생체분해성 산화아연 나노입자에 대한 예비 연구, 살아있는 유기체에 대한 철 전달의 잠재적 형태로서 Fe로 도핑된 산화아연

자료 및 방법

나노입자 합성

철이 도핑된 산화아연 나노입자(ZnO:Fe NPs)는 마이크로파 열수 기술을 사용하여 합성되었습니다. 방법은 잘 확립되어 있고, 상대적으로 저렴하고, 생물 친화적이며, 산업적으로 확장 가능하며, 다양한 산화물 [26,27,28]에 기능성 도펀트 [21,22,23,24,25]로서 다양한 외부 이온을 도입할 수 있습니다. 본 나노입자의 철 농도는 5% 몰로 설정하였다. 합성은 질산염(V):Zn(NO₃ )₂ ·6H₂ O(99%, Sigma–Aldrich) 및 Fe(NO₃ )₃ ·9H₂ 오(96%, 칼 로스). 우리는 다양한 공급업체를 테스트했으며 측정 가능한 수준의 비가용성 잔여물이 포함되지 않은 가장 균일한 제품을 제공하는 공급업체를 선택했습니다. 화합물을 증류수에 용해시켰다:17.63 g의 질산아연(V) 및 1.25 g의 질산철(III)(V). 그런 다음 맑은 용액을 25% 암모니아 수용액(Carl Roth)을 사용하여 pH 8로 알칼리화했습니다. 생성된 적색 잔류물을 Büchner 깔때기를 사용하여 ~1L의 증류수로 세척하고 흡입 여과했습니다. 침전물을 100ml 테플론 용기에 넣고 부피의 80%까지 물로 채운 다음 Ertec Magnum II 반응기 챔버를 닫았습니다. 마이크로파 열수 공정은 4 MPa에서 20 min씩 수행하였다. 반응 후, 옅은 적색 생성물을 수집하고 60 °C에서 밤새 건조시켰다.

나노입자의 특성

생성물의 특성화는 주사 전자 현미경(SEM), 광발광(PL) 및 음극발광(CL) 분광법 및 에너지 분산 원소 분석(EDX)을 사용하여 수행되었습니다. SEM 측정은 2차 전자(SE) 및 투과(TE) 모드에서 특성 방사선 검출기와 음극 발광 시스템 GATAN Mono CL3가 장착된 고해상도(1 nm) Hitachi SU-70 현미경으로 수행되었습니다. 여기 소스로 크세논 램프와 Hamamatsu R928P 광전자 증배관이 장착된 Horiba/Jobin-Yvon Fluorolog-3 분광형광계를 사용하여 광발광 방출 및 여기 스펙트럼을 기록했습니다. 동적 광산란(DLS) 및 제타 전위는 DelsaMax Pro 입자 특성화 시스템으로 측정되었습니다. 열중량 분석(TGA)은 아르곤 흐름 하에서 NETZSCH STA 449 F1 Jupiter 열중량 측정기를 사용하여 수행되었습니다. SEM 측정은 Agar 폴리카보네이트로 코팅된 400 구리 메쉬에 나노 입자를 증착한 후 수행되었습니다. Sonics VCX500 초음파 처리기를 이용하여 시료를 증류수에 현탁시킨 후, 현탁액을 메쉬에 떨어뜨려 건조시켰다. 더 무거운 입자를 2시간 동안 침전시킨 후 샘플을 준비했습니다.

체외 모델

본 연구에서는 위장관 상피세포의 모델로 Caco-2 세포주(백인성 결장 선암종 세포)를 사용하였다. 세포주는 European Collection of Authenticated Cell Cultures - ECACC(Sigma-Aldrich, Cat. No. 86010202)에서 입수했습니다. 세포를 0.5 × 10 ⁶ 으로 시딩했습니다. 세포/ml를 6-웰 또는 96-웰 플레이트에 넣고 10% 소 태아 혈청-FBS(Gibco), 1% 비필수 아미노산-NEAA(Gibco)가 보충된 Dulbecco's Modification of Eagle's Medium-DMEM(Gibco) ), 37 °C 및 5% CO₂에서 1% 페니실린-스트렙토마이신-네오마이신-PSN(Gibco) 및 0.2% 중탄산나트륨(Gibco) . 95-100% confluency가 관찰되면 세포 배양 배지를 제거하고 신선한 성장 배지에 ZnO:Fe NP의 현탁액을 추가했습니다. 세포를 37°C 및 5% CO2에서 24시간 동안 4가지 농도의 ZnO:Fe NP(1.0, 0.1, 0.01, 0.001 mg의 ZnO:Fe NPs/ml)와 함께 배양했습니다. .

세포 생존율 분석

XTT 분석 및 Trypan blue 염색의 두 가지 방법을 사용하여 Caco-2에 대한 세포 생존력을 평가했습니다. XTT 분석에 필요한 모든 시약은 상용 키트(Cell Proliferation Kit II, Roche)에서 제공되었습니다. 96웰 플레이트에서 다양한 농도의 ZnO:Fe NP로 배양한 세포를 배양한 후, 세포를 50㎕ XTT 라벨링 혼합물과 함께 37°C 및 5% CO2에서 4시간 동안 배양했습니다. . 그 후, 분광광도법으로 포르마잔의 농도를 평가하였다. 흡광도는 470/650 nm에서 측정되었으며 결과는 생존 세포의 수와 상관관계가 있었습니다. 다음 실험에서는 가장 높은 흡광도 결과를 세포의 100% 생존율로 가정하였다. 최종 결과는 4개의 개별 실험 복제를 기반으로 계산되었습니다(n =4).

트립판 블루 염색을 수행하기 위해 6웰 플레이트에서 성장한 세포를 다양한 농도의 ZnO:Fe 나노입자와 함께 배양한 후 세포를 수집하고(10분 동안 0.05% 트립신 및 0.2% EDTA), 원심분리하고 펠렛을 다시 채취했습니다. 1 ml 성장 배지에 현탁. 100μl의 멸균 0.4% 트립판 블루 용액을 100㎕의 세포 현탁액과 혼합했습니다. 10 마이크로리터의 샘플을 계수 슬라이드에 로드하고 생존 세포의 수를 평가하기 위해 JuLi Br Couting Software(NanoEnTek)를 사용하여 분석했습니다. 최종 결과는 3개의 개별 실험 복제를 기반으로 계산되었습니다(n =3).

동물 모델

이 예비 연구의 목적을 위해 성체, 수컷 Balb-c 마우스(n =6) 표준 식품과 물(자유롭게 제공됨)을 사용하여 표준 및 통제된 생활 조건(12/12-h 명암 기간, 25°C, 습도 30%)에서 개별적으로 유지되었습니다. 모든 절차는 지역 윤리 위원회, 동의 번호. WAW2017년 2월 59일. 순응 7일 후, 실험 그룹(n =4) . 대조군의 마우스는 IG(n)에 의해 0.3 ml의 식수를 받았습니다. =2). 실험하는 동안 우리는 실험 동물의 행동 변화나 조직 이상을 발견하지 못했습니다. 24시간 후, 실험군과 대조군 모두의 마우스를 CO₂에서 희생시켰습니다. -O₂ 후속 조직 수집과 함께 챔버(CO2 Box, Bioscape, Merazet). 새로 수집된 샘플의 절반을 원자 흡수 분광법(AAS)을 위해 -20 °C에서 동결했습니다. 조직의 후반부를 4% 완충 포르말린에 고정하고 70% 에탄올로 옮겼습니다(24시간 후). 이어서, 샘플을 파라핀(Leica TP1020, Leica EG1150)에 포매한 에탄올 농도를 증가시키면서 탈수하고 6μm 두께(또는 조직병리학적 검사의 경우 4 μm 두께)의 얇은 슬라이드를 마이크로톰(Leica RM2255)으로 준비했습니다.

Perl 염색으로 평가한 철분 축적

비장, 간 및 뇌의 현미경 슬라이드는 철의 존재에 대해 Perl의 방법(프러시안 블루)으로 염색되었습니다. 샘플을 탈파라핀화하고 증류수로 재수화한 다음 동일한 부분의 5% 페리시안화칼륨(Sigma-Aldrich) 및 5% 염산(Sigma-Aldrich)이 포함된 작업 용액에 넣고 30분 동안 염색했습니다. 그 후, 섹션을 물로 헹구고 5분 동안 핵 고속 적색(Sigma-Aldrich)으로 역염색하고, 물로 헹구고, Permount(Fisher Scientific)로 커버슬립 아래에 장착했습니다. Olympus BX60 현미경과 Cell^P 이미지 획득 소프트웨어를 사용하여 염색된 샘플의 이미지를 촬영했습니다. 테스트된 각 샘플에서 가정 내 이미지 분석 프로토콜[29]에 따라 MicroImage v.4.0(Olympus)을 사용하여 추가 검사를 위해 무작위로 선택된 16개의 이미지를 선택했습니다. 비장 검사의 경우 분석 중에 조직 내의 적색 펄프만 고려했습니다. 철 함량은 이미지 내의 세포핵 면적에 대한 철 양성 얼룩(파란색)의 면적 및 강도의 비율로 계산되었습니다.

원자 흡수 분광법으로 측정한 시험 조직의 철 농도

이전에 수집하고 -20 °C에 보관한 다음 해동한 조직 샘플을 이전에 자세히 설명된 프로토콜에 따라 원자 흡수 분광법(AAS) 방법으로 철 농도의 추가 정량적 평가를 위해 준비했습니다. 간단히 말해서, 조직의 무게를 측정하고 5 ml의 65% 질산과 1 ml의 30% 과산화수소(Merck)를 함유한 용액에서> 16시간 동안 보관했습니다. 그 후, 샘플을 마이크로웨이브 시스템 Ethos 900(Milestone, USA)에서 액체 용액으로 광물화하고 철 함량에 대해 AAS(Perkin-Elmer)로 평가했습니다.

통계 분석

연구에서 얻은 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 표시되었습니다. Perl 염색으로 얻은 철 축적에 대한 통계적 평가를 위해 모든 그룹에 대해 Tukey-Kramer 다중 비교 사후 테스트를 사용한 일원 ANOVA를 수행했습니다. AAS 분석에서 대조군과 실험군 간의 유의한 차이를 평가하기 위해 짝을 이루지 않은 t 테스트가 사용되었습니다. 시험관 내 실험에서 대조군과 실험군 간의 유의한 차이는 Dunnett 다중 비교 테스트와 함께 일원 분산 분석을 사용하여 평가되었습니다. 통계 분석은 GraphPad InStat 3.10으로 계산되었습니다. 모든 테스트에서 얻은 결과는 P로 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. ≤ 0.05 및 P ≤ 0.01 및 P ≤ 0.001은 매우 중요하고 매우 중요합니다.

결과

나노입자의 특성

마이크로웨이브 수열 공정에서 결정화된 ZnO:Fe 나노결정의 주사전자현미경(SEM) 이미지는 그림 1에 나와 있습니다. 합성 후 보관된 건조 분말을 초음파 수조를 사용하여 물에 분산시킨 다음 구리 400 메쉬 위에 증착합니다. 초음파 처리로 인한 현탁액은 큰 입자의 덩어리 및 침강을 위해 2 시간 동안 방치되었습니다. 샘플에서 일반적으로 길쭉한 육각 프리즘 형태의 ZnO 결정을 볼 수 있습니다. 결정은 c면 성장 방향으로 늘어납니다. [001]. 프리즘의 교차점이 이미지에 명확하게 표시됩니다. 육각형의 크기는 50–100 nm입니다. 기본적으로 나노 입자는 덩어리져 더 큰 구조를 형성합니다. 도 1b에는 ZnO:Fe 결정이 심하게 뭉쳐지고 그룹화된 구조가 나타나 있다. 샘플은 또한 수백 나노미터와 마이크로미터 사이의 크기 분포를 포함하는 불균일한 입자로 구성됩니다. ZnO 상 이외의 별도의 상이 존재한다는 명확한 표시는 없으며, 이는 철 기반 상(예:산화철) 결정화가 없음을 시사합니다[30].

큰 응집체의 침강 후 구리 메쉬에 증착된 ZnO:Fe NP의 주사 전자 현미경 이미지. 배율 100kx(a ) 및 20kx(b ). 물 1밀리리터당 1 mg의 ZnO 나노입자를 포함하는 현탁액을 폴리카보네이트 코팅된 구리 메쉬에 적가하여 고해상도 주사 현미경 관찰을 가능하게 했습니다.

상온에서 800 °C까지 아르곤의 흐름 하에서 열중량 분석(TGA)과 시차 주사 열량 측정(DSC)을 수행하였고 그 결과를 Fig. 2에 나타내었다. 첫 번째 질량 손실은 200 °C까지 발생하였고 초기 질량에 비해 샘플 질량이 4.78% 감소했습니다. 두 번째 손실은 200~400 °C 사이에 등록되었으며 그 값은 약 7.36%입니다. 800 °C까지 다른 질량 감소는 없었습니다. 첫 번째는 표면에 흡착된 물 분자의 증발과 관련이 있고 두 번째는 수산기의 환원으로 인한 것 같습니다. DSC 곡선은 118.3 °C에서 흡열 피크(- 0.6175 mW/mg, 수분 증발) 및 283.1 °C(0.4356 mW/mg, 수산기 분해)에서 발열 피크를 보여줍니다. 분해와 관련된 작은 효과는 ZnO:Fe 나노 입자의 거의 완전한 결정화가 마이크로파 열수 공정에서 발생했음을 나타냅니다.

아르곤에서 가열된 ZnO:Fe NP의 TGA/DSC

그림 3은 ZnO:Fe NP의 실온 광발광 스펙트럼을 보여줍니다. 방출 스펙트럼(그림 3a)은 낮은 강도의 NBE(Near-Band Edge) 발광과 매우 강렬한 DLE(Deep Level Emission) 발광의 두 가지 기능으로 구성됩니다. 첫 번째 것은 ~ 380 nm에서 피크이고 두 번째 것은 600 nm에서 피크입니다. 스펙트럼에서 DLE 강도의 우세는 얻은 나노결정이 결정학적 수준에서 강하게 결함이 있음을 시사합니다[31,32,33]. 여기 스펙트럼(그림 3b)은 ZnO:Fe 밴드갭의 깊은 수준에서 방출되는 메커니즘을 나타냅니다.

광발광(PL) 방출(a , λ_exc =260 nm) 및 여기(b) , λ_em =595 nm) ZnO:Fe NP의 스펙트럼. 샘플을 알루미늄 매트릭스에 느슨하게 부은 다음 PL 측정이 가능하도록 균형을 재조정했습니다. 2차 이상의 여기 파장은 스펙트럼 대역통과 필터로 필터링되었습니다.

ZnO:Fe NP의 음극 발광 스펙트럼은 그림 4에 나와 있습니다. DLE/NBE 강도 비율은 ≈ 25입니다. NBE 밴드는 ca. 380 nm, DLE 밴드는 ~ 570, 625, 653 nm에서 정점을 이루는 4가지 성분을 포함하고 770 nm에서 매우 약합니다. McCluskey와 Jokela[34]에 따르면 570nm 대역은 산소 결손과 관련이 있는 반면 다른 대역은 wurtzite 유형 격자의 아연 결손에 할당되었습니다[35].

ZnO:Fe NP의 음극 발광(CL) 스펙트럼. 건조 나노분말을 펠릿화하여 대량의 샘플에서 유래하는 CL 스펙트럼을 얻었다. 표시된 밴드는 산화아연 나노결정에 존재하는 결정학적 결함의 양과 품질을 나타냅니다.

샘플에서 철의 양은 원자 흡수 분광법(AAS)과 에너지 분산 X선 분광법(EDX)의 두 가지 기술을 사용하여 결정되었습니다. AAS의 경우 설치류 실험에서 사용된 것과 유사하게 제조된 현탁액은 ZnO:Fe에서 3.98 원자% Fe를 나타내는 것으로 분석되었다. EDX 방법으로 구리 메쉬에서 건조 분말을 분석하여 철의 농도가 4.5%at임을 확인했습니다. 아연 이온과 관련하여.

현탁액 특성은 그림 5에 표시된 나노입자 직경 분포와 함께 DLS 및 TEM 방법을 사용하여 측정되었습니다. 분포는 이중 모드입니다. 한 집단의 경우 가장 빈번한 직경은 20~100 nm(TEM) 및 50~100nm 사이에서 정점을 이루었습니다. 200 nm(DLS). 두 번째 모집단에는 100–500 nm(TEM) 및 ca. 150–500 nm(DLS). 나노 입자의 이중 모드 특성은 표시된 두 가지 방법 모두에서 명확하게 관찰됩니다. 더 큰 집단에서 크기의 높은 분산은 응집된 나노입자에 해당함을 나타냅니다. 100 nm 이상의 직경에 대해 표시된 통계는 ZnO:Fe 나노입자가 응집되는 다양한 방식을 나타냅니다. 물 현탁액의 나노 입자는 0V 미만의 제타 전위에 의해 밝혀진 바와 같이 음전하를 띠고 있습니다. 또한 약 -40 mV의 값은 최종 물 현탁액이 안정적이고 나노 입자가 응집에 대한 친화성을 갖지 않는다는 것을 나타냅니다.

물 현탁액(점)에서 측정되고 나노결정의 더 짧고 긴 면을 따라 TEM 이미지에서 직접 가져온 나노입자의 유체역학적 반경 분포(텍스트 참조). 나노 입자는 고출력 초음파 혼에 의해 물 현탁액으로 옮겨졌습니다. 건조 물질의 농도는 물 1 ml당 1 mg이었습니다. 침강이 완료된 후, 신뢰할 수 있는 이동도 대 나노입자 직경 플롯을 얻기 위해 이동도를 10번 측정했습니다. TEM 크기는 c를 따라 이미지에서 직접 가져왔습니다. 축(ZnO 결정의 긴 쪽) 및 m을 따라 그리고 a 축(크리스탈의 짧은 쪽)

ZnO:Fe 나노입자의 체외 독성 평가

두 세포 생존율 분석(XTT 및 Trypan Blue)은 ZnO:Fe NP와 함께 배양된 Caco-2 세포의 흡광도 감소를 나타내었으며, 이는 생존 세포의 수와 직접적인 상관관계가 있습니다. 통계적으로 유의한 변화는 배양된 세포를 가장 높은 농도의 NP(1.0 및 0.1 mg/ml)에 노출시킨 후에만 관찰되었으며 생리학적 수준의 NP 농도(0.01 및 0.001 mg/ml)는 세포 배양에 큰 영향을 미치지 않았습니다. (그림 6과 7).

세포 생존율(Caco-2 계통)은 XTT 방법으로 테스트했습니다. 세포를 다음과 같이 다양한 농도의 철로 도핑된 ZnO 나노입자 현탁액에 24시간 동안 노출시켰다:0.001mg/ml; 0.01 mg/ml; 0.1 mg/ml; 및 1 mg/ml. 결과는 대조군 및 실험군에 대한 생존 세포의 평균 백분율(±SEM)을 나타냅니다(n =4). **P의 상당한 차이 ≤ 0.01 vs. 대조군이 그래프에 표시되었습니다.

세포 생존율(Caco-2 계통)은 Trypan blue 염색으로 테스트되었습니다. 세포를 다음과 같이 다양한 농도의 철로 도핑된 ZnO 나노입자 현탁액에 24시간 동안 노출시켰다:0.001mg/ml; 0.01 mg/ml; 0.1 mg/ml; 및 1 mg/ml. 결과는 대조군 및 실험군에 대한 생존 세포의 평균 백분율(±SEM)을 나타냅니다(n =3). **P의 상당한 차이 ≤ 0.01 vs. 대조군이 그래프에 표시되었습니다.

동물 모델의 철 분포

ZnO:Fe 나노입자로부터 생체내 철 접근성을 평가하기 위해, 마우스(n =4) ZnO:Fe NP의 현탁액을 구두로 받았고 24시간 후, 중요한 조직을 추가로 수집하여 동물을 겁먹게 했습니다. 검사된 조직 내 철 함량의 정량적 평가는 수집된 모든 장기에 대해 AAS 방법으로 분석되었고 간, 비장 및 뇌 조직에 대해 Micro Image 소프트웨어(Perl 염색 기반)로 계산되었습니다. 그림 8에 제시된 데이터는 ZnO:Fe 나노입자를 경구 투여한 후 24시간 후 심장, 골격근, 비장 및 소장 조직에서 철 함량(대조군 대비) 증가 수준을 보여줍니다(통계적으로 유의한 증가 없음). 뼈의 경우, 실험군의 평균 철 농도는 대조군보다 약간만 높았다. 간 및 뇌 조직의 철분 함량이 크게 증가했습니다(P ≤ 0.01) ZnO:Fe NPs의 IG 후 24 h 대 대조군(그림 8). 신장, 내장 및 피하 지방 조직, 폐에서 Fe 수치는 ZnO:Fe 나노입자 투여 후 24시간 후에 떨어졌습니다.

ZnO:Fe NPs의 IG 투여 후 분석된 조직 내 철 분포 24 h. 데이터는 실험 그룹의 테스트 기관에서 Fe의 평균 백분율을 나타냅니다(n = 4) 대조군과 비교(100%-가로선). 철 함량은 AAS로 분석되었습니다. **P의 상당한 차이 ≤ 0.01 대 대조군

Perl의 방법으로 간 내에서 염색된 철분 함량의 평가는 매우 유의미한 것으로 나타났습니다(P ≤ 0.001) 모든 실험 대 대조군 동물에서 증가된 Fe 수준(그림 9b). 유사하게, 비장 조직의 적색 펄프에 대해 얻은 결과는 매우 유의미한 것으로 나타났습니다(P ≤ 0.001) 모든 실험 대 대조군 동물에서 철 함량의 증가(그림 10b). 뇌 조직 분석에서 얻은 데이터는 ZnO:Fe NP의 IG에 따라 실험군 24 h에서 Fe의 증가를 나타내지 않았습니다(그림 11b).

Perl의 염색 및 MicroImage 소프트웨어로 계산된 간의 철분 함량. 세포 핵의 면적에 대한 철 양성 염색의 면적 및 강도의 비율로 계산된 결과. 데이터는 각각의 검사된 동물에 대한 평균(±SEM) 결과로 표시됩니다(a ) 및 대조군과 실험군 모두에 대한 평균(±SEM) 값(b) ). *P의 상당한 차이 ≤ 0.05, **P ≤ 0.01 및 ***P ≤ 0.001

Perl 염색 및 MicroImage 소프트웨어로 계산한 비장의 적색 펄프 내 철 함량. 세포 핵의 면적에 대한 철 양성 염색의 면적 및 강도의 비율로 계산된 결과. 데이터는 각각의 검사된 동물에 대한 평균(±SEM) 결과로 표시됩니다(a ) and as mean (±SEM) value for both control and experimental groups (b ). Significant difference of *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, and ***P ≤ 0.001

Iron content in the brain calculated with Perl’s staining and MicroImage software. Results calculated as a ratio of area and intensity of iron-positive stains to the area of cell nuclei. Data presented as mean (±SEM) result for each, examined animal (a ) and as mean (±SEM) value for both control and experimental groups (b )

In case of content of iron from each animal of experimental and control groups, results were collected at the Figs. 9a, 10a, and 11a. The highest and significantly different (P ≤ 0.05 and P ≤ 0.01) level of iron within liver tissue was detected for mice – 2 (24 h 2), comparing with results from control group (Fig. 9a). Levels of iron stains in red pulps of the spleen within the experimental group were similar; however, most of them were statistically higher (P ≤ 0.05 or P ≤ 0.01) than mice – 1 (CTRL 1) from the control group (Fig. 10a). Results obtained for brain tissue were similar between each animal from experimental and control groups (Fig. 11a).

Sections of liver and spleen tissues stained with Perl’s method were also qualitatively assessed. Increased number of iron depositions (light blue stains) was visible within hepatocytes from liver sections of experimental group (Fig. 12).

Representative microphotographs of liver sections showing staining with Perl’s method. Comparison of the presence of iron (light blue areas) in control and experimental groups of mice (with ZnO:Fe NPs administered 24 h before sacrifice). The arrows point iron deposits in hepatocytes. × 40 lens

General greater accumulation of iron (blue stains) within the red pulp than in white pulp of spleen was observed in both control and experimental groups (Fig. 13). After application of ZnO:Fe NPs, the higher level of iron was particularly visible within the red pulp, comparing with images from control group (Fig. 13c, d). In experimental group, an increased concentration of iron was also noticeable around blood vessels (Fig. 13b, d).

Representative spleen sections following staining with Perl’s method. Comparison of the presence of iron (blue areas ) in control and experimental group of mice (with administered 24 h before ZnO:Fe NPs). Separate presented areas of the tissue:white pulp (a , b ) and red pulp (c , d ). The arrows point iron accumulated around blood vessels (circles). × 10 (a , b ) or × 20 (c , d ) lens