이 시험관 내 개념 증명 연구에서 수렴 화학 전략을 사용하여 스쿠알렌과 5-ALA에서 5-ALA-SQ 빌딩 블록을 합성했습니다. 5-ALA-SQ NA는 물에서 자발적인 나노침전에 의해 제조되었습니다. NA는 크기 평균 70nm, 다분산 지수 0.12, 양의 ζ 전위 36mV, 높은 26% 5-ALA 로딩으로 단분산 및 안정했습니다. PpIX 생산은 시간 경과에 따른 형광 증가를 측정하고 5-ALA 및 5-ALA-Hex와 비교하여 2개의 암 세포주에서 시험관 내에서 평가되었습니다. 결과는 SQ-ALA NA가 PC3 및 U87MG 암 세포 유형에서 PpIX 생성을 유도하는 데 매우 효율적임을 보여주었습니다. 그들은 시험관 내에서 4시간 및 24시간 배양 시간에 더 높은 농도에서 형광 유도에서 5-ALA-Hex를 능가합니다. 그러나 5-ALA와 비교하여 더 짧은 배양 시간에서 우수한 형광 유도를 보여줍니다. 이러한 발견의 범위에서 우리는 5-ALA-SQ NA가 5-ALA의 약동학적 단점을 극복하기 위한 매력적인 나노기술 솔루션을 제시한다는 결론을 내릴 수 있습니다. 또한, 생체 내 실험은 종양의 형광 PD 및 PDT 치료를 위한 5-ALA의 전신 전달 가능성을 평가할 것입니다.
방법/실험
시약은 상업적 공급업체인 Sigma-Aldrich(Bucks, Switzerland) 및 Acros Organics(Basel, Switzerland)에서 구입하여 추가 정제 없이 사용했습니다. 중수소화 NMR 용매는 Cambridge Isotope Laboratories(Tewksbury, USA)에서 입수했습니다. 테트라히드로푸란(THF) 및 디클로로메탄(CH2 Cl2 ) 무수 엔지니어링 알루미나 컬럼 기반 건조 시스템에서 얻었다. 사용된 다른 모든 용매는 HPLC 등급이었습니다. N,N-디메틸포름아미드(DMF), 메탄올(CH3 OH), 디에틸 에테르(Et2 O) 및 아세톤은 Sigma-Aldrich(Buchs, Switzerland)에서 구입했습니다. 에틸 아세테이트(AcOEt)는 Biosolve(Dieuze, France)에서 구입했습니다. 아세토니트릴(CH3 CN)는 Carlo Erba Reagents(Balerna, Switzerland)에서 공급했습니다. n-헥산의 ≥ 95% 헥산은 Fisher Chemical(Basel, Switzerland)에서 구입했습니다. 제조에 사용된 물은 Milli-Q lab water system(Millipore, Molsheim, France)에 의해 탈이온화되었습니다. 무수 조건을 보장하기 위해 아르곤 양압의 표준 주사기 격막을 사용하여 화학 반응을 수행했습니다.
얇은 층 크로마토그래피(TLC)는 적절한 이동상이 있는 알루미늄 지지 실리카 플레이트(Merck-Keiselgel 60 F254)로 수행하고 UV 형광 램프(254 및 366nm)를 사용하여 시각화하고/하거나 닌히드린, 20% 황산으로 현상했습니다. 산, 또는 인몰리브덴산(PMA). 플래시 크로마토그래피는 PDA 검출기(200-800nm) 및 자동 분획 수집기가 장착된 Interchim 실리카 컬럼 puriFlash® HP 30μm를 사용하여 Interchim(프랑스 Montlucon)의 자동화된 PuriFlash® 4100 기계에서 수행되었습니다. Flash Interchim 소프트웨어 버전 5.0x를 사용하여 용리 프로파일을 모니터링했습니다. Semi-preparative HPLC 컬럼은 Waters Symmetry 300TM - 5μm(19 × 150mm), C8 컬럼(Baden-Dättwil, Switzerland)에서 수행되었습니다. 분석 UPLC는 Waters PDA 검출기(Baden-Dättwil, Switzerland)가 장착된 물 시스템에 장착된 Macherey-Nagel EC50/2 Nucleodur Gravity 1.8μm 컬럼(50 × 2.1mm)을 사용하여 수행되었습니다. 버퍼 A =CH3 CN + 0.1% 포름산) 및 완충액 B =H2 O + 0.1% 포름산. 유속 =25°C에서 400.0μL/분
1
H 및
13
C NMR 스펙트럼은 298K에서 Varian Gemini 300MHz, Varian Innova 500MHz 또는 Bruker Avance III Cryo 600MHz 분광계에서 기록되었습니다. 화학적 이동(δ)은 백만분율(ppm)로 표시되고 커플링 상수(J)는 헤르츠(Hz). s는 단일선, d는 이중선, dd는 이중선, t는 삼중선, q는 사중선, m은 다중선입니다. 잔류 용매 피크는 proton 및 탄소 화학적 이동에 대한 내부 기준으로 사용되었습니다. NMR 스펙트럼은 Mnova 버전 10.0.2 소프트웨어 패키지로 처리되었습니다. 저해상도 질량 분석기(LRMS)는 HTS PAL-LC10A – ESI(포지티브 모드)의 API 150Ex 기기에서 수행되었습니다. 고해상도 질량 분석기(HRMS)는 ESI(양성 모드)의 QSTAR Pulsar(AB/MDS Sciex) 기기에서 수행되었습니다. ChemBioDraw Ultra 버전 14.0.0.117 소프트웨어 패키지를 사용하여 IUPAC 명명법에 따라 화학 구조를 그리고 명명했습니다. pH는 Metrohm 버퍼로 보정된 선봉 전극(Zofingue, Switzerland)을 사용하여 Metrohm 691 pH 미터에서 측정되었습니다. 통계 분석은 GraphPad Prism 6, 2016, (GraphPad Software) 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 피 값 <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
SQ-ALA 빌딩 블록의 합성
5-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4-옥소펜타노산(2)
Boc-5-ALA는 공개된 절차에 따라 합성되었습니다. 분광 데이터는 문헌[56]과 동일합니다.
1
H NMR(600MHz, DMSO-d6) δ 12.12(s, 1H), 7.06(t, J =5.9 Hz, 1H), 3.76(d, J =5.9 Hz, 2H), 2.61(t, J ) , 2H), 2.40(t, J =6.5 Hz, 2H), 1.38(s, 9H).
13
C NMR(151MHz, DMSO) δ 206.62, 174.07, 156.21, 78.54, 49.97, 40.38, 40.24, 40.11, 39.97, 39.83, 39.425, 6, 39.425, [M+H]
+
232.1, 발견 232.7.
(4E,8E,12E,16E)-4,8,13,17,21-펜타메틸도코사-4,8 ,12,16,20-펜타엔-1-올(3)
스쿠알렌 알코올 3 보고된 절차에 따라 스쿠알렌으로부터 23.7% 수율로 무색 오일로 합성되었습니다[49].
1
H NMR(300MHz, CDCl3 ) δ 5.17-5.06(m, 5H, CH), 3.62(q, J =6.3Hz, 2H, CH2 -OH), 2.17 – 1.92(m, 18H, CH2 ), 1.67(초, 3H, CH3 ), 1.59(m, 17 H, CH3 및 CH2 ).
13
C NMR(75MHz, CDCl3 ) 135.35, 135.17, 135.14, 134.81, 131.49, 125.05, 124.64, 124.60, 124.47, 63.07, 39.98, 39.95, 39.89, 36.24, 30.92, 28.48, 26.98, 26.88, 26.78, 25.94, 17.92, 16.28, 16.23, 16.08을 Δ. LRMS(ESI):[M+NH4에 대해 계산된 m/z ]
+
404.4, 발견 404.8.
(4E,8E,12E,16E)-4,8,13,17,21-펜타메틸도코사-4,8 ,12,16,20-펜타엔-1-일 5-((tert-부톡시 카르보닐)아미노)-4-옥소펜타노에이트(4)
스쿠알렌 알코올(3 )(100mg, 0.26mmol), EDC(74mg, 0.38mmol) 및 DMAP(94mg, 0.78mmol) 및 5-(tert-부톡시카르보닐아미노)-4-옥소펜타노산(2)(77mg, 0.34mmol) DCM(15mL)에 용해되었습니다. 주위 온도에서 밤새 교반한 후, 용매를 감압 하에 증발시키고 조 생성물을 DCM/에틸 아세테이트(EA) 구배를 사용하는 플래시 크로마토그래피로 정제하여 무색 오일(108mg, 0.18mmol, 70%)을 제공했습니다.
1
H NMR(300MHz, CDCl3 ) δ 5.31 – 5.20(br s, 1H), 5.13 – 5.07(m, 5H), 4.09 – 3.95(m, 4H), 2.75 – 2.53(m, 4H), 2.02 – 1.95(m, s, 3H), 1.63 – 1.50(m, 19H), 1.41(s, 9H).
13
C NMR 204.46 δ (75 MHz의, CDCl3), 172.65, 135.30, 135.16, 135.09, 133.75, 131.43, 125.34, 124.60, 124.57, 124.48, 124.45, 64.81, 50.53, 39.96, 39.93, 39.87, 35.92, 34.56, 28.52, 28.47 , 28.43, 28.24, 28.02, 26.97, 26.86, 25.92, 23.11, 17.90, 16.25, 16.21, 16.06. LRMS(ESI):[M+NH4에 대해 계산된 m/z ]
+
617.5, 617.8에서 찾았습니다.
5-아미노-(((4E,8E,12E,16E)-4,8,13의 트리플루오로아세트산 염 ,17,21-펜타메틸도코사-4,8,12,16,20-펜타엔-1-일)옥시)-4-옥소펜타노에이트(5)
화합물 4 (34mg, 57mmol)을 DCM(2.0mL)에 용해했습니다. 트리플루오로아세트산(TFA)(200μL)을 첨가하고 반응 혼합물을 주위 온도에서 교반했습니다. 10분 후, 용매를 진공에서 저온에서 증발시키고 미량의 TFA를 EA(3 × 10 mL)와의 동시 증발로 제거했습니다. 조 생성물을 전체 H2를 사용하여 RP-HPLC로 정제했습니다. 무색 오일(25mg, 74%)을 생성하는 O/AcN(0.025% TFA) 구배. %).
1
H NMR(300MHz, CDCl3 ) δ 5.31 – 5.20(br s, 1H), 5.13 – 5.07(m, 5H), 4.09 – 3.95(m, 4H), 2.75 – 2.53(m, 4H), 2.02 – 1.95(m, s, 3H), 1.63 – 1.50(m, 19H). LRMS(ESI):[M+H]
+
에 대해 계산된 m/z 500.4, 500.6을 찾았습니다.
나노어셈블리의 준비
NA는 다른 곳에서 자세히 설명된 나노침전에 의해 제조되었습니다[20]. 간단히 말해서 구성 요소 5 (1.2 mg, 2.0 μmol)을 50/50 V /V 혼합물 아세톤/에탄올(500μL). 그런 다음, 자기 교반 하에 100μL/min의 속도로 마이크로 주사기를 사용하여 유기상을 MilliQ 물(1.25mL)에 적가했습니다. 교반 5분 후 자석 교반 막대를 제거하고 30°C에서 회전 증발기를 사용하여 유기 용매 및 과량의 물을 제거했습니다. 나노어셈블리의 최종 농도는 2.00mM이었습니다.
5-ALA-SQ NA의 특성
5-ALA.SQ NA의 5-ALA 로딩은 다음과 같이 5-ALA 및 5-ALA-SQ 접합체의 분자량 기여도에서 계산되었습니다.
$$ \mathrm{Loading}\ \left(\%\right)=\frac{\mathrm{MW}\ \left(5-\mathrm{ALA}\right)}{\mathrm{MW}\left(5 -\mathrm{ALA}-\mathrm{SQ}\right)}\times 100 $$
NA의 유체역학적 직경은 ZetaSizer 7.01 소프트웨어를 실행하는 Malvern(Worcestershire, UK)의 NANO ZS 기기를 사용하여 동적 광산란(DLS)에 의해 측정되었습니다. 분석은 Brand(Wertheim, Germany)의 폴리스티렌(PS) 마이크로 큐벳에서 25°C, 173°의 산란 각도에서 4mW He-Ne 레이저(633nm)로 수행되었습니다. Malvern의 접힌 모세관 세포 DTS 1070에서 Malvern의 동일한 Nano ZS 기기를 사용하여 제타 전위(ZP)를 결정했습니다. 크기 분포 및 크기 평균 직경은 데이터에서 계산되었습니다. 4°C에서 보관된 NA의 안정성은 1개월 동안 정기적인 시점에서 DLS로 분석되었습니다.
TECNAI® G
2
를 사용하여 극저온 투과 전자 현미경(cryo-TEM)으로 NA의 형태를 평가했습니다. 2000 x 2000 픽셀 고해상도 디지털 카메라 TCL(Gräfelfing, Germany)이 장착된 구형 현미경(FEI, Thermo Fisher Scientific). Virtobot cryo-plunger(FEI, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 유리화된 얼음 샘플을 준비했습니다. NA(2.0μL, 2.0mM)를 Quantifoil Cu/Rh 200 mesh R3.5/1 그리드(SPI, West Chester, USA)에 적용하고 액체 에탄을 사용하여 유리화했습니다.
세포 배양
인간 전립선암 세포 PC3(ATTC® CRL-1435™) 및 인간 교모세포종 세포 U87MG(ATTC® HTB-14™)는 F-12K 영양 혼합물(21127-022, Thermo Fisher Scientific) 또는 최소 Essential Media(31095-029, Thermo Fisher Scientific), 각각. 세포 배지에 송아지 태아 혈청(10%, CVFSVF00-01, Eurobio), 스트렙토마이신(100μL/mL) 및 페니실린(100IU/mL, 15140-122, Thermo Fisher Scientific)을 보충했습니다. 세포는 95%의 공기와 5%의 CO2를 포함하는 가습된 대기에서 37°C에서 배양되었습니다.
체외 PpIX 형광 운동 측정
인간 전립선암 세포 PC3(12,000개 세포/웰) 및 교모세포종 세포 U87MG(10,000개 세포/웰)를 96웰 플레이트(투명 바닥 흑색 플레이트, 3603, Corning)에 접종했습니다. 다음날, 세포는 무혈청 배지에서 증가하는 농도의 5-ALA-SQ NA, 5-ALA-Hex 및 5-ALA에 노출되었습니다. PpIX 형광은 다른 시점에서 플레이트 판독기(Safire, Tecan, Switzerland)로 기록되었습니다. 여기 파장은 405nm로, 방출 파장은 630nm로 설정했습니다. 평균값 및 s.d. 플레이트당 각 시점의 각 농도에 대해 참조 값(처리 없음)과 함께 차감하고 각 세포주에 대해 플롯팅했습니다.
