다이제인 장기 순환 리포솜의 제조 및 약동학 연구

방법

자료

대두 포스파티딜 콜린(SPC)은 Lipoid GmbH(독일)에서 구입했습니다. 콜레스테롤과 DSPE-mPEG2000은 AVT Pharmaceutical Co., Ltd.(Shanghai, China)에서 구입했습니다. HPLC 등급 메탄올 및 아세토니트릴은 TEDIA Company(USA)에서 구입했습니다. 클로로포름 및 메탄올(분석 등급)은 Sinopharm Chemistry Reagent Co., Ltd.(Shanghai, China)에서 입수했습니다. 물은 Milli-Q® 정수 시스템(Millipore, USA)으로 정제했습니다. Daidzein(순도 ≥ 98%)은 Yuanye Biotechnology Co., Ltd.(Shanghai, China)에서 구입했습니다. Apigenin(내부 표준, IS, ≥ 98% 순도)는 Delge Pharmaceutical Technology Co., Ltd.(중국 난징)에서 구입 인산염 수화물(분석 등급)은 Macklin Co., Ltd.(중국 상하이)에서 구입 Tween-80 및 에틸 아세테이트는 Sigma(미국 미주리)에서, 포름산(MS 등급)은 Fischer(미국)에서 구입했습니다.

동물

10마리의 수컷 Sprague-Dawley 쥐(200–210 g)는 SCXK(E) 2017–0012 라이센스 번호로 후베이성 ​​질병 예방 및 통제 센터에서 구입했습니다. 동물 실험은 후베이 대학 윤리 위원회의 승인을 받았으며 실험 동물의 관리 및 사용 지침을 준수했습니다.

다이제인 장기 순환 나노리포솜(DLCL)의 제조

입자 크기와 캡슐화 효율(EE)을 평가 지표로 삼아 SPC 대 콜레스테롤(A)의 몰비, DSPE-mPEG2000 함량이 5%인 조건에서 약물(daidzein)을 총 지질(SPC 및 콜레스테롤)(w/w)(B), 수화 온도(C) 및 초음파 시간(D)으로 [21, 22] .

DLCL은 다음과 같이 간략하게 설명된 박막 증발-음파 처리 방법에 의해 제조되었습니다[21]:대두 포스파티딜콜린, 콜레스테롤, DSPE-mPEG2000 및 daidzein을 10 mL 클로로포름-메탄올(1:4, v/ v) 혼합물. 진공 및 40 °C(수조)의 조건에서 회전 증발 장치(RE-2000A, Shanghai Yi-Rong Biochemical Instrument Factory, China)에서 혼합물을 건조시켜 박막을 형성한 다음 20 mL로 수화시켰다. 얼음 욕조에서 24 분 동안 초음파 처리(80 w)에 의한 초순수. 리포솜 현탁액을 0.45μm 및 0.22μm 미세다공성 막을 차례로 여과하여 3회 압출하였다. 준비된 DLCL 용액은 4 °C에서 보관되었습니다. 장기 보존을 위해서는 DLCL 현탁액에 3% 자당(동결 보호제로 사용)을 첨가하고 - 20 °C에서 동결 건조 보존해야 합니다.

HPLC에 의한 DLCL의 Daidzein 측정

컬럼은 Phenomenex ODS 분석 컬럼(150 mm × 4.6 mm, 5 μm)으로, 컬럼 온도가 40 °C인 보호 컬럼(30 mm x 10 mm, 3 μm)에 연결되었습니다. 이동상은 10mM 수성 암모늄 아세테이트 용액(A)과 메탄올(B)로 구성되며 다음과 같이 구배 용출:0–3.0 min, 45% B에서 80% B로; 3.0–4.0 분, 80% B; 4.0–6.0 min, 80% B ~ 45% B. 유속은 1 mL/min입니다. 검출 파장은 240 nm였다. 주입 부피는 10 μL였다. daiazein의 선형 범위는 0.313–50 μg/mL이었고 회귀식은 y였습니다. =35,461x + 1802.4, R ² =0.9999. daidzein의 머무름 시간은 4.30 min이며 daidzein의 결정에 DLCL 제형의 간섭이 발견되지 않았습니다(그림 1). 분석 방법의 정밀도, 재현성, 안정성 및 시료 회수율을 엄격하게 조사하여 정량 분석의 요구 사항을 충족했습니다(표 1).

빈 리포솜의 일반적인 크로마토그램(a ), 다이드제인 참조 물질(b ) 및 DLCL 샘플(c )

직교 테스트에 의한 처방 스크리닝

입자크기와 캡슐화효율(EE)을 평가지표로 삼아 SPC와 콜레스테롤의 몰비(A), 약물(daidzein)의 질량비의 최적 매칭을 위해 4인자 3단계 직교설계를 수행하였다. DSPE-mPEG2000 함량이 5%인 조건에서 총 지질(SPC 및 콜레스테롤)(w/w)(B), 수화 온도(C) 및 초음파 시간(D)까지 [21, 22].

DLCL의 지름 및 형태

제조된 DLCL 용액의 입자 크기 및 제타 전위는 상온 230 V 및 50 HZ에서 레이저 입도 분석기(Zetasizer Nano90, Malven Instruments Limited, Worcestershire, UK)로 측정하였다. 제조된 DLCL 용액을 순수한 물로 10배 희석한 후 핀셋으로 동메쉬의 가장자리를 떼어내었다. 상온에서 건조하고 인텅스텐산 수용액(2%, w/v)으로 대조염색한 후 전계방출 투과전자현미경(JEM-2100(HR), JEOL Ltd.)을 이용하여 완전히 건조된 DLCL의 형태를 관찰하였다. , Tokyo, Japan) 가속 200 kV 및 송신기 LaB6에서.

EE 및 DLCL의 약물 로딩

준비된 DLCL의 EE 및 약물 로딩은 다음과 같이 명시된 투석 방법으로 분석되었습니다. (주) 투석백의 양끝을 단단히 묶고 투석백을 물(투석액) 20 mL에 담는다. 12시간 동안 진탕기로 진동시킨 후, 투석액 1mL를 취하여 12000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 유리 약물 농도(C ₁ ) 상층액에. (2) 제조된 DLCL 용액 500μL와 메탄올 2000μL를 15분 동안 vortexing하여 리포솜을 파괴한 다음 12000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 총 약물 농도(C ₀ ) 상층액에. (3) 준비된 DLCL 용액 10 밀리리터(V ₀ )를 동결건조하여 고체 분말 덩어리(W ₀ ). (4) EE 및 약물 로딩은 다음 공식에 따라 계산되었습니다.

체외 약물 방출

DLCL 및 유리 daidzein의 시험관 내 방출은 투석 방법에 의해 결정되었습니다. 모의 위액은 0.5% Tween-80을 포함하는 0.1 mol/L HCl(pH 1.2)이었고 모의 장액은 0.5% Tween-80을 포함하는 25 mM PBS 버퍼(pH 6.9)였습니다. 준비된 DLCL 용액 0.5mL를 분자량 차단이 8000-14,000인 투석 백에 넣고 각각 20mL의 두 방출 매질에 넣었습니다. 방출 시험 매질을 37 ℃에서 연속적으로 교반(100 rpm)하였다. 표시된 시점(0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 96, 120 및 144 h)에서 샘플의 분취량(1 mL )을 투석액에서 취한 다음 동일한 양의 새로운 방출 배지를 보충했습니다. 다이드제인(DMSO에 용해) 밀리리터당 1밀리그램을 대조군으로 사용하고 동일한 처리를 위해 위의 두 방출 매질에 각각 넣었습니다. Daidzein을 각 시점에서 측정하고 다음 공식에 따라 누적 방출 속도를 계산했습니다.

공식에서 V ₁ 각 시점의 샘플링 양, V ₂ 투석 배지의 부피, C ₁ ~C _나 각 시점에서 측정된 다이드제인의 농도이며, V ₀ 및 C ₀ 투석 백에 추가된 DLCL의 부피와 농도입니다.

쥐에서 DLCL의 약동학

10마리의 수컷 Sprague-Dawley 쥐를 무작위로 두 그룹으로 나누었습니다(n =5). 한 그룹은 daidzein(0.5% 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스에 현탁됨) 그룹이고 다른 그룹은 DLCL(물에 용해됨) 그룹입니다. 두 그룹의 daidzein 용량은 30 mg/kg이었습니다. 경구 투여 전, 랫트는 12시간 동안 금식하고 물을 마시게 하였다. 쥐의 위내 투여 후 daidzein 투여군은 3분, 5분, 10분, 15분, 30분, 45분, 60분, 45분, 61분, 5분, 10분, 15분, 30분, 45분, 61분, 5분, 45분, 61분, 5분, 5분, 10분, 15분, 45분, 61분, 5분, , 3 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 24 h 및 36 h. 한편, DLCL군은 1 min, 3 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min, 1.5 h, , 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 24 h 및 36 h. 혈액 샘플을 헤파린 처리된 원심분리관에 넣고 4000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고 혈장을 채취하여 - 80 °C에 보관하였다. 혈장 샘플에서 다이드제인의 함량은 시험된 쥐에서 약물-시간 곡선을 얻기 위해 확립된 LC-MS/MS 방법에 의해 결정되었습니다. DAS3.0 소프트웨어(Professional Member of Chinese Pharmacology Society, Shanghai, China)를 사용하여 비구획 모델로 약동학적 매개변수를 계산했습니다.

LC-MS/MS에 의한 쥐 혈장 내 다이다제인 측정

랫트 혈장 시료는 랫트 혈장(50 μL), 메탄올(10 μL), 메탄올(10 μL, 500 ng/mL)에 용해된 내부 표준(IS) 아피게닌 및 5% 포름산 수용액(100 μL)과 같이 전처리되었습니다. )를 깨끗한 1.5mL 시험관에 혼합했습니다. 간단히 와류-혼합한 후, 에틸 아세테이트 1.2mL를 혼합물에 첨가하였다. 실온에서 5분 동안 흔든 후, 혼합물을 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 생성된 상부 유기상(1 mL)을 또 다른 깨끗한 1.5mL 시험관으로 옮기고, 증발시키고 이동상(100 μL)에 재용해했습니다. 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 얻은 상층액을 LC-MS/MS 분석을 위해 수집했습니다. 쥐 혈장 샘플의 정량적 조건은 아래에 설명되어 있습니다. GL Inertsustain C18(100 mm × 2.1 mm, 3 μm)은 컬럼 온도 1.6 μm에서 Shim-pack Column Holder 가드 컬럼(5.0 mm × 2.0 mm, 1.6 μm)에 연결되었습니다. 40 °C; 0.2 mL/min의 유속으로 gradient elution은 50% B to 80% B (0–2.00 min), 80% B의 조건에서 물(A)-methanol(B)로 구성된 이동상을 사용하여 수행되었습니다. (2.00–4.00 min), 80% B ~ 50% B(4.00–6.00 min), 50% B(6.10–8.00 min). 주입 부피는 10 μL였다. 음이온 다중 반응 모니터링 모드(MRM)는 다이드제인(m /z 253.0 → 224.15) 및 IS(m /z 269.00 → 117.05). 다른 조건은 ESI 이온 소스, 가열 블록 온도 400 °C, DL 튜브 가열 온도 250 °C, 분무 가스(N ₂ ) 체적 유량 3.0 L/min, 건조 기체(N ₂ ) 체적유량 15.0 L/min, 이온스프레이 전압 - 4.5 V. daidzein과 내부표준물질(apigenin)의 머무름 시간은 각각 4.5 min과 5.4 min이었으며, 혈장 내 내인성 물질은 daidzein 측정에 지장을 주지 않았다. 및 내부 표준(그림 2). 정량적 방법론은 엄격하게 조사되었으며 생물학적 시료의 정량 분석 ​​요구 사항을 충족했습니다(표 2).

블랭크 혈장의 HPLC(a ), 다이드제인 + 아피게닌(내부 표준물질) + 공 혈장(b ) 및 혈장 샘플(c ). 1, 다이드제인; 2, 아피게닌(IS)

통계 분석

데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 표시됩니다. 통계적 비교는 일원 분산 분석(ANOVA)에 이어 Tukey의 테스트를 사용하여 이루어졌습니다. 값은 p에서 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. <0.05.

결과 및 토론

나노리포솜 특성에 대한 준비 과정의 효과

직교 시험 설계 및 시험 결과를 표 3에, 분산 분석 결과를 표 4에 나타내었다. 직관적 분석(표 3)에 따르면 4가지 인자가 입자 크기에 미치는 영향의 순서는 약물-지질 비율> SPC- 콜레스테롤 비율> 수화 온도> 초음파 시간은 캡슐화 효율에 거의 영향을 미치지 않았습니다. 분산 분석(표 4)은 약물-지질 비율을 보여주었습니다. SPC-콜레스테롤 비율은 입자 크기에 상당한 영향을 미칩니다. DLCL을 위한 최적의 준비 조건은 A₁이었습니다. B₁ C₂ D₁ , SPC 대 콜레스테롤의 비율은 55:40, 약물 대 지질의 비율은 1:10, 수화 온도는 50°C, 초음파 시간은 24 min이었습니다.

상기 최적화된 공정에 따라 3개의 배치의 DLCL을 병렬로 제조하였다. EE는 85.3 ± 3.6%, 약물 부하는 8.2 ± 1.4%였다. 평균 입자 크기는 156.1 ± 3.0 nm였으며 PDI는 0.294 ± 0.012이고 제타 전위는 - 49 ± 0.6 mV였습니다. DLCL의 입도 분포는 Fig. 3에 나타나 있으며, 이는 최적화된 제조 공정 조건에서 제조된 DLCL이 좁고 균일한 입도 분포를 가짐을 나타냅니다. TEM으로 관찰한 DLCL 입자의 모양과 구조는 원형 또는 타원형으로 기본적으로 균일한 크기를 보였다(Fig. 4).

<그림>

DLCL의 입자 크기 분포

<그림>

DLCL의 TEM 사진

Daidzein은 친수성 및 친유성 특성이 좋지 않은 대표적인 약물입니다. 인지질의 극성 말단에 대한 약물의 방향성 조합은 둘 모두를 고도로 분산된 상태로 만들 수 있습니다. 약물의 결정 특성이 억제되고 지용성이 증가하였다[11]. daidzein과 지질 이중층 사이의 상호작용에서 daidzein의 약 15%가 리포솜 막의 친수성 영역에 위치하고[23, 24], 나머지는 물/막 계면에 분포한다고 보고되었습니다[25]. TEM 결과에 따르면 DLCL의 이중구조가 뚜렷하였고 daidzein의 삽입은 지질의 이중구조에 영향을 미치지 않았다.

시험관 내 약물 방출에 대한 준비 과정의 영향

체외 방출 실험의 결과는 그림 5에 나와 있습니다. 모의 위액의 방출 매질(0.5% Tween-80을 포함하는 0.1 mol/L HCL)에서 daidzein의 누적 방출율은 1 h에서 약 85%였습니다. 12 h에 완전한 방출; DLCL은 1 h에서 18%, 12 h에서 60%, 48 h에서 100%를 방출했습니다. 모의 장액 방출 배지(0.5% Tween-80을 포함하는 25 mM PBS 버퍼, pH 6.9)에서 daidzein의 누적 방출율은 1 h에서 약 73%, 12 h에서 84%, 24 h에서 완전 방출; DLCL은 1 h에서 3%, 12 h에서 59%, 48 h에서 100%를 방출합니다.

<그림>

0.5% Tween 80 (a ) 및 0.5% Tween 80을 함유한 인산 완충액(pH 6.9)(b) ) (평균 ± SD, n =3)

체외 방출 실험의 결과, DLCL은 pH 1.2와 pH 6.9의 투석액에서 유의하게 서방성으로 나타났고, pH 1.2의 투석액이 pH 6.9의 투석액보다 방출 속도가 더 빨랐다. 이는 지질 이중층 구조가 산성 조건에서 취약하고 안정성이 좋지 않기 때문일 수 있습니다.

생체 내 약동학에 대한 준비 과정의 영향

daidzein과 DLCL의 단일 용량 경구 투여 후 daidzein의 평균 혈장 농도-시간 곡선은 Fig. 두 그룹의 iso-dose daidazein(30 mg/kg)에서 DLCL 그룹의 daidzein 혈장 농도는 항상 daidzein 그룹보다 높았습니다. AUC_0−t DLCL군에서 daidzein의 (단회투여 후 전체 흡수를 나타내며 약물 흡수 정도를 나타내는 혈장 약물 농도-시간 곡선 아래 면적)은 1515.52 ± 532.40μg/L*h로 1회 투여 후의 2.5배였다. 다이드제인 그룹(p <0.05). 또한 MRT_0−t (평균 체류 시간, 체내에서 63.2%의 약물 제거에 필요한 시간) 및 t _1/2 daidzein은 DLCL군이 daidzein군에 비해 각각 1.6배, 1.8배 연장되었다(p <0.05). 약동학적 결과는 DLCL이 daidzein의 경구 흡수를 촉진하기 위한 1차 통과 효과를 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라 서방 효과를 달성하기 위해 평균 체류 시간을 연장할 수 있음을 나타냅니다.

<그림>

daidzein의 단일 용량(30 mg/kg)의 경구 투여 후 DLCL 및 유리 daidzein의 평균 혈장 농도-시간 곡선(mean ± SD, n =5)

결론

자가유화 약물 전달 시스템(SEDDS), 고체 지질 나노입자(SLN) 및 나노구조 지질 담체(NLC)를 포함하는 나노 지질 담체는 용해도, 투과성, 위장 안정성, 및 약물의 경구 생체 이용률. SEDDS는 무수 등방성 오일, 유화제, 보조 유화제, 가용화제 및 약물로 구성됩니다. 위장관에서 지질의 유화를 통해 약물의 표면적 흡수와 투과성을 증가시키고 약물이 전신 순환에 들어가도록 촉진할 수 있습니다. 그러나 SEDDS는 약물 부하가 낮고 약물 결정화 및 생체 내 침전이 일어나기 쉽고 시험관 내 결과와 생체 내 결과 간의 상관 관계가 좋지 않습니다[26, 27]. SLN은 약물, 지질 및 계면 활성제로 구성됩니다. 독특한 입자 구조 특성과 제어 가능한 방출 이점으로 SLN은 항암제를 캡슐화하는 데 사용할 때 표적화를 크게 개선하고 암세포의 흡수를 촉진할 수 있습니다. 그러나 SLN은 친수성 약물 및 양이온 전하를 갖는 약물을 캡슐화하는 데 적합하지 않습니다[28]. NLC는 SLN보다 안정성이 높은 액체 및 고체 지질의 혼합물로 형성된 2세대 지질 나노입자입니다. 소수성 분자를 효과적으로 캡슐화하고 약물의 체내 체류 시간을 연장할 수 있지만 제조 비용이 높다[29].

daidzein의 열악한 경구 생체이용률을 개선하기 위해 최근 연구에서는 91.7±1.5%의 EE와 6.87배 증가된 AUC[11], daidzein-phospholipid complex loading lipid nanocarriers와 같은 새로운 약물 전달 시스템에 중점을 두었습니다. - EE가 85.9±2.7%로 AUC가 9배 증가한 자가조립 나노전달 시스템[12], EE가 81.9%, AUC가 5.57배 증가한 daidzein-PLGA 나노입자[13].

본 연구에서 최적화된 조건에서 제조된 DLCL의 EE 및 약물 로딩은 각각 85.3 ± 3.6% 및 8.2 ± 1.4%였다. pH 1.2 및 pH 6.9의 배지에서 DLCL의 시험관 내 완전 방출 시간은 유리 약물보다 각각 4배 및 2배 증가했습니다. 쥐에게 단일 용량의 다이드제인(30 mg/kg)과 DLCL(동일한 용량의 다이드제인 함유)을 경구 투여한 후, t _1/2 , MRT_0−t 및 AUC_0–t DLCL군에서 daidzein의 농도는 daidzein군에 비해 1.8배, 1.6배, 2.5배 증가했으며, 이는 DLCL이 경구 흡수를 촉진하고 쥐에서 daidzein의 평균 체류 시간을 연장함을 나타냅니다.

데이터 및 자료의 가용성

저자는 자료, 데이터 및 관련 프로토콜이 자료 이전 계약에서 과도한 자격 없이 독자에게 즉시 제공됨을 선언합니다. 이 연구 동안 생성되고 분석된 모든 데이터가 이 기사에 포함되어 있습니다.

약어

AUC:

시간 집중 곡선 아래 면적;

C _최대 :

피크 농도

DL 튜브:

용제 튜브

DLCL:

다이제인 장기 순환 리포솜

DSPE-mPEG2000:

디스테아로일 포스포에탄올아민-PEG2000

EE:

캡슐화 효율성

ESI:

전자분무 이온화

HPLC:

고성능 액체 크로마토그래피

IS:

내부 표준

LC-MS/MS:

액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석기

m /z :

질량 대 전하 비율

MPS:

단핵 식세포 시스템

MRM:

다중 반응 모니터링 모드

MRT:

평균 체류 시간

MS:

질량 분석기

PBS:

인산염 완충 식염수

PDI:

다분산 지수

PEG:

폴리에틸렌 글리콜

RSD:

상대 표준 유도;

SD:

표준편차

SEM:

평균의 표준 오차

SPC:

포스파티딜콜린

t _1/2 :

제거 반감기

TEM:

투과 전자 현미경

T _최대 :

최고 농도의 시간

단층 InSe에서 전기장 제어 간접-직접-간접 밴드 갭 전환 은 나노 입자가 포함된 복합 재료의 산화 그래핀은 항균 나노 플랫폼의 섬유모세포 및 내피 세포 세포 독성을 감소시킵니다.