이 보고서에서 우리는 표적 종양 치료를 위해 페리틴(Ft)을 기반으로 하는 pH 유도 가역 어셈블리 시스템(PIRAS)을 제시합니다. 천연 pH 민감성과 Ft. 종양 특이적 표적 펩타이드 Arg-Gly-Asp(RGD)는 RV-로딩된 Ft(RV@Ft)의 표면에 접합되어 생체 적합성 나노입자(RV@Ft-RGD)를 형성합니다. Ft의 pH 감도는 산성 조건에서 속이 빈 다공성 나노구로 변성되고 중성 조건에서 밀봉된 속이 빈 나노구로 변성될 수 있습니다. pH 조작을 사용하여 ~ 21 nm 직경의 RV@Ft-RGD는 79.6%의 높은 RV 로딩 비율을 보여주었습니다. 그런 다음 pH에 의해 유발된 RV 방출을 pH 5.0에서 24시간 동안 50.3%의 비율로 측정했습니다. 중성 조건에서 RV@Ft-RGD는 20일 동안 우수한 안정성을 보였다. 공초점 형광 이미징은 RV@Ft-RGD가 주로 RGD 매개 표적 효과로 인해 높은 세포 흡수율과 리소좀과의 공동 국소화를 가짐을 보여주었습니다. 높은 약물 로딩, pH 유발 방출 및 종양 세포 표적화 효과를 기반으로 RV@Ft-RGD는 시험관내 및 생체내에서 우수한 세포 사멸 능력을 나타냈다. 시험관 내 및 생체 내 생체 적합성 또한 전신 독성 없이 우수한 것으로 입증되었습니다. Ft를 기반으로 한 PIRAS의 설계 개념은 종양 성장을 유의하게 억제하는 동시에 나노의학에서 Ft의 적용을 더욱 확장합니다.
폐암은 인간에서 가장 치명적인 고형 악성 종양 중 하나입니다. 환경 악화 등의 요인으로 폐암의 발병률은 해마다 증가하고 있으며 5년 생존율은 17.4%에 불과하다[1, 2]. 현재 외과적 절제, 방사선 요법, 표준 1차 화학 요법과 같은 전통적인 임상 치료가 가능하지만 폐암 환자의 전체 생존율 중앙값은 여전히 개선되어야 합니다[3, 4]. 따라서 이 치명적인 질병을 치료하기 위해서는 보다 효과적이고 안전한 치료법이 시급히 개발되어야 합니다. 현재 많은 화학요법 약물의 낮은 표적 효과와 높은 부작용으로 인해 화학 요법에서 그 유용성이 제한되어 있지만[5,6], 특히 나노 약물의 신흥 분야에서 새로운 화학 요법 약물이 지속적으로 개발되고 있습니다[7,8, 9,10]. 레스베라트롤(Resveratrol, RV)은 포도 및 대두와 같은 천연 식물의 추출물로 혈소판 응집 촉진, 혈관 확장 억제, 혈액 점도 감소 등을 위해 임상 환경에서 널리 사용되어 왔습니다[11,12,13,14,15 ]. 최근에는 강력한 항암 효과도 있는 것으로 밝혀졌다[16,17,18]. 그러나 RV는 잠재적인 저분자 약물로서 다른 1차 화학요법 약물과 마찬가지로 용해도가 낮고 혈액 순환 반감기가 짧고 종양 선택성이 없다는 몇 가지 단점이 있습니다[19, 20]. 최근 이러한 단점을 극복하고 치료 효과를 높이기 위해 RV 기반 나노 약물이 개발되고 있다[21]. 리포솜, 혈청 알부민, 탄소 재료, 2차원 전이 금속 디칼코게나이드(2D-TMD) 등을 포함한 다양한 종류의 나노캐리어가 RV를 로드하는 데 사용되었습니다[21,22,23,24,25]. 이러한 나노운반체는 RV의 치료 효과를 효율적으로 향상시키는 것으로 보고되었지만 리포솜 및 혈청 알부민에 대한 고효율 활성 방아쇠 방출 능력, 탄소 재료 및 2D- TMD[26, 27]. 따라서 더 많은 자격을 갖춘 나노운반체에 대한 수요가 여전히 존재합니다.
페리틴은 약 8nm의 루멘을 가진 천연 나노케이지 단백질로, 중쇄 및 경쇄의 24개 소단위의 상호작용 및 조립을 통해 형성됩니다[28, 29]. 페리틴은 내인성 단백질이기 때문에 생체적합성과 안전성이 뛰어납니다. 또한 페리틴은 환경이 산성에서 알칼리성 조건으로 변화함에 따라 가역적으로 변성 및 재조립될 수 있는 자연적으로 pH에 민감한 단백질이라는 보고가 있습니다[30]. pH가 산성일 때, 분해된 막대형 올리고머는 헤드셋 형태의 구조로만 회복되었고, 분해된 헤드셋 형태의 중간체는 속이 빈 구형 구조로만 회복되었다[28,29,30]. 이 독특한 pH 유발 조립 및 분해 거동은 페리틴을 이상적인 약물 전달 시스템으로 만듭니다. 최근 Zhang et al. 독소루비신(DOX) 분자가 페리틴에 캡슐화될 수 있고 종양 치료를 위한 pH 조절에 의해 성공적으로 방출될 수 있다고 보고했습니다[28].
이 연구에서 우리는 강화된 종양 표적 화학 요법을 위한 RV 로딩 및 방출을 제어하기 위해 페리틴 기반 pH 유도 가역 조립 시스템(PIRAS)을 개발하는 것을 목표로 했습니다. 페리틴 구의 표면은 종양 표적 펩타이드 RGD와 연결되었습니다. 생성된 나노 약물 RV@Ft-RGD는 중성 및 알칼리성 환경(pH> 7.4)에서 안정하고 산성 환경(pH <7.4)에서만 RV를 방출하는 것으로 입증되었습니다. 추가 특성화 시, RV@Ft-RGD는 시험관 내 및 생체 내에서 다음과 같은 이점을 나타냈습니다. (1) RV@Ft-RGD는 종양 세포를 표적으로 하고 리소좀(산성 환경)에 축적되어 더 많은 RV가 세포질로 방출되는 것을 촉진합니다.; (2) 페리틴 운반체는 유리 RV의 혈액 반감기를 유의하게 향상시켜 전신 순환에서 약물 보유를 개선하여 종양 부위에 약물 축적을 촉진합니다. (3) 페리틴의 구조적 안정성은 전달 과정에서 RV 파열 누출을 방지했습니다. (4) RV@Ft-RGD는 시험관 내 및 생체 내 생체 적합성이 뛰어났습니다. 따라서 이러한 장점으로 인해 RV@Ft-RGD는 훌륭한 항종양 치료 특성을 보여 향후 임상 번역에 큰 잠재력을 보여줍니다.
페리틴, 레스베라트롤(RV, ≥ 99%)은 Sigma-Aldrich의 제품입니다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC), N-히드록시숙신이미드(NHS) 및 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)는 Aladdin Bio-Chem Technology Co., LTD(중국 상하이)에서 구입했습니다. NH2 -PEG2000 -RGD는 Hunan Huateng Pharmaceutical Co., Ltd(Hunan, China)에서 구입했습니다. DMEM 세포 배지, 소 태아 혈청(FBS) 및 인산완충식염수(PBS)는 Invitrogen(미국 캘리포니아주 칼스배드)에서 입수했습니다. 세포 계수 키트-8(CCK-8)은 Dojindo Laboratories(일본)에서 공급했습니다.
RV 로딩은 수정된 이전 보고서[21, 28]에 따라 설명된 대로 준비되었습니다. 먼저 NH2 -PEG2000 -RGD(10mg)를 20μL EDC(5mg/mL) 및 20μL NHS(20mg/mL)의 존재 하에 Ft 용액(1.5mg/mL)에 분산시켰다. 혼합물을 4℃에서 약간 교반하면서 2시간 동안 반응시키고, 밤새 증류수(MW 컷오프 =5kDa)에 대한 투석으로 정제하여 Ft-RGD 나노입자를 생성하였다. 그런 다음, 수불용성 RV를 DMSO에 2 mg/mL가 되도록 용해시키고 최종 농도가 1.5 mg/mL가 되도록 Ft-RGD 용액에 첨가하였다. 혼합물의 pH를 pH =5로 조정하여 폴리펩티드 서브유닛을 분해하였다. 그 후, 혼합물의 pH를 수산화나트륨(1M)으로 천천히 7.4로 조정하여 폴리펩티드 서브유닛과 유사하게 하였다. 생성된 용액을 증류수에서 밤새 투석하여 유리 RV 분자를 제거하여 최종 생성물(RV@Ft-RGD)이 되도록 하였다. 로드된 RV의 양은 306 nm에서 흡수 피크를 모니터링하여 UV-vis 분광 광도계(UV3100, Shimadzu, Japan)로 감지했습니다. RV 적재 비율은 (A 아 - A b )/A ㄷ , 여기서 A 아 , A b , 및 A ㄷ 각각 초기 무부하 RV 및 Ft-RGD의 무게를 나타냅니다.
동적 광산란(DLS) 방법(BI-9000AT, Brookhaven, USA)을 사용하여 나노 입자의 크기와 제타 전위를 감지했습니다. 나노입자의 형태는 투과전자현미경(TEM, JEM-100S, JEOL, Japan)으로 관찰하였다. 형광 스펙트럼은 Perkin-Elmer LS50B 발광 분광 광도계에 의해 검출되었습니다. 세포 형광 신호는 상업용 레이저 스캐닝 현미경(LSM 510, Zeiss, Germany) 및 유세포 분석기(FCM, EPICS XL, Beckman, USA)로 기록되었습니다.
500 마이크로리터의 RV@Ft-RGD 용액을 D-튜브(MWCO 6-8 kDa, Novagen)에 넣고 용액을 다른 완충액을 통해 다른 pH 값으로 조정했습니다. 그런 다음 용액을 37 o 에 투석했습니다. C. 다른 인큐베이션 시간 후, 투석액 1mL 분취량을 제거하고 1mL의 새로운 배지로 교체했습니다. 다른 배양 시간에 방출된 RV는 UV-vis 분광광도계에 의해 결정되었습니다. 또한, RV@Ft-RGD는 pH 5, 6.5, 7.4 및 8.5를 포함하는 다양한 pH 조건을 갖는 플러싱 용액에 용해되었다. 37°C에서 24시간 동안 배양한 후, 나노입자의 크기는 DLS로 특성화되었습니다.
인간 폐암 세포 A549 및 NCI-H358은 중국과학원 Cell Collection(중국 상하이)에서 입수하였고, 10% 소태아혈청(FBS) 및 1% 페니실린 스트렙토마이신(PS)을 함유하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 5% CO2를 포함하는 습한 대기 37시 o 다.
일반적으로 사용되는 방법으로 FITC를 적용하여 나노 입자를 표지했습니다. FITC를 에탄올 용액(2.0mg/mL)에 용해시키고 실온의 어두운 환경에서 4시간 교반 하에 RV@Ft 및 RV@Ft-RGD 수용액(1.0mg/mL)과 혼합했습니다. 혼합물을 증류수에서 밤새 투석하여 중복된 FITC 및 에탄올을 제거하여 FITC로 표지된 RV@Ft 및 RV@Ft-RGD 용액을 생성했습니다. 시험관 내에서 나노입자의 소기관 국소화를 확인하기 위해 세포를 FITC로 표지된 RV@Ft 및 RV@Ft-RGD로 5시간 동안 처리하고 리소좀 특이적 염료 Lyso Tracker Red(Invitrogen)로 염색했습니다. 그 후, CLSM을 사용하여 RV@Ft 및 RV@Ft-RGD의 세포 내재화를 관찰하였다. 간단히 말해서, A549 세포를 FITC로 표지된 RV@Ft 및 RV@Ft-RGD(동일한 농도의 FITC 사용)와 함께 5시간 동안 인큐베이션했습니다. 그런 다음, 세포를 37°C에서 30분 동안 Lyso Tracker Red 용액(100nM)으로 처리했습니다. PBS로 3회 세척한 후 시판되는 레이저 주사현미경으로 세포를 관찰하였다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 세포의 형광 강도를 분석했습니다.
먼저, 담체 Ft-RGD의 세포독성을 표준 CCK-8 assay(Bestbio, China)로 평가하였다. A549 및 NCI-H358 셀(1 × 10 5 세포/mL, 0.5mL)를 96웰 플레이트에 접종하고 24시간 동안 배양했습니다. 오래된 배지를 버린 후, 0, 0.01, 0.1, 0.5 및 1 mg/mL의 Ft-RGD를 포함하는 새로운 배지를 A549 및 NCI-H358 세포와 함께 24시간 동안 인큐베이션했습니다. 세포를 PBS로 부드럽게 3회 세척하였다. 그런 다음 100 마이크로리터의 CCK-8 작업 용액(10% CCK-8 + 90% DMEM)을 각 웰에 첨가하고 37°C에서 30분 동안 인큐베이션했습니다. 450 nm에서의 흡광도 값은 마이크로플레이트 분광광도계(Multiskan FC, Thermo Scientific)를 사용하여 측정되었습니다. 각 세포군의 사진은 광학현미경(Olympus)으로 관찰하였다.
다양한 농도의 유리 RV, RV@Ft, RV@Ft-RGD 및 RV@Ft-RGD + RGD(0, 10, 20, 30 및 40μg/mL RV 등가물)를 A549 세포로 처리했습니다. 24시간 인큐베이션 후, 처리된 세포의 생존력을 CCK-8 분석에 의해 분석하였다. 한편, 이들 처리된 세포는 apoptosis detection kit(Annexin VFITC/PI)로 이중염색되어 FCM으로 분석되었다.
자유 RV 또는 RV@Ft-RGD(6 mg/kg RV 등가물)를 건강한 Balb/c 누드 마우스(n =그룹당 5). 주사 후 마우스의 정맥혈을 다른 시점에서 채취하여 헤파린이 들어있는 채혈관에 넣은 후 혈장을 분리하였다. 혈장 내 RV 농도는 산성화된 isopropanol 시약으로 추출한 후 306 nm 여기에서 흡광도를 측정하여 RV 농도를 결정하였다.
이 작업에 사용된 Balb/c 마우스(4-6주령)는 Charles River Laboratories(중국 베이징)에서 구입했습니다. 동물 실험과 관련된 모든 작업은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 지침을 엄격히 준수합니다. 이 지침은 Zhengzhou University의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. A549의 피하 종양 모델을 설정하려면 2 × 10 6 A549 세포를 쥐의 등에 피하 주사했습니다. 그런 다음 동물의 집에 7~9일 동안 두었다. 종양 부피 계산 공식은 길이 × 너비 2 입니다. /2.
마우스를 포함하는 A459 종양을 무작위로 5개 그룹으로 나누었습니다. 각 그룹은 5마리의 마우스로 구성되었습니다. 특정 그룹은 대조군(식염수), RV, RV @Ft 및 RV@Ft-RGD입니다. 치료 시작 시 시료를 꼬리 정맥을 통해 3일 연속 1일 1회 주입하였다. 종양 부피 및 마우스 체중을 5일마다 기록하였다. 45일의 처리 후, 각 그룹의 종양을 수집하였다. 종양 조직을 10% 포르말린 용액에 고정하고 절편한 후 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 실시했습니다.
200 마이크로리터의 RV@Ft-RGD를 꼬리 정맥을 통해 건강한 Balb/c 마우스에 주사했습니다(RV 용량은 15 mg/kg). 동일한 방법으로 생리식염수를 주입한 건강한 마우스를 빈 대조군으로 사용하였다. 주사 후 0일, 10일 및 45일째에 마우스 혈액을 채취하여 백혈구(WBC), 적혈구(RBC), 헤모글로빈(HGB) 및 평균 혈소판 부피(MPV)를 포함한 세포 수를 평가했습니다. , 평균 적혈구 헤모글로빈(MCH), 헤마토크릿(HCT), 평균 적혈구 헤모글로빈 농도(MCHC), 평균 적혈구 부피(MCV) 및 혈소판(PLT). 또한 45일째 H&E 염색을 위해 각 군의 심장, 간, 비장, 폐, 신장 조직을 채취하였다.
데이터는 평균 ± 표준 편차(s.d.)로 표시되었습니다. 샘플의 통계적 분석은 학생의 t 테스트 및 p <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
RV@Ft-RGD로부터의 RV 로딩 및 방출은 Ft의 pH 유도 가역 분해 및 재조립을 통해 수행되었습니다(그림 1). 첫째, 페리틴은 종양 표적 펩타이드 RGD와 접합되어 Ft-RGD를 형성합니다. 그런 다음 이것을 아세테이트 완충액(pH =5)에 재용해하여 폴리펩티드 서브유닛을 분해하고 속이 빈 공극 구를 형성했습니다. 그런 다음 RV 분자를 추가하고 공동으로 들어가도록 한 후 용액을 천천히 pH ≈ 7.4로 조정하여 Ft를 재조립하여 밀봉된 Ft 공동 내부에 RV 분자를 가두었습니다. 그런 다음 완충액의 pH가 ~ 5로 감소하면 나노입자 기공이 가역적으로 열리고 RV 분자가 방출됩니다. 그림 2a 및 추가 파일 1:그림 S1은 구형 구조를 표시한 조립된 RV@Ft-RGD의 SEM 및 TEM 이미지를 보여줍니다. DLS 분석에 따르면, RV@Ft-RGD 입자는 원시 Ft 나노입자(~ 11.8 nm)에 비해 더 큰 직경(~ 22.5 nm)을 가졌고(그림 2b) 원시 Ft 나노입자(- 29.6 mV)와 유사한 제타 전위를 가졌다(그림 2b). 2c). 20일 후, 물, FBS, 세포 배지 및 PBS에서 RV@Ft-RGD의 다분산 지수(PDI)는 유의한 변화를 나타내지 않았으며(그림 2d), 이는 RV@Ft-RGD가 현저한 콜로이드 안정성을 가짐을 나타냅니다. 그림 2e는 자유 RV, Ft-RGD 및 RV@Ft-RGD의 흡광도 스펙트럼을 보여줍니다. 알 수 있는 바와 같이 RV 및 Ft-RGD의 흡수 스펙트럼과 비교하여 RV@Ft-RGD의 흡수 스펙트럼은 306 nm(RV에서 시작)에서 새로운 피크를 나타내어 RV의 성공적인 로딩을 나타냅니다. 또한, RV@Ft-RGD는 325nm 레이저에 의해 여기될 때 400nm에서 자유 RV와 유사한 상당한 방출 형광을 나타냈습니다(그림 2f).
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RV@Ft-RGD 준비 및 종양 표적 화학요법의 개략도
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아 RV@Ft-RGD의 TEM 이미지. ㄴ , ㄷ Ft-RGD 및 RV@Ft-RGD의 크기 분포 및 제타 전위 분포. d 20일 동안 물, FBS, 세포 배지 및 PBS에서 RV@Ft-RGD의 PDI 변화. 이 자유 RV, Ft-RGD 및 RV@Ft-RGD의 흡광도 스펙트럼. 에 자유 RV 및 RV@Ft-RGD
의 흡광도 스펙트럼Ft-RGD의 최대 적재 용량은 중공 Ft-RGD 내부의 큰 공동으로 인해 252.6%인 것으로 나타났습니다. Ft는 pH에 민감하기 때문에 다양한 pH 조건에서 RV 로딩 용량을 특성화할 수 있었습니다. 그림 3a에서 볼 수 있듯이 pH가 5.0에서 8.5로 증가함에 따라 RV 로딩 효율이 급격히 감소했습니다. 복합체로부터의 RV 방출은 또한 5.0에서 8.5까지의 다양한 pH 값에서 특성화되었습니다. pH 값 및 시간에 따른 RV 방출 프로파일은 이 데이터로부터 구성되었으며 그림 3b에 나와 있습니다. 최대 약물 방출율(51.6%)은 pH =5.0에서 24시간 동안 발생하였으며, 이는 pH =6.5, 7.4, 8.5에서보다 높았다. 관련 보고에 따르면 pH 5.0, 6.5, 7.4는 각각 세포 리소좀, 종양 조직, 혈액 및 정상 생리학적 환경에서 일반적으로 발견되는 값이다[31]. 생리학적 조건(pH7.4)에서 RV@Ft-RGD의 RV 약물 함량은 50시간 후에도 높게 유지되었으며(그림 3c), 이는 RV@Ft-RGD의 RV가 안정적이고 쉽게 누출되지 않음을 시사합니다. 또한 다양한 pH 조건에서 RV @ Ft-RGD의 직경 변화를 조사했습니다. 37°C에서 12시간 동안 배양한 후 DLS 분석은 RV@ Ft-RGD의 직경이 pH 8.5 및 7.4에서 약 23nm로 거의 일정함을 보여주었습니다. pH 값이 6.5와 5.0으로 떨어졌을 때 RV @ Ft-RGD의 직경은 각각 25nm와 28.6nm로 증가했습니다(그림 3d). 이러한 결과는 RV@Ft-RGD의 pH 유도 가역적 분해 및 재조립의 거동을 확인시켜주며, 이는 시험관 내 약물 로딩 및 종양 조직에서의 약물 방출을 제어하는 데 도움이 됩니다.
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아 다양한 pH 조건에서 Ft-RGD의 로딩 효율. ㄴ 5.0 ~ 8.5의 다양한 pH 조건에서 RV@Ft-RGD의 RV 방출 프로필. ㄷ 생리적 조건에서 RV@Ft-RGD의 영구 RV. d 5.0에서 8.5까지 다양한 pH 조건에서 RV@Ft-RGD의 평균 크기 변화
그런 다음 RV@Ft-RGD의 시험관내 세포 흡수 및 국소화를 평가했습니다. 첫째, RV@Ft 및 RV@Ft-RGD는 수소 결합 상호작용 및 물리적 흡수를 통해 FITC에 의해 표지되었다. 도 4a에 도시된 바와 같이, 유리 FITC 처리된 세포는 무시할만한 세포질 형광 신호를 나타내었다. 대조적으로, RV@Ft-RGD 처리된 세포는 RV@Ft 처리된 세포보다 더 높은 강렬한 FITC 녹색 형광을 나타냈다. 특히, RV@Ft-RGD 처리 및 RGD 전처리 세포 모두 낮은 녹색 형광을 나타냈다. 이러한 결과로부터, 우리는 RV@Ft-RGD가 아마도 RGD 매개 활성 표적 효과를 통해 세포에 의해 다량으로 흡수되었다는 결론을 내릴 수 있습니다. 이러한 처리된 세포는 또한 FCM에 의해 분석되었으며, 그 결과는 그림 4b에 나와 있습니다. 세포 형광 강도 통계 결과도 유사한 결론을 제시합니다.
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아 각각 RV@Ft, RV@Ft-RGD + RGD 및 RV@Ft-RGD로 표지된 유리 FITC 및 FITC와 배양 후 A549 세포의 형광 이미지. 스케일 바 =60 μm. ㄴ 유리 FITC 및 RV@Ft, RV@Ft-RGD + RGD 및 RV@Ft-RGD로 각각 표지된 FITC와 배양 후 A549 세포에서 세포 FITC 형광 강도의 FCM 측정. ㄷ FITC 및 Lyso Tracker Red의 세포 형광 공동 위치 계수. **P <0.01, 다른 그룹과 비교하여 각각
RV@Ft-RGD의 소기관 위치를 연구하기 위해 리소좀 특이적 염색 염료(Lyso Tracker Red)를 사용하여 나노입자와 함께 배양된 세포를 염색했습니다. 도 4a에서 볼 수 있는 바와 같이, 세포질은 모든 군에서 강한 적색 형광을 나타내었다. FITC 녹색 형광과 병합 후, RV@Ft-RGD는 이들 그룹 중 세포질에서 가장 강렬한 황색(녹색 + 적색) 형광을 나타냈다. 통계 분석을 기반으로 RV@Ft-RGD 처리 그룹은 FITC와 Lyso Tracker Red 형광 사이에서 가장 높은 co-localization 계수를 보였습니다(그림 4c). 이러한 결과는 RV@Ft-RGD가 세포에 적극적으로 들어간 다음 리소좀의 산성 환경(pH ≈ 5.0)으로 이동할 수 있음을 나타냅니다. 이러한 장점은 pH 반응성 약물 방출과 함께 RV@Ft-RGD에 생체 내 종양 치료에 대한 많은 잠재적 응용 프로그램을 부여합니다.
RV@Ft-RGD의 항종양 특성을 연구하기 전에 Ft-RGD 운반체의 세포독성을 조사했습니다. 그림 5a 및 추가 파일 1:그림 S2 및 S3에서 볼 수 있듯이 Ft-RGD는 최대 1 mg/mL 농도에서 폐암 A549 세포 및 NCI-H358 세포에 대한 명백한 생존 억제를 나타내지 않았습니다. 세포 형태도 1 mg/mL 처리된 세포를 대조군과 비교할 때 유의한 변화를 나타내지 않았으며(그림 5b), 담체인 Ft-RGD가 우수한 생체 적합성을 가졌음을 분명히 시사합니다. 도 6a, b에 도시된 바와 같이, 유리 RV, RV@Ft 및 RV@Ft-RGD는 모두 농도 의존적 방식으로 세포를 사멸시킨다. RV@Ft-RGD 처리된 세포는 40 μg/mL 그룹에서 11.2%의 생존율 감소만을 보였고, 이는 RV@Ft 및 RV@Ft-RGD + RGD 전처리 그룹보다 낮았습니다. FCM을 사용한 예비 연구에 따르면 RV 단독, RV@Ft 또는 RV@Ft-RGD에서 대부분의 세포 사멸이 세포 사멸을 통해 매개됨이 밝혀졌습니다(그림 6c). 이러한 결과는 RV의 종양 세포 사멸 효과가 주로 리소좀에서 RV@Ft-RGD의 축적 증가로 인해 Ft-RGD에 로딩함으로써 크게 향상되었음을 보여줍니다. 세포질로 [32, 33].
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아 24시간 동안 상이한 농도의 Ft-RGD로 처리된 A549 세포에 대한 시험관내 세포독성. ㄴ 1 mg/mL의 Ft-RGD로 24시간 처리한 후 A549 세포의 현미경 이미지
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아 다른 농도의 RV 처리된 A549 세포의 세포 생존율. ㄴ RV@Ft, RV@Ft-RGD + RGD 및 RV@Ft-RGD를 다양한 농도의 RV로 처리한 세포의 세포 생존율. ㄷ 유세포 분석에 의한 PBS(대조군), RV, RV@Ft, RV@Ft-RGD + RGD 및 RV@Ft-RGD로 처리된 A549 세포의 세포 사멸. **P <0.01, 다른 그룹과 비교하여 각각
주사 후 다른 시간에 혈장 내 RV 농도는 유리 RV 및 RV@Ft-RGD 처리 그룹에서 각각 연구되었습니다. 도 7a에 도시된 바와 같이, RV@Ft-RGD의 혈액 반감기는 5.1 ± 0.23시간이었다. 유리 RV는 혈액 반감기가 0.43 ± 0.11시간에 불과하여 순환에서 더 빨리 세척되었습니다. 혈액 내 RV@Ft-RGD의 현저하게 연장된 반감기는 전신 순환에서 약물 보유를 개선하고 종양 부위에서 약물 축적을 촉진하는 데 도움이 됩니다.
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아 혈액 내 유리 RV 및 RV@Ft-RGD의 순환 시간. ㄴ 식염수(대조군), RV, RV@Ft, RV@Ft-RGD + RGD 및 RV@Ft-RGD를 3회 정맥 주사한 후 A549 이종이식된 종양의 성장 프로파일. 빨간색 화살표는 주입 시점을 나타냅니다. **P <0.01, 다른 그룹에 비해 각각. ㄷ 다양한 처리 후 종양 보유 마우스의 체중. d H&E로 염색된 종양 조각의 현미경 사진은 치료가 끝난 후 여러 그룹의 마우스에서 수집되었습니다. 스케일 바는 50μm입니다.
그림 7b는 상대적인 종양 부피로 표현된 다른 치료를 받은 종양 보유 마우스의 종양 성장 프로파일을 보여줍니다. RV@Ft의 낮은 흡수로 인해 RV@Ft로 치료할 때 종양 성장이 어느 정도 억제되었습니다. 그러나 RV@Ft-RGD를 처리한 군에서는 다른 군(대조군, RV, RV@Ft, RV@Ft-RGD + RGD)에 비해 종양 성장이 유의하게 억제되었다. 처리하는 동안 어떤 실험군에서도 눈에 띄는 체중 감소가 없었으며(그림 7c), 이는 RV@Ft-RGD의 높은 생물학적 안전성을 나타냅니다. 치료 과정이 끝난 후, 이들 그룹의 종양 조직에 대한 H&E 염색을 수행하여 화학 요법 효과를 조사했습니다. 도 7d에 도시된 바와 같이, RV@Ft-RGD로 처리된 종양에서 큰 영역의 세포자멸사가 관찰되었으며, 이는 유리 RV, RV@Ft 및 RV@로 처리된 종양에서 단지 작은 세포자멸사 영역과 유의한 대조를 이룬다. Ft-RGD + RGD. 또한, RV@Ft-RGD의 전신 독성은 정상 마우스에서도 평가되었습니다. 식염수 및 RV@Ft-RGD 처리된 건강 마우스의 전혈 샘플을 혈액 분석을 위해 주사 후 0, 10 및 45일에 수집했습니다. 도 8a, b에 나타난 바와 같이, RV@Ft-RGD를 주사한 마우스의 전혈구수(WBC, RBC, HGB, MPV, MCH, HCT, MCV, PLT, 및 MCHC)는 0일부터 0일까지 유의한 차이를 보이지 않았다. 45일. 식염수와 RV@Ft-RGD로 처리한 건강한 마우스의 주요 장기도 H&E 염색을 위해 45일째에 수집했습니다. 이 조직에서는 명백한 부작용이 발견되지 않았으며(그림 8c), 무시해도 될 정도의 장기적인 유해 독성을 시사합니다. 이러한 모든 결과는 생체 내에서 강화된 암 화학 요법에 대한 RV@Ft-RGD의 유망한 잠재력을 보여줍니다.
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아 45일 동안 RV@Ft-RGD로 처리한 건강한 쥐의 혈액 분석. ㄴ 45일 동안 RV@Ft-RGD를 처리한 건강한 마우스의 H&E 염색 주요 장기의 이미지. ㄷ H 염색은 대조군 및 RV@Ft-RGD 처리군의 주요 장기를 이미지화합니다. 스케일 바는 50μm입니다.
요약하면, 우리는 향상된 종양 표적화 화학요법을 위한 항종양 RV 약물의 pH 제어 가능한 로딩 및 방출을 갖는 pH 유도 가역적 조립 시스템(PIRAS)을 성공적으로 개발했습니다. 산성(pH =5.0) 조건에서 시스템이 분해되어 RV를 로드하거나 방출할 수 있는 반면, 중성 조건(pH =7.4)에서는 RV@Ft-RGD가 매우 안정적이며 무시할 수 있는 약물 누출을 보여줍니다. RGD 매개 표적 효과를 통해 RV@Ft-RGD는 A549 세포에 의해 고농도로 흡수되고 리소좀에 축적될 수 있으며, 이는 시험관 내 및 생체 내 모두에서 RV 방출에 유리합니다. 리소좀에 RV@Ft-RGD가 축적되고 산성 리소좀이 세포질로 RV를 pH 유발하는 방출로 인해 RV@Ft-RGD는 유리 RV에 비해 우수한 종양 세포 사멸 및 세포 사멸 촉진 효과를 나타냈습니다. 또한, RV를 Ft-RGD에 로딩한 후, RV@Ft-RGD는 유리 RV보다 훨씬 더 긴 혈액 반감기를 보였다. 생체 내 결과는 RV@Ft-RGD가 현저한 종양 억제 및 눈에 띄는 전신 독성을 나타내지 않음을 보여줍니다. 이 연구는 Ft 기반 PIRAS가 향상된 항암 요법을 위한 약물 로딩 및 방출에 매우 효율적임을 시사합니다.
이 원고에서 내린 결론은 모두 이 백서에 제시되고 표시된 데이터를 기반으로 합니다.
소 혈청 알부민
세포 계수 키트-8
동적 광산란
1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드
태아 소 혈청
플로레세인 이소티오시아네이트
페리틴
적혈구용적률
헤모글로빈
평균 미립자 헤모글로빈
평균 미립자 헤모글로빈 농도
평균 미립자 부피
평균 혈소판 부피
N-하이드록시숙신이미드
pH 유도 가역 조립 시스템
혈소판
적혈구
Arg-Gly-Asp
레스베라트롤
백혈구
나노물질
ABB는 자사의 6축 IRB 1300 산업용 로봇에 이제 거친 산업 분야 및 무오염 생산 공정에서 사용할 수 있도록 하는 새로운 보호 요소가 포함되어 있다고 밝혔습니다. 회사는 개선 사항이 무엇보다도 전자 조립, 자동차 및 금속 가공을 포함한 다양한 산업에서 생산성 향상, 제품 품질 개선 및 주기 시간 단축을 위한 새로운 기회를 열어준다고 말했습니다. 2020년에 처음 출시된 IRB 1300은 현재 IP67, Foundry Plus 2 및 클린룸 ISO 4 버전으로 제공됩니다. 이것은 높은 수준의 액체와 먼지가 있는 거친 환경
제품 제조의 문제점 중 하나는 소비자가 필요로 하는 것을 최종 제품 설계로 변환하는 문제입니다. 제조 회사는 우리가 조립을 위한 설계라고 부르는 것으로 이어지는 생산 프로세스의 진화가 있어야 한다는 데 동의합니다. 조립을 위한 설계는 제조업체가 관련성을 유지하고 고객의 끝없는 요구를 충족할 수 있도록 하기 때문에 매우 중요합니다. 제품 개발 프로세스는 수년에 걸쳐 대대적으로 수정되었습니다. 이는 제조 및 조립 공정을 위한 설계가 주로 저렴한 비용으로 제품을 신속하게 생산할 수 있도록 지원하기 때문입니다. 이 기사에서는 조립을
