산화환원 자극 유발 방출을 위한 나노입자를 표적으로 하는 새로운 이중 미토콘드리아 및 CD44 수용체
초록
이 연구에서, 올리고머 히알루론산(oHA)을 기반으로 하는 새로운 미토콘드리아 및 CD44 수용체 이중 표적 산화환원 민감성 다기능 나노입자(미셀)가 제안되었습니다. 양친매성 나노캐리어는 (5-카르복시펜틸)트리페닐포스포늄 브로마이드(TPP), 올리고머 히알루론산(oHA), 이황화 결합 및 TPP-oHA-S-S-Cur로 명명된 커큐민(Cur)에 의해 제조되었습니다. TPP는 미토콘드리아를 표적으로 하고, 항종양제 Cur는 소수성 코어로, oHA를 표적으로 하는 CD44 수용체는 친수성 껍질로, 이황화 결합은 연결 암으로 작용합니다. TPP-oHA-S-S-Cur의 화학 구조는
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HNMR 기술. Cur는 자가 조립에 의해 TPP-oHA-S-S-Cur 미셀에 로딩되었습니다. 미셀의 준비, 형태, 산화 환원 민감도 및 미토콘드리아 표적화를 포함한 일부 특성이 연구되었습니다. 결과는 TPP-oHA-S-S-Cur 미셀의 평균 직경이 122.4 ± 23.4nm, 제타 전위 - 26.55 ± 4.99mV임을 보여주었습니다. 시험관 내 방출 연구 및 세포 흡수 테스트는 TPP-oHA-S-S-Cur 미셀이 미토콘드리아 및 CD44 수용체에 대한 이중 표적화, 산화환원 감수성을 가짐을 보여주었습니다. 이 연구는 항암제의 용해도를 높이고 부작용을 줄이며 치료 효능을 향상시키는 유망한 스마트 다기능 나노운반체 플랫폼을 제공했습니다.
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배경
최근 몇 년 동안 암의 효과적인 치료를 달성하기 위해 많은 약물 전달 시스템[1]이 분해율을 감소시켜 약물의 생체 이용률을 향상시키는 등 많은 이점을 가질 수 있는 구조적 변형을 갖는 다기능 고분자 고분자 약물 담체를 제조하기 위해 연구되고 있습니다. , 세포 흡수 개선, 약물 방출의 표적화 및 제어 허용, 부작용 감소 [2, 3].
디페놀 화합물인 커큐민(Cur)은 한약재 커큐마 롱가에서 분리되었습니다. . Cur는 일반 항종양제에 비해 전립선암, 유방암, 결장암 등 많은 종양에 광범위한 항종양 효과가 있으며 세포독성이 상대적으로 낮습니다[4]. 그러나 그것의 부적절한 용해도, 불안정성 및 열악한 생체이용률은 임상 적용을 극도로 제한합니다[5, 6]. 소수성 약물의 용해도와 생체 이용률을 향상시키기 위해 소수성 약물과 친수성 물질인 oHA(oligomeric hyaluronic acid)를 결합하여 잘 설계된 많은 나노 물질이 제작되었습니다[7]. 우리는 자체 조립을 통해 커큐민을 고분자 미셀에 로딩하여 안정성이 좋고 혈액 순환에서 약물 반감기를 연장할 수 있는 일종의 양친매성 고분자-약물 접합체를 나노운반체로 설계했습니다. 작은 입자 크기의 마이셀은 종양 혈관 신생의 EPR 효과를 통해 효과적으로 고형 종양에 수동적으로 축적되어 더 나은 치료 효과를 얻을 수 있습니다[8, 9].
oHA는 HA의 분해에서 파생된 작은 분자로, 우수한 친수성, 생체 적합성, 혈장 내 안정성 및 세포 표면의 CD44 수용체에 대한 표적화와 같은 고유한 특성을 가지고 있는 반면[7, 10, 11], CD44 수용체는 과발현됩니다. 폐암 세포와 유방암 세포에서는 정상 세포에서 발현이 낮습니다[12]. 종양 세포는 정상 인간 세포와 달리 글루타티온(GSH, 2–10mM), 낮은 pH 및 일부 효소를 포함한 고유한 세포 신호를 가지고 있습니다[13,14,15,16,17,18,19,20 ], 이황화 결합은 환원 감도를 가지며 세포질에서 환원된 GSH의 작용으로 골절될 수 있습니다[21, 22].
미토콘드리아는 세포 생존에 필수적인 소기관이며 에너지 생산 및 세포자멸사 경로에서 중요한 역할을 합니다[23,24,25,26,27]. 따라서 미토콘드리아는 이전 보고서에서 암 치료에 적용되는 세포내 표적으로 오랫동안 간주되어 왔다[28]. 세포 소기관 중 미토콘드리아의 더 높은 막 전위로 인해 트리페닐포스핀, 트리페닐메틸포스포늄 및 기타 종류의 친유성 양이온은 지질 이중층 친수성 장벽을 통해 미토콘드리아에서 쉽게 풍부해질 수 있습니다[29, 30].
본 연구에서는 Cur의 용해도를 높이고 암세포에 대한 특이성을 높이기 위해 CD44 수용체와 미토콘드리아를 표적으로 하는 oHA, TPP, 이황화결합, Cur로 구성된 고분자-약물 접합체를 설계 및 합성하였다. . 또한 환원감도가 있어 형광 마커로 사용할 수 있다. 이 다기능 신규 나노캐리어는 (5-카르복시펜틸)트리페닐포스포늄 브로마이드, 올리고머 히알루론산, 이황화 결합 및 커큐민(TPP-oHA-S-S-Cur)의 이름을 따서 명명되었습니다. Cur는 물에서 자가 조립을 통해 TPP-oHA-S-S-Cur 미셀에 로딩되었습니다[1, 31]. Cur를 캡슐화한 고분자 TPP-oHA-S-S-Cur 미셀(이하 Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 미셀)은 치료 효능과 커큐민의 약물 로딩을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라 부작용을 줄일 수 있습니다. 종양 조직을 표적으로 한 후 Cur/TPP-oHA-SS-Cur 미셀은 CD44 매개 엔도사이토시스를 통해 세포에 침투한 다음 미토콘드리아를 표적으로 하고 높은 GSH(2-10 mM)에 반응하여 이황화 결합이 끊어져 약물의 빠른 방출(그림 1). 여기에서 우리는 이 새로운 미토콘드리아 및 CD44 수용체 이중 표적 산화환원 민감성 다기능 나노입자가 종양 표적 약물 전달 시스템을 위한 새로운 플랫폼이 될 것이라는 가설을 제안할 수 있습니다. 본 연구에서는 미셀을 준비한 후 Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 미셀의 특성에 대한 몇 가지 예비 조사를 수행했습니다.
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미토콘드리아 및 CD44 수용체 이중 표적 산화환원 민감성 나노입자의 개략도
방법
자료
커큐민(Cur, Shanghai Zhanyun Chemical Co. Ltd); 올리고머 히알루론산(oHA, Mn =10kDa, Shandong Freda Biological Engineering Co. Ltd.); 3,3'-디티오디프로피온산은 Adamas Reagent Co. Ltd.(Shanghai, China)에서 제공했습니다. (5-카르복시펜틸)트리페닐포스포늄브로마이드(TPP), 무수 테트라히드로푸란(THF), 디메틸술폭시드(DMSO), 트리에틸아민(TEA), 1-에틸-(3-2메틸아미노프로필)탄화카르보디이미드염산염(EDC), 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP)은 Aladdin Chemistry Co. Ltd.에서 얻었습니다. 다른 모든 시약은 분석 등급이며 Sinopharm Group Chemical Reagent Corp.에서 공급했습니다.
TPP-oHA-S-S-Cur의 합성 및 특성화
다기능 나노캐리어는 그림 2와 같이 3단계로 합성되었습니다.
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TPP-oHA, S-S-Cur 및 TPP-oHA-S-S-Cur의 합성 경로
1단계
TPP는 이전에 보고된 방법을 사용하여 에스테르 결합을 통해 oHA와 결합되었습니다[32]. 먼저 TPP, EDC, DMAP을 DMSO에 녹여 60°C에서 1시간 동안 반응시켰다. 그런 다음 oHA를 DMSO:H2에 용해했습니다. 오(v /v =1:1) 실온에서 8시간 동안 위의 반응을 여기에 추가했습니다. 반응 혼합물을 48시간 동안 탈이온수에서 투석 백(MWCO 2000 Da)으로 투석하여 불순물을 제거하고 동결 건조하여 TPP-oHA 중합체를 얻었다.
2단계
간단히 말해서, 3,3'-디티오디프로피온산을 THF에 용해시키고 옥살릴 클로라이드에 의해 활성화시켰다. 그 다음, 혼합물을 TEA에 의해 촉매된 Cur와 반응시켰다. 얻어진 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 순수한 생성물 S-S-Cur를 얻었다.
3단계
S-S-Cur, EDC, DMAP를 DMSO에 녹여 60°C에서 2시간 동안 활성화한 후, 상기 용액에 TPP-oHA를 넣고 상온에서 24시간 동안 반응시켰다. 혼합물을 투석관(MWCO 2000 Da)이 있는 증류수에서 48시간 동안 투석한 후 동결건조하여 최종 생성물인 TPP-oHA-S-S-Cur를 얻었다.
TPP-oHA, S-S-Cur 및 TPP-oHA-S-S-Cur의 구조는
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로 확인되었습니다. HNMR(Advance Bruker 400M; Switzerland Bruker Company, Madison, WI, USA), 중수소화된 DMSO-d6 사용 , CD3 Cl 및 DMSO-D6 :D2 O (DMSO-d6 :D2 O =1:1, v /v )를 각각 용매로 사용합니다.
미셀의 준비 및 특성화
TPP-oHA-S-S-Cur 미셀과 oHA-Cur 미셀은 모두 투석 방법에 의해 제조되었다[33]. 먼저 TPP-oHA-S-S-Cur(10mg) 및 커큐민(1.5mg)을 포름아미드(6mL)에 용해했습니다. 그런 다음, 혼합물을 어두운 곳에서 24시간 동안 투석 백(MWCO 2000 Da)이 있는 탈이온수에서 투석하여 유기 용매를 제거했습니다. 그 후, 투석된 용액을 2500rpm에서 10분 동안 원심분리하여 언로딩된 Cur를 제거했습니다. 마지막으로 미셀 현탁액을 0.45μm 주사기 필터 멤브레인을 통해 여과했습니다. 동일한 방법으로 단일 기능성 oHA-Cur 미셀을 얻었다.
Cur-loaded 미셀의 입자 크기, 제타 전위 및 다분산 지수(P.I.)는 Delsa Nano C(Beckman Coulter Inc.)에 의해 관찰되었습니다. Cur-loaded 미셀의 형태는 투과전자현미경(TEM, H-600; Hitachi, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다. Cur-loaded 미셀의 안정성은 Delsa Nano C에 의해 20% FBS를 포함하는 PBS에서 수행되었습니다.
포획 효율(EE) 및 약물 로딩(DL)은 막 여과 방법으로 측정하였다. 0.45μm 멤브레인으로 여과한 후, 얻어진 용액을 425nm에서 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, Agilent Technologies)로 측정하여 EE 및 DL을 얻었다. 미셀의 EE 및 DL을 계산하는 방정식은 다음과 같습니다.
Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 미셀의 세포내 GSH 산화환원 반응성은 투석 방법을 사용하여 평가되었습니다. Cur/TPP-oHA-SS-Cur 미셀 현탁액(50μg curcumin/mL) 4밀리리터를 투석 백(MWCO 7000Da)에 넣고 PBS(pH 7.4, 45% 소 태아 혈청 함유) 45mL에 대해 투석했습니다. 및 0.5% Tween 80) GSH 수준(0, 10, 2, 10mM)이 다릅니다. 원심분리기 튜브의 샘플은 100rpm으로 진탕 배양기(BS-2F, Changzhou, China)에서 37°C로 유지되었습니다. 미리 정의된 시간 간격(0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120시간)에서 원심분리기 튜브에서 2mL의 방출 매질을 취하고 동일한 부피로 보충했습니다. 상응하는 신선한 배지 및 Cur의 농도를 HPLC로 분석하였다. 각 실험은 3회 반복 실행되었습니다.
세포 배양
MDA-MB-231 인간 유방암 세포는 10% FBS(fetal bovine serum)가 포함된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM, Hyclone)에서 배양되었습니다. CD44 수용체는 MDA-MB-231 세포에서 높게 발현되었으므로 MDA-MB-231 세포주를 선택하고 37°C, 5% CO2의 가습 인큐베이터에서 배양했습니다. 분위기가 보완되었습니다.
체외 세포독성 분석
TPP-oHA-S-S-Cur의 시험관내 세포독성 분석은 MTT 방법으로 평가하였다[32]. MDA-MB-231 세포(고발현 CD44 수용체)는 1 × 10
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의 밀도로 배양되었습니다. 96웰 플레이트의 세포/웰. 다양한 농도의 Cur(0.5, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 및 40μg/mL)를 포함하는 100마이크로리터의 유리 Cur, Cur/oHA-Cur 미셀 및 Cur/TPP-oHA-SS-Cur 미셀 대조군으로서 PBS를 첨가하는 동안, 상이한 웰에 첨가하였다. 24시간 동안 인큐베이션한 후 100μL의 MTT 용액(5mg/mL)을 각 웰에 첨가한 다음 4시간 동안 인큐베이션했습니다. 그런 다음 MTT를 100μL DMSO로 교체하고 셰이커 인큐베이터에 넣어 포르마잔 결정을 용해했습니다. 20분 동안 배양한 후 570nm에서 마이크로 플레이트 리더(Thermo Fisher Scientific Co., Waltham, MA)를 사용하여 흡광도를 측정했습니다.
체외 세포 흡수 및 미토콘드리아 국소화
Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 미셀 및 Cur/oHA-Cur 미셀의 세포 흡수에 대한 정성적 분석은 형광 현미경(Eclipse E400; Nikon Corporation, Tokyo, Japan)을 사용하여 관찰되었습니다. MDA-MB-231 세포를 웰당 5000개 세포의 밀도로 24웰 플레이트에 시딩하고 10% FBS를 함유하는 DMEM(1mL)과 함께 배양한 다음 5% CO에서 37°C에서 24시간 동안 배양했습니다. 2 . 그 후, 약물이 로딩된 미셀(Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 미셀 및 Cur/oHA-Cur 미셀)이 있는 신선한 배양 배지(1mL)를 각 웰에 첨가했습니다. 세포는 대조군으로 작용하는 유리 Cur와 함께 배양되었고; 최종 Cur 농도는 20μg/mL였습니다. 또한, 세포를 다양한 시간 간격 동안 약물과 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포를 PBS로 3회 세척하고 4% 파라포름알데히드로 15분 동안 고정했습니다.
또한 Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 미셀의 CD44 표적화 능력을 평가하기 위해 HA(2 mg/mL)를 대조군으로 배지에 첨가하여 CD44 수용체에 결합했습니다.
또한, 세포 내에서 Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 미셀 및 Cur/oHA-Cur 미셀을 찾기 위한 세포 미토콘드리아에 라벨을 붙이기 위해 세포를 미토콘드리아 추적기(Mito-tracker Red CMXROS)와 함께 15분 동안 추가로 배양했습니다. 마지막으로 세포를 세 번 세척하고 형광현미경으로 관찰하였다.
유세포분석
정량적 분석은 유세포 분석을 사용하여 측정되었습니다. MDA-MB-231 세포를 10
5
의 밀도로 6웰 플레이트에 접종했습니다. 10% FBS가 포함된 2mL의 배지에 세포/웰을 넣고 위의 설명과 같이 처리합니다. Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 미셀 및 Cur/oHA-Cur 미셀(20μg Cur/mL)과 다른 시간 간격으로 배양한 후 세포를 PBS로 3회 세척하고 0.25% 트립신으로 트립신 처리했습니다. 그런 다음 세포를 1500rpm에서 5분 동안 원심분리했습니다. PBS(0.5mL)에 재현탁한 후 세포를 유세포 분석(EPICS XL, Beckman, USA)으로 분석했습니다.
통계 분석
데이터는 평균 ± SD(n =3). 또한 SPSS 소프트웨어(ver. 20, USA)를 사용했습니다. 데이터는 *p 확률 수준에서 유의미한 차이에 대해 분석되었습니다. <0.05(유의함) 일원 분산 분석(ANOVA) 사용
결과 및 토론
운반 물질 TPP-oHA-S-S-Cur 특성화
TPP-oHA, S-S-Cur 및 TPP-oHA-S-S-Cur의 합성 경로는 그림 2에 나와 있습니다.
또한
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oHA, TPP-oHA, S-S-Cur 및 TPP-oHA-S-S-Cur의 HNMR 스펙트럼은 그림 3에 나와 있습니다. TPP-oHA는 TPP와 oHA에 의해 합성되었습니다. TPP에서 3개의 벤젠 고리의 특징적인 피크는
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에서 7.570–7.717ppm에서 나타났습니다. TPP-oHA가 성공적으로 합성되었음을 확인한 TPP-oHA의 HNMR 스펙트럼. 또한, S-S-Cur는 3,3'-dithio-dipropionic acid와 Cur에 의해 합성되었습니다. 또한, TPP-oHA-S-S-Cur는 TPP-oHA 및 S-S-Cur에 의해 합성되었다. TPP-oHA-S-S-Cur의 TPP는 7.570~7.717ppm 범위에서 나타났습니다. Cur의 특징적인 피크는
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에서 관찰되었습니다. 6.795–7.467 ppm에서 S-S-Cur 및 TPP-oHA-S-S-Cur의 HNMR 스펙트럼 및 proton 피크(-CH2 -S-S-CH2 -) TPP-oHA-S-S-Cur에 따라 2.502ppm에서 3,3-디티오디프로피온산이 관찰되었습니다. 이러한 결과는 TPP-oHA-S-S-Cur의 성공적인 합성을 확인시켜주었다.
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oHA, TPP-oHA, S-S-Cur 및 TPP-oHA-S-S-Cur의 HNMR 스펙트럼
TPP-oHA-S-S-Cur Micelles의 준비 및 평가
약물이 로딩된 미셀의 입자 크기, 다분산 지수, 제타 전위, DL 및 EE는 표 1에 나와 있습니다. Cur/oHA-Cur 미셀 및 Cur/TPP-oHA-SS-Cur 미셀의 평균 크기는 145.5 ± 각각 2.1 및 122.4 ± 4.6nm입니다. 이는 TPP가 Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 미셀 표면의 물리화학적 특성을 변화시켜 두 미셀의 차이를 일으키기 때문일 수 있습니다. 그리고 Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 미셀의 DL 및 EE는 TPP-oHA로 제조한 일반 미셀보다 높았다. 또한 Cur/TPP-oHA-SS-Cur 미셀은 Cur/oHA-Cur 미셀(- 19.17 ± 0.55 mV)보다 음의 제타 전위(− 21.56 ± 1.46 mV)가 더 강하여 TPP-oHA의 안정성이 향상되었음을 나타냅니다. -SS-Cur는 주로 TPP의 존재로 인한 미셀의 응집으로 인한 것입니다.
또한, TPP-oHA-SS-Cur 미셀의 외관, 입자 크기 분포, 제타 전위 및 TEM 이미지 특성이 그림 4에 나와 있습니다. 결과는 Cur/TPP-oHA-SS-Cur 미셀이 거의 구형인 것으로 나타났습니다( 그림 4d), 균일하게 분포되어 있으며(그림 4b), 평균 직경은 약 122.4 ± 4.6nm입니다. 또한 Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 미셀의 다분산 지수는 0.132로 0.2보다 작아 미셀 크기의 균일성을 나타내어 TEM과 일치했습니다(그림 4c).
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외모(a ), 입자 크기 분포(b ), 제타 전위(c ) 및 TEM 이미지(d ) TPP-oHA-S-S-Cur 미셀의 특성화
표 1에 나타난 바와 같이 Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 미셀의 입자 크기는 FBS를 포함하는 PBS보다 PBS에서 더 작았습니다. 2시간에서 24시간 사이에 크기는 FBS를 포함하는 PBS에서 133.45 ± 6.8에서 160.27 ± 7.1 nm로 변경되었습니다. 이 현상은 Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 미셀이 생체 내에서 더 나은 안정성을 유지할 수 있음을 나타냅니다.
미셀의 체외 약물 방출 연구
TPP-oHA-S-S-Cur의 산화환원 감수성은 다양한 GSH 농도의 미셀에 의해 연구되었습니다. GSH의 존재 또는 부재 하에 Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 미셀로부터의 Cur 방출은 종양 환경을 시뮬레이션하기 위해 수행되었다. 그림 5에서 볼 수 있듯이 GSH가 없는 배지에서는 120시간 이내에 TPP-oHA-SS-Cur에서 32.5% Cur만 방출되었으며 배지에 10μM GSH를 추가하면 약간 증가(37%)했습니다. . 대조적으로, 2mM GSH와 10mM GSH를 가진 그룹의 약물 방출은 각각 57.5%와 75.3%였습니다. 이는 GSH 농도에 따라 약물 방출이 증가함을 확인하였다. 이 결과는 TPP-oHA-S-S-Cur의 이황화 결합을 파괴한 것에 기인하며, 이는 Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 미셀이 환원 감도를 가지고 있음을 나타냅니다.
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다양한 GSH 농도에서 Cur-loaded TPP-oHA-S-S-Cur 미셀의 시험관 내 방출(n =3)
세포독성 연구
MDA-MB-231 세포에서 다양한 커큐민 제형의 세포독성을 MTT 분석으로 연구했습니다. 그림 6에서 볼 수 있듯이, curcumin 제형의 농도에 따라 24시간에 세포 생존율이 다릅니다. Cur가 포함된 미셀은 유리 Cur보다 독성이 적었으며, 이는 고분자 물질이 세포의 세포 독성을 크게 감소시켰음을 설명할 수 있습니다. 한편, 도 6b는 농도 의존적 세포 생존율 프로파일을 나타낸 반면, Cur/TPP-oHA-SS-Cur 미셀은 Cur/oHA-Cur 미셀 및 기타 제형보다 가장 낮은 세포 생존율을 나타내어 Cur/TPP- oHA-SS-Cur 미셀은 세포에 쉽게 들어가 GSH 효과 하에서 약물을 방출했습니다. IC50 MDA-MB-231 세포에서 유리 Cur, Cur/oHA-Cur 미셀 및 Cur-TPP-oHA-SS-Cur 미셀의 값은 각각 6.534, 5.092 및 3.871μg/mL로 Cur의 더 나은 세포 독성을 나타냈습니다. - MDA-MB-231 세포의 TPP-oHA-SS-Cur 미셀.
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아 24시간 배양 후 커큐민 제형의 세포독성. 데이터는 평균 ± SD(n =6). *p <0.05, 자유 Cur와 비교. ㄴ Cur 농도가 다른 Cur-loaded 미셀의 세포독성(0.5, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40μg/mL) IC50 유리 Cur, Cur/oHA-Cur 미셀 및 Cur-TPP-oHA-SS-Cur 미셀의 값은 각각 6.534, 5.092 및 3.871μg/mL였습니다.
또한, 블랭크 미셀은 Cur가 화학적 방법에 의해 폴리머에 연결되어 있기 때문에 특정 독성이 있었습니다(그림 6). 이것은 미셀의 약물 로딩 용량을 증가시키고 항종양 효과를 향상시킬 것입니다.
세포 흡수의 형광 현미경 이미지
유리 Cur, Cur/oHA-Cur 미셀 및 Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 미셀의 세포 흡수를 형광 현미경으로 연구했습니다. 이번 연구에서 Cur 자체는 항암제일 뿐만 아니라 녹색 형광 프로브이기도 했다. 그림 7에서 볼 수 있듯이 Cur/oHA-Cur 미셀과 Cur/TPP-oHA-SS-Cur 미셀은 모두 세포주에서 좋은 세포 흡수를 보였고 형광 강도는 시간에 정비례했지만 형광 강도는 4시간 한편, Cur/oHA-Cur 미셀을 처리한 그룹의 형광 강도는 동일한 시점에서 유리 Cur 그룹보다 더 강하였다. 이것은 CD44 수용체를 표적화하는 능력을 가진 oHA-Cur가 약물의 세포 내로의 진입을 촉진하기 때문일 수 있습니다. 또한 Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 미셀의 산화환원 민감성 능력 덕분에 형광 신호가 Cur/oHA-Cur 미셀보다 분명히 높았습니다. Cur 축적을 강화함으로써 세포독성 연구의 결과와 일치하는 암세포의 세포독성 및 세포사멸에 의해 유도될 것입니다.
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자유 Cur의 세포 흡수에 대한 형광 현미경 이미지(a ), oHA-Cur/ Cur-micelles(b ) 및 TPP-oHA-S-S-Cur/Cur-micelles(c ) 다른 시간에. d 유리 HA(2mg/mL)가 있는 상태에서 TPP-oHA-S-S-S-Cur/Cur-micelles로 처리한 세포로, MDA-MB-231 세포에서 HA의 완성 효과를 보여줍니다.
또한, HA가 있는 Cur/TPP-oHA-SS-Cur 미셀 그룹의 형광 강도는 HA 그룹이 없는 그룹보다 낮았는데, 이는 아마도 유리 HA 분자가 CD44 수용체를 점유한다는 사실 때문일 가능성이 높아 표적화 능력이 추가로 입증되었습니다. CD44에 대한 TPP-oHA-SS-Cur.
또한, TPP-oHA-S-S-Cur의 미토콘드리아 국소화는 Mito-tracker Red CMXRos로 염색하여 MDA-MB-231 세포주에서 확인되었습니다(그림 8). 이미지는 Cur/TPP-oHA-SS-Cur 미셀의 녹색 형광이 미토콘드리아 추적기의 적색 형광과 멋지게 중첩되어 약물이 암세포의 미토콘드리아에 축적될 수 있음을 나타내고 TPP-oHA-SS -Cur는 미토콘드리아를 표적으로 삼았습니다.
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미토콘드리아 현지화. 미토콘드리아 국소화는 유리 Cur(a ), oHA-Cur(b ) 및 TPP-oHA-S-S-Cur(c ); 스케일 바:100μm
유세포분석
평균 형광 강도(MFI)는 유세포 분석으로 측정되었습니다. 그림 9에서 볼 수 있듯이 Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 미셀과 Cur/oHA-Cur 미셀과 함께 배양된 MDA-MB-231 세포의 MFI는 투여 시간에 정비례했습니다. 공초점 현미경 관찰과 일치하게, Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 미셀로 처리된 세포의 MFI는 동일한 시점에서 Cur/oHA-Cur 미셀 그룹보다 유의하게 더 높았습니다(p <0.05).
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다양한 Cur 제형(20μg Cur/mL)과 함께 배양된 MDA-MB-231 세포의 형광 강도. 평균 ± SD(n =3). *p <0.05, 일원 분산 분석
결론
이 연구에서는 Cur의 용해도와 치료 효과를 높이고 기존 요법의 부작용을 줄이며 약물의 종양 표적화를 증가시키기 위해 산화 환원 반응 이황화 결합을 연결 암으로 사용하고 미토콘드리아 및 CD44 수용체 이중 표적을 구축했습니다. 산화 환원 반응 고분자 약물 접합체(TPP-oHA-SS-Cur). TPP는 미토콘드리아를 표적으로 하고, 항종양 약물 Cur는 소수성 부분으로 작용하고, oHA를 표적으로 하는 CD44 수용체는 친수성 부분으로 작용합니다. Cur는 모델약물로서 양친매성 블록공중합체에 담지되어 자가조립을 통해 미셀을 형성하였다.
Cur를 화학적 방법과 물리적 방법으로 캡슐화한 이 약물 전달 시스템은 DL/EE를 향상시킬 뿐만 아니라 안정성과 혈액 순환 시간을 증가시켜 더 나은 종양 표적화를 달성할 수 있습니다. 시험관 내 약물 방출 테스트는 TPP-oHA-SS-Cur의 이황화 결합이 종양 세포에서 높은 GSH(2-10 mM)의 영향에 의해 끊어진 후 약물의 빠른 방출이 뒤따르는 감소를 입증했습니다. 예민한. 세포 흡수, 미토콘드리아 국소화 및 세포 독성의 결과는 Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 미셀이 CD44 수용체 표적화 능력과 미토콘드리아 표적화 능력을 가짐을 보여주었다. 다음 단계에서는 생체 내에서 Cur/TPP-oHA-S-S-Cur 미셀의 항종양 활성을 평가할 것입니다.
또한, 본 연구에서 개발된 이 스마트 다기능 나노캐리어 플랫폼은 용해도, 안정성 및 치료 효능이 현저히 개선된 소수성 약물에 사용될 가능성을 보여주었다. 한편, 이 방법은 종양 치료에 대한 새로운 아이디어를 제공했습니다.
