인간 전립선(PC3)과 교모세포종(U87MG) 세포주에서 5-ALA-SQ NAs는 상용 헥실 에스테르(5-ALA-Hex)와 유사하거나 더 높은 PpIX 형광을 유도했으며, 초기 시점(≤4 h)에서 우수한 성능을 보였다. 이 결과는 5-ALA-SQ NAs가 PD와 PDT 응용을 위한 5-ALA 전신 전달의 유망한 플랫폼임을 강조한다.

배경

나노기술은 치료제의 화학적 안정성, 약동학, 부위 특이적 전달을 향상시킬 수 있는 생체적합성, 생분해성 캐리어를 제공한다. 그러나 많은 나노입자(NP) 시스템은 낮은 약물 적재량(<5%)과 효능과 안전성을 해치는 버스트 방출 효과로 고통받는다. 천연 트리테르펜이자 콜레스테롤 전구체인 스쿠알렌은 "스쿠알레놀화" – 약물을 스쿠알렌과 공유 결합시켜 고함량, 안정적인 나노어셈블리(NAs)로 자발적 자기조립을 유도하는 다재다능한 골격으로 부상했다. 스쿠알레놀화 NAs는 젬시타빈, 파클리탁셀, 시스플라틴, 독소루비신 등 화학요법제에 성공적으로 사용되어 우수한 약리 활성을 보였으며, 일부 경우 테라노스틱 기능도 가능케 했다.

PpIX 전구체인 5-ALA는 이미 PD, PDT, 교모세포종 형광 유도 절제에 임상적으로 사용된다. 치료 창은 하전 구조로 인한 전신 흡수와 종양 축적 제한으로 제약된다. 5-ALA-Hex 같은 에스테르화 유도체가 생체이용률을 개선했지만, 사용은 여전히 국소적 또는 방광암 등 특정 암에 국한된다. 최근 연구들은 5-ALA를 폴리머 NAs, 리포좀, 덴드리머, 금 나노입자에 캡슐화하는 것을 탐구했으나, 임상적으로 실행 가능한 전신 제형으로 이어진 것은 없다.

우리의 목표는 높은 약물 적재량, 견고한 안정성, 효율적 종양 섭취를 가진 NAs로 자기조립되는 5-ALA-스쿠알렌 접합체를 설계해, 현재 적응증 고형암을 넘어 PD와 PDT에서 5-ALA의 임상 적용 범위를 확장하는 것이다.

결과 및 논의

5-ALA-SQ 빌딩 블록 합성

접합체는 4단계 수렴적 공정으로 조립되었다. Boc-보호 5-알라를 EDC/DMAP 매개 에스테르화로 하이드록실화 스쿠알렌 유도체와 결합시킨 후, 온화한 산 매개 탈보호와 역상 HPLC 최종 정제를 거쳤다. 전체 수율은 높았으며 생성물은 NMR과 질량분석으로 완전히 특성화되었다.

그림 2. 5-ALA-SQ 빌딩 블록 4단계 합성.

5-ALA-SQ 나노어셈블리 특성 분석

자기조립은 나노침강으로 유도했다: 접합체를 1:1 아세톤/에탄올 혼합물에 용해해 교반 하에 밀리-Q 물에 방울방울 주입한 후 용매를 제거했다. 동적 광산란(DLS)과 크라이오-TEM은 평균 수직경 70 nm, 분산도 지수 0.12의 단분산 입자를 나타냈다. +36 mV 제타 전위는 강한 콜로이드 안정성과 음전하 세포막과의 유리한 상호작용을 시사한다. 중요하게도 26% 약물 적재량은 일반적인 5-ALA 나노입자 제형(<5% 적재량) 대비 상당한 개선이다.

그림 3. (a) 5-ALA-SQ NAs 크라이오-TEM 이미지 및 (b) DLS 분석. (c) 4°C에서 수주간 입자 크기 안정성.

암세포 내 체외 PpIX 형광 동역학

PC3와 U87MG 세포를 다양한 농도의 5-ALA-SQ NAs 또는 상용 5-ALA-Hex와 배양했다. 플레이트 리더(405 nm 여기, 630 nm 방출)로 24시간 형광을 모니터링했다. 1.0-2.0 mM에서 5-ALA-SQ NAs는 PpIX 형광의 꾸준한 증가를 보이며 ~8시간 후 정체했다. 반면 5-ALA-Hex는 0.10-0.30 mM에서 피크에 도달했으나 1 mM 이상에서 세포독성으로 전체 형광이 감소했다.

그림 4. PC3 세포에서 5-ALA-SQ NAs(파랑) 또는 5-ALA-Hex(빨강) 노출 후 PpIX 형광 동역학.

4시간과 24시간 용량-반응 곡선에서 5-ALA-SQ NAs가 두 세포주 모두에서 5-ALA-Hex와 동등하거나 더 높은 형광 강도를 보였다. 최대 형광은 4시간에 1-2 mM 5-ALA-SQ로 달성되었으며, 24시간 노출에서는 더 높은 농도(최대 3.3 mM)가 필요했다. 주목할 점은 5-ALA-SQ가 더 지속적인 형광 프로파일을 유지하며, 최고 농도와 최장 배양에서만 점진적 감소를 보였다.

그림 5. PC3(a,b)와 U87MG(c,d) 세포에서 4시간(왼쪽)과 24시간(오른쪽) 후 5-ALA-SQ NAs(파랑)와 5-ALA-Hex(빨강)의 PpIX 축적 용량-반응 곡선.

시판 5-ALA 제형과 비교 시, 5-ALA-SQ NAs는 U87MG 세포에서 4시간 후 유의미하게 더 높은 형광을 생성했으며, 이는 수술 중 영상화에 중요한 창이다. 24시간 후 5-ALA-SQ 형광은 최적 농도에서 5-ALA와 일치해 시간이 지남에 따라 비교 가능한 전체 PpIX 생성을 나타냈다.

그림 6. U87MG 세포에서 4시간(a)과 24시간(b) 후 5-ALA-SQ NAs(파랑)와 5-ALA(초록)의 PpIX 축적 용량-반응 곡선.

5-ALA-SQ의 향상된 세포 섭취는 이전에 스쿠알렌-젬시타빈 NAs에서 입증된 알부민 매개 단량체 접합체 수송에 의해 유도된 것으로 보인다. 5-ALA의 양전하 아미노기가 수용상 쪽으로 향하고 소수성 스쿠알렌 코어가 입자 내부로 조립되어 다른 스쿠알렌 NAs 대비 크기 감소를 설명할 수 있다.

결론

우리는 자발적으로 고도로 안정적이고 고함량(26%) 나노어셈블리를 형성하는 5-ALA-스쿠알렌 접합체를 설계했다. 전립선암과 교모세포종 세포에서 체외 연구는 이 NAs가 5-ALA를 효율적으로 전달하고 상용 제형과 견주거나 능가하는 PpIX 형광을 생성하며 장기 배양에서도 견고한 성능을 유지함을 입증했다. 이 결과는 5-ALA-SQ NAs를 종양 광진단과 광역학 치료를 위한 전신 플랫폼으로서 추가적인 체내 평가를 지지한다.

방법/실험

모든 시약은 상업적 공급업체에서 구입해 추가 정제 없이 사용했다. 5-ALA를 Boc-보호한 후 EDC/DMAP로 하이드록실화 스쿠알렌 유도체(3)와 결합시키고, 온화한 산성 조건에서 탈보호했다. 최종 생성물(5)은 역상 HPLC로 정제하고 NMR과 HRMS로 특성화했다.

나노어셈블리는 나노침강으로 제조: 빌딩 블록(5) 1.2 mg을 50/50 아세톤/에탄올 혼합물(500 μL)에 용해해 1.25 mL 밀리-Q 물에 100 μL/min 속도로 방울방울 첨가했다. 5분 교반 후 30°C에서 회전증발로 용매를 제거해 2.00 mM NA 용액을 얻었다.

입자 크기, 분산도, 제타 전위는 25°C에서 DLS(Malvern Nano ZS)로 측정했다. 크라이오-TEM은 Vitrobot 플런저로 제조된 유리화 시편으로 수행했다. 안정성은 4°C에서 1개월간 DLS로 평가했다.

PC3(웰당 12,000 세포)와 U87MG(웰당 10,000 세포)를 96웰 플레이트에 접종하고, 5-ALA-SQ NAs, 5-ALA-Hex, 5-ALA(무혈청 배지) 희석액으로 최대 24시간 배양했다. PpIX 형광은 Safire 플레이트 리더(405 nm 여기, 630 nm 방출)로 기록했다. 데이터는 미처리 대조군으로 정규화해 평균 ± SD로 플로팅했다. 통계적 유의성은 p < 0.05로 설정(GraphPad Prism 6).