금속 및 금속 산화물 나노입자의 녹색 합성 및 단세포 조류 Chlamydomonas reinhardtii에 미치는 영향
초록
최근 금속 나노 입자의 녹색 합성은 실현 가능성이 높고 환경 영향이 매우 적기 때문에 많은 관심을 받고 있습니다. 이 접근법은 환원제로서 천연 폴리머 검 카라야를 사용하여 단순한 수성 매질에서 나노규모의 금(Au), 백금(Pt), 팔라듐(Pd), 은(Ag) 및 산화구리(CuO) 물질을 합성하기 위해 적용되었습니다. 안정제. 나노 입자(NP)의 제타 전위, 안정성 및 크기는 Zetasizer Nano, UV-Vis 분광법 및 전자 현미경으로 특성화되었습니다. 또한 단세포 녹조류(Chlamydomonas reinhardtii)에 대한 나노입자(농도 범위 1.0–20.0 mg/L)의 생물학적 효과 )은 조류 성장, 막 무결성, 산화 스트레스, 엽록소(Chl ) 형광 및 광계 II 광합성 효율. 생성된 나노입자의 평균 크기는 42(Au), 12(Pt), 1.5(Pd), 5(Ag) 및 180(CuO) nm였으며 6개월 동안 높은 안정성을 보였습니다. 5mg/L 농도에서 Au 및 Pt NP는 조류 성장을 약간만 감소시킨 반면 Pd, Ag 및 CuO NP는 성장을 완전히 억제했습니다. Ag, Pd 및 CuO NP는 강력한 살생물 특성을 보여 수영장(CuO) 또는 기타 항균 용도(Pd, Ag)에서 조류 예방에 사용할 수 있는 반면 Au 및 Pt는 이러한 특성이 부족하고 녹조류에 무해한 것으로 평가될 수 있습니다. .
<섹션 데이터-제목="배경">
배경
금속 및 금속 산화물 나노입자(NP)는 탁월한 전기적, 광학적, 자기적 및 촉매적 특성으로 인해 상당한 연구 관심을 받았습니다. 이것들은 다양한 산업, 의료, 농업 및 환경 응용 분야에서 광범위하게 사용할 수 있게 했으며 계속해서 개발 중인 추가 용도[1,2,3,4]입니다. 깨끗한 금속 및 금속 산화물 나노입자에 대한 전통적인 합성 방법에는 인간과 다른 영양 수준의 다른 종에 독성이 있는 화학 작용제를 환원 및 안정화시키는 것이 포함됩니다[5,6,7,8,9,10,11]. 이에 대한 대응으로 연구자들은 현재 나노입자 생산 과정에서 유해한 화학 물질을 줄이거나 제거하기 위한 대안적인 "녹색 합성" 접근 방식을 찾고 있습니다[12,13,14,15,16,17,18].
많은 연구에서 금속 및 금속 산화물 나노입자의 독특하고 광범위한 물리화학적 특성으로 인해 광범위한 금속 및 금속 산화물 나노입자 응용에 대해 보고했습니다[19]. 예를 들어 은(Ag) 나노입자는 의료, 섬유, 식품 포장 및 수처리 응용 분야에 널리 사용됩니다[20,21,22,23]. 금(Au) 나노입자는 생물의학 연구에 사용되어 왔으며 백금(Pt) 나노입자는 촉매 특성 때문에 산업 응용 분야에 널리 사용됩니다[24, 25]. 마지막으로, 팔라듐(Pd) 나노입자는 의약품 제조 시 촉매로 사용되어 왔으며[26, 27] 입증된 항균 특성으로 인해 페인트 및 직물의 방오제로 산화구리(CuO) 나노입자가 사용되었습니다[28]. 금속 나노입자는 폴리염화비페닐(PCB), 할로겐화 지방족, 유기염소 살충제, 독성 금속 및 할로겐화 유기 용매를 포함한 다양한 일반적인 환경 오염 물질을 분해하는 촉매 역할을 할 수 있습니다[29]. CuO, Ag 및 Au NP는 일산화탄소(CO), 시안화수소(HCN) 및 이산화황(SO2)과 같은 유독 가스 감지에도 사용됩니다. ) [30, 31]. 최근에, 국부적인 표면 플라즈몬 공명을 나타내는 다수의 금속 나노입자(Au, Ag 및 Cu)가 바이오 나노센서의 개발에 사용되었다[24].
불행히도 금속 및 금속 산화물 나노입자는 인간의 건강과 일반적으로 환경 모두에 부정적인 영향을 미칠 가능성이 있습니다. 전체 생태계에 대한 연쇄 효과와 함께 미생물 군집에 악영향을 미칠 수 있는 새로운 종류의 독소를 생성함으로써 [32,33,34,35]. 그 결과 나노입자가 미생물에 미치는 영향이 광범위하게 연구되어 왔다. 예를 들어, Ag 나노입자는 조류 성장과 광합성을 억제하여 엽록소(Chl ) Chlamydomonas reinhardtii의 형광 함량 [36], Thalassiosira pseudonana의 세포 성장 변경 및 공상구균 특. [37] 그리고 수생 식물의 성장과 세포 생존에 영향을 미치는 부풀어 오른 오리풀 Lemna gibba [38]. Książyk et al. [39] 및 Sørensen et al. [40]은 백금 나노입자가 민물 미세조류 Pseudokirchneriella subcapitata의 성장을 억제한다고 보고했습니다. [39, 40]. 당연히 Ag와 Pd 나노입자 모두 다양한 그람 양성균과 그람 음성균에 대한 유용한 항균제로 사용되어 왔다[41,42,43]. 대조적으로 Au NP는 박테리아나 조류에 부정적인 영향을 미치지 않는 것으로 생각되지만[44, 45], 한 연구에서는 전하와 표면 화학에 따라 독성이 있을 수 있음을 보여주었습니다[46]. C에서 CuO NP에 대한 부정적인 영향이 보고되었습니다. 라인하르트티 [36, 47], P. 서브캐피타타 [48], 서양 수초 Elodea nuttllii [49] 오리 위드 렘나 sp. , 물벼룩 [48] zebrafish Danio rerio의 초기 생애 단계 [50, 51].
금속 NP는 세포 손상을 일으킬 수 있는 물리적 및 화학적 특성을 가지고 있습니다. 반응성 산소종(ROS)의 과도한 생성을 통해 DNA, 단백질 및 지질에 대한 후속 손상. Ag NP에 의한 ROS의 형성은 Chlorella vulgaris에서 감지되었습니다. 및 두날리엘라 테르티올렉타 문화 및 L. 기바 [52] 뿐만 아니라 박테리아 [53]. CuO 및 Fe NP는 모두 다양한 수생 및 육상 생물에 해를 줄 수 있는 Fenton 반응을 통해 생성된 ROS 계열인 수소 라디칼을 생성할 수 있습니다[54, 55].
녹색 화학은 유해 물질의 사용 및 생성을 줄이거나 제거하는 제품 및 프로세스의 설계를 장려하는 일련의 원칙 또는 관행입니다[56,57,58]. 현재의 녹색 나노기술 관행은 종종 천연 자원, 무해한 용매, 생분해성 및 생체적합성 재료의 사용 및 NP 제조에 에너지 효율적인 공정을 포함합니다[59]. 예를 들어, 셀룰로오스, 키토산, 덱스트란 또는 나무 검과 같은 생체 고분자는 금속 나노입자 합성을 위한 환원제 및 안정화제로 자주 사용됩니다[12, 60,61,62]. 본 연구에 사용된 Gum karaya(GK)는 Sterculia의 천연 나무 고무입니다. 약 13~26%의 갈락토스와 15~30%의 람노스, 30~43%의 갈락투론산, 37%의 우론산 잔기 및 약 8%의 아세틸기로 구성되어 있다[63]. 독성 연구에 따르면 GK는 무독성으로 식품 첨가물로도 사용할 수 있습니다[62,63,64,65].
이 연구에서 우리는 천연 고분자 GK의 수용액을 사용하여 많은 금속(Ag, Au, Pt, Pd) 및 금속 산화물(CuO) NP를 제조하기 위해 녹색 화학 접근 방식을 사용하는 것을 목표로 했습니다. 이 새로 준비된 NP의 생물학적 효과는 C에서 조사되었습니다. 라인하르트티 조류 성장, 산화 스트레스, 막 손상, Chl을 포함한 다양한 세포 반응 사용 형광과 광합성. NP 안정성, 크기 및 제타 전위는 ROS 생성의 용해도 및 비생물적 테스트와 함께 조류 성장 배지에서 결정되었습니다.
방법
자료
상업용 GK, 질산은(AgNO3 ), 사염화금수소(HAuCl4 ·3H2 O), 염화구리(CuCl2 ·2H2 O), 염화백금산(H2 백금6 ), 칼륨 테트라클로로팔라데이트(II)(K2 PdCl4 ), 염화수소(HCl), 수산화나트륨(NaOH) 및 수산화암모늄(NH4 OH)는 모두 미국 Sigma-Aldrich에서 구입했습니다. 모든 실험에 탈이온수(DI water)를 사용했습니다. 이 연구에 사용된 모든 화학물질 및 시약은 분석 등급입니다.
C. 라인하르트티 조류 배양(균주 CPCC11)은 Canadian Phycological Culture Center(CPCC, University of Waterloo, Canada)에서 입수했습니다.
GK 처리
GK 분말(1g)을 1L의 탈이온수를 포함하는 유리 비커에 넣고 자기 교반기에서 밤새 부드럽게 교반했습니다. 이후에 껌 용액을 실온(20°C)에서 18시간 동안 방치하여 용해되지 않은 물질을 분리했습니다. 그런 다음 껌 용액을 소결 유리 깔때기(10–16μm 기공 크기)를 통해 여과하고 투명한 용액을 동결 건조하여 필요할 때까지 보관했습니다.
GK를 사용한 금속 및 금속 산화물 NP의 합성
간단히 말해서, 10mM AgNO3의 100μL 분취량 , HAuCl4 , H2 백금6 및 K2 PdCl4 용액을 별도의 50mL 원뿔형 플라스크에 있는 10mL의 GK 수용액에 첨가했습니다. NP 형성의 최대 수율을 달성하기 위해 0.1N HCl 또는 0.1N NaOH를 첨가하여 콜로이드 분산액의 pH를 조정했습니다. Ag, Au, Pt 및 Pd NP를 합성하기 위해 AgNO3 , HAuCl4 , H2 백금6 , 및 K2 PdCl4 GK 혼합물을 Innova 43 오비탈 쉐이커(New Brunswick Scientific, USA)에서 45~95°C 범위의 온도에서 250rpm으로 1시간 동안 교반했습니다. 용액은 각각 밝은 노란색, 와인 레드, 강렬한 검은색 및 음소거된 검은색으로 변하여 Ag, Au, Pt 및 Pd NP의 형성을 나타냅니다. Pt의 경우 pH 8.0 및 온도 90°C에서 환원 및 NP 형성이 발생한 반면, pH 8.5 및 95°C에서 Pd NPs가 형성되었습니다. Padil et al. [66, 67].
CuO NP는 콜로이드 열 합성 공정을 사용하여 합성되었습니다[13]. 간단히 말해서, 이수화물 염화구리(CuCl2)의 10mM 용액 100μL 분취량 ·2H2 O) 10mL의 GK 용액(10mL의 DI water에 분산된 100mg) 및 NaOH를 CuCl2가 포함된 별도의 50mL 원뿔형 플라스크에서 혼합했습니다. ·2H2 O와 NaOH는 2:5의 몰비로 유지됩니다. CuCl2를 포함하는 혼합물 ·2H2 O와 GK는 오비탈 셰이커에서 1시간 동안 75°C의 온도에서 250rpm으로 교반되었습니다. 혼합물의 색상은 점차적으로 청색에서 흑색으로 변하여 CuO NPs의 형성을 나타냅니다. 생성된 침전물을 원심분리하여 얻었고 먼저 에탄올로 세척한 다음 탈이온수로 세척했습니다.
녹색 합성 NP의 특성
새로 합성된 NP 내의 금속 농도는 유도 결합 플라즈마 질량 분석기(ICP-MS, OPTIMA 2100 DV, Perkin Elmer)를 사용하여 측정되었습니다.
금속 NP의 형성과 안정성은 Cintra 202 UV-Vis 분광 광도계(GBC, Australia)를 사용하여 평가되었으며 NP 안정성은 6개월 후에 결정되었습니다.
Ag, Au, Pt, Pd 및 CuO NP의 투과 전자 현미경(TEM) 이미지는 15kV의 가속 전압에서 작동하는 Tecnai F 12 현미경(FEI, Thermo Fisher Scientific, Oregon, USA)을 사용하여 얻었습니다. TEM 분석을 위한 샘플은 구리 그리드에 10-20μL의 GK-무기 NP 분산액을 떨어뜨리고 과잉 용액을 제거한 후 실온에서 건조하여 준비했습니다.
조류 배양 조건
클라미도모나스 레인하르트티 TAPx4 배지(추가 파일 1:표 S1, 지원 정보)에서 100rpm으로 지속적으로 회전하는 진탕기 및 114.2μmol의 조명 체제가 장착된 인큐베이터(스위스 인포스 소재)에서 20°C에서 배양했습니다. 2
s
−1
. 조류 세포는 약 10
6
을 얻기 위해 기하급수적인 속도로 성장했습니다. 세포/mL.
조류 노출 매체에서 NP의 특성화
C의 NP 크기 분포. 라인하르트티 TAPx4 배지는 DC24000UHR 디스크 원심분리기(CPS Instruments Inc., USA)에서 차동 원심 침강 기술(DCS)을 사용하여 측정되었습니다. 측정은 24,000rpm의 디스크 회전 속도로 이루어졌으며 입자 침강은 8–24%(w /와 ) 자당 밀도 구배. 각 샘플 측정 전에 기기는 PVC 나노스피어 표준(470nm)을 사용하여 보정되었습니다. NP는 또한 전기 영동 이동성과 Zetasizer ZS(Malvern Instruments Ltd., UK)에서 제타 전위(ZP)를 결정하는 데 사용된 Smoluchowski 근사치를 특징으로 했습니다. 각 측정은 10초의 자기상관 함수로 10회 이상 수행되었으며, 각 결과는 동일한 샘플을 3회 반복 측정하여 얻었습니다.
한외여과 방법을 사용하여 조류 매체에서 이온 금속의 양을 결정했습니다(Cheloni et al. [47]; Ma et al. [68]). 서로 다른 시간 간격(2시간 및 24시간)으로 추출한 분취량을 7500rpm에서 30분 동안 원심분리하여 입자와 응집체를 분리했습니다. 그런 다음 상층액을 3kDa 분자량 컷오프(Millipore, USA)가 있는 Amicon Ultracel 3K 한외여과 필터를 통해 여과하여 입자에서 이온을 분리했습니다. 직경이 1.3nm보다 큰 나노입자와 응집체는 필터에 남아 있었고 여과액은 ICP-MS로 용해 이온을 분석했습니다[68].
조류 배지에서 NP의 농도가 증가함에 따른 비생물적 ROS 생성은 형광성 디클로로디히드로플루오레세인 디아세테이트(H2 DCF-DA, Sigma–Aldrich, Switzerland), 초기 연구[47, 69]에서 설명한 대로.
조류 성장, 막 완전성 및 산화 스트레스 생성에 대한 NP의 영향
조류 성장, 막 완전성 및 산화 스트레스 생성에 대한 금속 및 금속 산화물 NP의 효과는 유세포 분석기(FCM; BD Accuri C6 Flow Cytometer, BD Biosciences, USA)를 사용하여 테스트되었습니다. 실험은 1, 5, 10 및 20mg/L 농도의 조류 현탁액과 NP가 5mL 포함된 투명 바이알(PS, 50mL, Semadeni, Switzerland)에서 수행되었습니다. NP가 없는 대조군 샘플을 병렬로 실행했습니다. 손상된 세포막에 대한 양성 대조군을 제공하기 위해 조류 세포를 끓는 물(100°C)에서 15분 동안 가열했습니다. 조류 세포는 또한 산화 스트레스(ROS)의 양성 대조군으로서 암실에서 30분 동안 산화 종 제제인 커민(Sigma-Aldrich, USA)으로 처리되었습니다. 처리되지 않은 모든 샘플과 NP로 처리된 샘플은 배양 유지에 채택된 것과 유사한 조건에서 배양되었습니다. FCM을 사용하여 세포막 완전성과 산화 스트레스에 대한 NP의 영향을 평가하기 위해 1, 3, 5, 24시간 후에 하위 샘플을 채취했습니다. 각 샘플의 250μL 분취량을 Microtiter® 96웰 평평한 바닥 플레이트로 옮겼습니다. 세포막 무결성을 평가하기 위해 요오드화 프로피듐(PI) 형광 프로브(P4170, Sigma-Aldrich, USA)를 7μM의 최종 농도로 샘플에 추가했습니다. 산화 스트레스 검출을 위해 제품 설명서에 따라 CellROX® Green Reagent(ROS)(C10444, Life Technologies, USA)를 샘플에 추가했습니다. 요컨대, PI는 손상된 세포막을 통해 세포 내 침투 후 DNA에 결합하고 RNA에 부착되지만 건강한 세포에서는 제외됩니다. CellROX® Green Reagent는 살아있는 세포의 산화 스트레스를 측정하기 위한 프로브입니다. 세포 투과성 염료는 환원된 상태에서 약한 형광성을 나타내지만 ROS에 의한 산화 및 DNA에 대한 후속 결합 시 밝은 녹색 광안정성 형광을 나타낸다. 따라서 신호는 주로 핵과 미토콘드리아에 국한됩니다. 플레이트를 FCM 측정 전에 20분(PI) 및 30분(ROS) 동안 암실에서 인큐베이션했습니다. 그런 다음 조류 현탁액을 파란색 488nm 여기 레이저로 FCM을 통과했습니다. CellROX Green은 FL1 채널 533/30nm에서, PI red 형광은 FL2 채널 585/40nm에서, 엽록소 a(Chla ) FL3 채널> 670 nm. 실험은 2회 반복하여 진행되었습니다.
FCM 데이터는 CFlow Plus 소프트웨어(BD Biosciences, USA)를 사용하여 분석되었습니다. 샘플은 Chla의 전방 산란 특성 및 적색 자가형광을 기반으로 하여 게이트되었습니다. , NP, 파편 및 기타 오염 물질로부터 신호를 제거합니다. Chla의 자가형광을 기반으로 세포 수, 손상된 세포막 또는 산화 스트레스를 받은 세포의 비율, 자가형광 데이터를 검색했습니다. (670nm), PI 라벨이 지정된 셀(585nm) 및 ROS Green(533nm)(추가 파일 1:그림 S1).
조류 광계 II의 효율성
금속 및 금속 산화물 NP 현탁액을 동일한 조류 배양물에 첨가했습니다(약 10
6
세포/mL) 1, 5, 10 및 20mg/L의 최종 농도를 달성하기 위해 15mL 유리 플라스크에 넣습니다. NP가 없는 조류 배양물을 음성 대조군으로 준비했습니다. 그런 다음 모든 샘플을 원래의 조류 배양에 사용된 것과 동일한 조건에서 인큐베이터로 옮겼습니다. AquaPen-C AP-C 100 형광계(PSI Ltd., Czech 공화국). 모든 측정은 삼중으로 수행되었습니다. QY는 가변 형광의 비율을 나타냅니다(Fv =Fm − F0 ) 최대 형광성(Fm ), QY =Fv :Fm 광화학적 소광 효율의 대용물로 사용[70]. Fm 최소 형광(F0 ) 광합성 빛이 없는 상태에서 최소 형광 수준에서 초기 측정값입니다.
통계 분석
C에 대한 금속 및 금속 산화물 NP의 영향. 라인하르트티 분산 ANOVA 분석 및 Dunnett's test(GraphPad PRISM, USA)를 사용하여 테스트했습니다. 유의 수준은 *P로 설정되었습니다. <0.05, **P <0.01 및 ***P <0.001.
<섹션 데이터-제목="결과">
결과
NP의 형성 및 주요 특성
GK를 사용하여 합성된 Ag, Au, Pt, Pd 및 CuO NP의 TEM 이미지는 직경이 2~100nm 범위인 잘 분리된 구형 NP를 보여줍니다(그림 1a–e). UV-Vis 분광법(그림 1f)에서 조사된 수성 콜로이드 NP 솔루션은 412 및 525nm에서 뚜렷한 표면 플라즈몬 공명을 나타내었으며, 이는 GK 네트워크 내에서 Au 및 Ag NP의 형성과 일치합니다. Pt, Pd 또는 CuO NP에 대해 뚜렷한 표면 플라즈몬 공명이 관찰되지 않았습니다. 6개월 후 UV-Vis 측정은 모든 NP의 안정성을 확인했으며 스펙트럼은 새로 합성된 NP와 유사한 평균 크기를 가진 단일 피크를 표시합니다(추가 파일 1:그림 S2).
<그림>
a의 투과 전자 현미경 이미지 오, b pt, c Ag, d PD 및 e 카라야 검과 이에 상응하는 금속염을 사용하여 합성된 CuO 나노입자. 아 , b , ㄷ , d 및 e 그래프 삽입은 차등 원심 침강에 의해 결정된 조류 배지의 나노 입자 중량에 의한 피크 입자 크기 분포를 보여줍니다. (F) Au, Ag, Pt, Pd 및 CuO 나노입자에 대한 UV-Vis 스펙트럼
조류 노출 매체에서 NP의 특성화
무게 분포를 기반으로 한 NP 크기는 CuO> Au> Pt> Ag> Pd와 같이 180~5nm 범위였습니다. 모든 NP는 pH 7에서 음전하를 띠었습니다(표 1 및 추가 파일 1:그림 S3). Pt, Ag 및 CuO NP는 이온 금속 농도가 가장 높았고(33–36μg/L), Au 및 Pt NP는 가장 낮았습니다(6–7μg/L)(표 1). 금속의 이온 형태는 조류 배지에서 검출되었습니다(표 1).
조류 성장에 미치는 영향
영향을 받지 않음 C. 라인하르트티 문화는 1 × 10
6
의 성장률을 보였습니다. 세포/시간. 1 mg/L의 Ag, Pd 및 CuO 나노입자가 있는 경우 성장률이 2.2 × 10
4
으로 급격히 감소했습니다. , 1.7 × 10
4
및 0.2 × 10
4
cell/h, 각각 (P <0.001). NP 농도가 더 증가함에 따라 조류 성장이 완전히 억제되었습니다(그림 2). 조류가 Au 및 Pt 나노입자에 노출되었을 때, 성장률도 대조군에 비해 현저히 감소했습니다(P <0.001), 그러나 농도를 증가시켜도 효과가 증가하지 않았습니다.
<그림>
Chlamydomonas reinhardtii의 성장률 Au, Pt, Pd, Ag 및 CuO 금속 및 금속 산화물 나노 입자(1, 5, 10 및 20 mg/L)에 노출되었습니다. 비노출 대조군(조류 배양)의 성장률은 1 × 10
6
이었습니다. 24시간 후 세포/시간 오차 막대는 중복 샘플을 사용한 반복 실험의 표준 편차를 나타냅니다.
세포의 산화 스트레스 생성
산화 스트레스는 NP 유형에 따라 다릅니다(그림 3). 거의 100%의 세포가 영향을 받는 가장 높은 효과는 5-20 mg/L의 Ag 및 CuO NPs에 의해 발생했습니다(그림 3d, e 및 추가 파일 1:표 S2). 조류 세포가 Au NPs에 노출되었을 때, 산화 스트레스는 훨씬 더 낮았고, 대부분 <10%의 세포가 영향을 받았습니다. Au NP의 최고 농도(20mg/L)는 세포의 15%에만 영향을 미쳤습니다(P <0.001). 스트레스를 받은 세포의 비율은 시간이 지남에 따라 점진적으로 감소했으며 테스트된 모든 Au 농도에 대해 24시간 후에 산화 스트레스가 감지되지 않았습니다(그림 3a). 백금 나노입자는 노출의 처음 5시간 동안 8% 미만의 조류 세포에서 산화 스트레스를 유발했습니다(그림 3b). 10 및 20mg/L 농도에서만 24시간 후 세포의 10% 및 19%에서 스트레스가 발생했습니다(P <0.001; 추가 파일 1:표 S2), 낮은 농도에서 응력이 감지되지 않음(P> 0.1) 24시간 노출 후(그림 3b). 1mg/L의 Ag NP에 노출되면 24시간 동안 조류 세포에서 산화 스트레스를 유도하지 못했습니다(P> 0.9). 그러나 5mg/L에 노출되면 5시간 후에 산화 스트레스가 발생하고 10 및 20mg/L에 노출되면 3시간 후에 산화 스트레스가 발생했습니다. Ag NP에 24시간 노출된 후 세포의 100%가 스트레스를 받았습니다(P <0.001; 그림 3c 및 추가 파일 1:표 S2). CuO NP는 유의미한 유도(P <0.001) 조류 세포의 산화 스트레스는 Ag NP를 제외하고 10 및 20mg/L에서 테스트된 다른 금속 NP(추가 파일 1:표 S2)보다 더 빠르게(3시간) 산화 스트레스는 5시간 후 5mg/L에서 이미 유의미했습니다. 모든 농도(> 5 mg/L)는 세포 산화 스트레스에 상당한 영향을 미쳤습니다(그림 3d, e). 보완 매개변수로 NP에 의해 생성된 비생물적 ROS도 결정했습니다. C와 대조적으로. 라인하르트티C의 성장률 및 백분율. 라인하르트티 산화 스트레스를 나타내는 세포에서 Au NP는 비생물적 ROS(P> 0.05; 추가 파일 1:그림 S4).
<그림>
Chlamydomonas reinhardtii 비율 증가하는 농도(1, 5, 10 및 20mg/L)의 a에 노출된 후 산화 스트레스를 나타내는 세포 오, b pt, c PD, d Ag 및 e 1, 3, 5, 24시간 후 CuO 나노입자. 오차 막대는 중복 샘플을 사용한 반복 실험의 표준 편차를 나타냅니다. 다른 y 참고 -Au 및 Pt에 대한 축 스케일
조류막 무결성에 미치는 영향
Au 및 Pt NP는 상당한(P <0.001) 1~5시간의 모든 농도에서 세포막 손상(추가 파일 1:표 S3); 그러나 유의미한 효과는 없습니다(P> 0.05)는 24시간 후에 관찰되었습니다(그림 4a, b). Ag NP의 경우 세포의 100%가 손상되었습니다(P <0.001) 1-20mg/L에 1시간 노출 후(그림 4c, 추가 파일 1:표 S3, Ag). 1 및 5 mg/L Pd NP에 노출된 후 손상된 세포막의 비율(추가 파일 1:표 S3, Pd)은 24시간 동안 대조군(P> 0.4). 반면에 상당한 손상(P <0.001)은 20mg/L Pd NP에 24시간 노출된 후 관찰되었습니다(그림 4d). CuO의 효과는 농도와 시간이 증가함에 따라 증가하여 24시간 후에 가장 큰 영향을 미쳤습니다(그림 4e 및 추가 파일 1:표 S3).
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Chlamydomonas reinhardtii 비율 증가하는 농도(1, 5, 10 및 20mg/L)의 a에 노출된 후 손상된 막이 있는 세포 오, b pt, c PD, d Ag 및 e 1, 3, 5, 24시간 후 CuO 나노입자. 오차 막대는 중복 샘플을 사용한 반복 실험의 표준 편차를 나타냅니다. 다른 y 참고 -Au 및 Pt용 축 스케일
엽록소에 미치는 영향(Chl ) 형광성
Chl 형광은 크게 영향을 받지 않았습니다(P> 0.1) 24시간 동안 모든 농도에서 Au NP에 의해 그리고 5시간 동안 Pt에 의해(그림 5a, b 및 추가 파일 1:표 S4). 반면 Ag, Pd 및 CuO NPs는 강력하게 억제되었습니다(P <0.001) Chl 농도 및 노출 시간이 증가함에 따라 형광 Chl 형광이 98%(1시간)에서 22%(24시간)로 감소했습니다(P <0.001) 조류 세포가 5mg/L Ag의 존재 하에 성장했을 때(추가 파일 1:표 S4). 10 및 20mg/L Ag에서도 유사한 형광 감소가 관찰되었으며 수준은 20 및 9%로 떨어졌습니다(P <0.001), 각각(그림 5c). CuO 및 Pd NP(둘 다 20mg/L)는 Chl의 급격한 감소를 야기했습니다. 24시간 후 형광(P <0.001). 관찰 가능한 효과가 없었습니다(P> 0.1), 그러나 1 또는 5 mg/L의 Pd 및 1 mg/L의 Ag 및 CuO NP(그림 5c–e)에 대해.
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Chlamydomonas reinhardtii 비율 엽록소가 있는 세포(Chl ) a의 농도 증가(1, 5, 10 및 20 mg/L)에 노출 후 형광 오, b pt, c PD, d Ag 및 e 1, 3, 5, 24시간 후 CuO 나노입자. 오차 막대는 중복 샘플을 사용한 반복 실험의 표준 편차를 나타냅니다.
NP가 조류 광계 II에 미치는 영향
Au, Pt 및 CuO NP는 약간의 유의미한 영향을 미쳤습니다(P <0.05) 1~20mg/L 범위의 농도에서 24시간 동안 일부 시점에서 광계 II QY에 대한 것입니다(그림 6 및 추가 파일 1:표 S5). 반면 QY는 크게 감소했습니다(P <0.001) 모든 농도에서 Ag NP와 접촉한 후 단 1시간 후(그림 6c 및 추가 파일 1:표 S5). Pd 및 CuO NPs는 20mg/L의 최고 농도에서 QY의 상당한 감소를 가져왔습니다(그림 6d, e 및 추가 파일 1:표 S5).
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a의 효과 오, b pt, c PD, d Ag 및 e 1, 3, 5, 24시간 후 광계 II 효율(QY %)에 대한 CuO 나노입자(1, 5, 10 및 20mg/L). y에 100% -축은 나노입자가 없는 대조군 조류 배양의 QY를 나타냅니다. 오차 막대는 복제된 샘플의 반복 실험의 표준 편차를 나타냅니다.
토론
현재 작업에서 우리는 환경 친화적인 분산제의 사용에 중점을 둔 녹색 화학 접근법[16, 57, 58]을 구현하는 데 있어 금속 및 금속 산화물 나노 물질 합성 중 유독성 폐기물 생성을 제거하는 방법을 탐구하는 것을 목표로 했습니다. 재생 가능하고 생분해 가능한 재료. 우리는 다양한 NP의 합성 및 안정화를 위해 천연, 재생 가능 및 생분해성 재료인 GK를 성공적으로 사용했습니다. 탈이온수를 용매로 사용하면 GK에 존재하는 작용기(즉 -OH 및 -COO-)가 환원제 역할을 하고 GK 폴리머 자체가 형성된 나노입자에 대한 캡핑제 역할을 하여 나노입자의 녹색 합성을 가능하게 하였다[59, 68]. 우리 연구에서 합성된 나노입자(Au, Pt, Pd, Ag 및 CuO)는 크기, 안정성 및 비용 효율성 측면에서 이전 연구의 다른 녹색 합성 나노입자와 비슷했습니다[13, 69].
그런 다음 예상되거나 기록된 환경 농도[39, 71,72,73]와 관련된 다양한 나노규모 농도(1–20 mg/L)를 사용하여 C에 대한 NP의 생물학적 효과를 평가했습니다. 라인하르트티 조류 성장, 막 무결성, Chl과 같은 엔드포인트 사용 형광 광계 II 효율성 및 산화 스트레스. 우리의 결과는 조류에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않는 Au 및 Pt NP와 거의 모든 끝점에 강한 영향을 나타내는 Ag, Pd 및 CuO NP의 두 가지 뚜렷한 그룹을 보여주었습니다(추가 파일 1:표 S6). 금속 또는 금속 산화물 나노입자에 대한 독성 연구는 구성, 코팅, 크기, 모양 및 동종 또는 이종 응집을 포함하여 독성과 관련될 수 있는 나노입자의 몇 가지 주요 물리화학적 특성을 확인했습니다[69, 74,75,76,77, 78]. 또한, 용해된 금속(이온 형태) 독성은 이전에 세포 내 ROS 생성, Chl을 포함한 다양한 기준을 사용하여 조류에 대해 입증되었습니다. 고갈 및 광합성 억제 [79,80,81]. 우리는 ROS 생성과 성장에 대한 영향을 명확하게 감지했습니다. Chl Ag, Pd 및 CuO NP에 노출된 후 생성 및 광계 II.
Pd 나노입자는 일반적으로 독성 그룹으로 간주되어 왔지만 널리 연구되지 않았으며 최근에야 중요한 항균 나노입자로 인식되었습니다[41]. 일반적으로 작은 크기(1.5~3nm)의 Pd NP는 항균 특성에 기여하여 직경이 5~20nm인 박테리아 또는 조류 세포벽 구멍을 통해 세포로의 이동을 촉진할 수 있다고 믿어집니다[82, 83] . In our study, Pd NPs of 1.5 nm mean size could directly enter algal cell walls and cause damage when releasing ions in the cell membrane and chloroplasts (Chl fluorescence, PS II, ROS). There is clear evidence that soluble Pd salt was able to enter P. subcapitata cells, where Pd precipitates were mostly formed in chloroplasts [78] which could increase generation of ROS and thus oxidative stress. It was also reported that Pd NPs (127 nm z -average hydrodynamic size) were less toxic toward P. subcapitata than soluble Pd salt [69] maybe due to larger size of NPs that could not directly enter the cells, while Pd salt could. On the other hand, Pd NPs could form hetero-aggregates with algal cells leading to physical entrapment. Surprisingly, the entrapment is not inevitably lethal because the cells could recover their growth after transfer to clean medium [69].
Numerous studies have shown that Ag NPs toxicity to algae was mainly driven by Ag ions dissolved in the exposure medium rather than Ag NPs and also depended on Ag NPs coatings and sizes [80, 84,85,86,87,88,89]. Our study revealed high toxicity of Ag NPs thus suitable for algicidal applications. The ionic Ag and/or Ag NPs (5 nm) could directly enter algal cells [90], causing damage to the cell membranes and other cellular compartments by ROS formation. Moreover, Ag NPs could damage algal cells by direct interaction between NPs and algal cells [72] or the type of NPs coating could play a significant role. For example, dexpanthenol, polyethylene glycol and polyvinyl polypyrrolidone coatings caused a similar effect as AgNO3 on C. reinhardtii , while carbonate, chitosan, and citrate decreased the Ag effect on photosynthesis [87]. Our Ag NPs showed strong effect toward C. reinhardtii regardless GK coating.
The ecotoxicity of CuO NPs has been extensively studied [36, 47,48,49, 69, 91]. We observed CuO NPs harming cell membranes right after 1 h, while the ROS elevated after 3 h at concentrations higher than 5 mg/L and also Chl fluorescence substantially decreased over 24 h. It is possible that the CuO NPs (or ionic Cu)-damaged membranes could increase further uptake of Cu and oxidative stress in the C. reinhardtii cells [91] where observed hetero-aggregation of NPs and the cells (data not shown) could even enhance this interaction. von Moos et al. [36] stated that free Cu
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or the NPs themselves were the main mediators of toxicity toward C. reinhardtii , while Cheloni et al. [47] believed ion Cu at lower CuO NPs concentrations was the driving force, being unable to clarify the contribution of dissolved Cu in CuO NPs . This was probably elucidated by other study revealed much stronger effect of soluble ionic Cu and soluble fraction of CuO NPs on P. subcapitata than bare CuO NPs [69].
Au NPs slightly increased membrane impairment and oxidative stress after 3 and 5 h, but these effects disappeared after 24 h. Interestingly, abiotic ROS were constantly generated during whole 24 h study contrary to all other NPs. We assume that stable conditions allowed the cells to cope with such small level of stress. Previous study has reported a range of EC50 values for dissolved Au on C. reinhardtii of between 5.9 and 1.7 mg/L, depending on exposure time [92]. In our opinion, almost any Au NP toxicity would not have been exacerbated or affected by the degree of ion Au and would have had nearly no bearing on any of the criteria adopted for our experiments. Moreover, Au NPs seemed to be well dispersed in exposure media and we did not observe any aggregates or direct interactions with the C. reinhardtii cells (data not shown).
We found that Pt NPs caused slight Chl and a growth rate decrease after 24 h for all concentrations. These not so pronounced effects could be caused by both ionic Pt and Pt NPs. Up to now, there has been only limited knowledge about the toxicity of Pt NPs on algae. For example, Pt NPs decreased growth rate, and Chl fluorescence and oxidative stress on P. subcapitata and C. reinhardtii [39, 40]. The latter authors also suggested that the toxicity of Pt NPs might be only partly attributed to dissolved form of Pt in the case of P. subcapitata and that also the shading effect might influence toxicity [40]. In our study, we did not find such evidence.
Conclusions
Green-synthesised metal and metal oxide NPs were produced at nanoscale sizes of 42 nm (Au), 12 nm (Pt), 1.5 nm (Pd), 5 nm (Ag) and 180 nm (CuO):all with a negative charge. GK, a natural hydrocolloid, was successfully applied as a safe, cost-effective stabiliser and showed no aggregation (all NPs) after 6 months at + 4 °C. The biological effect (algal growth, membrane integrity, oxidative stress, Chl fluorescence and photosystem II efficiency) of these NPs was investigated on green alga C. reinhardtii . All NPs had a significant effect on algal growth rate; however, Au and Pt NPs inhibited algal growth far less than the other NPs (Pd, Ag and CuO). In terms of other biological effects, Pd, Ag and CuO NPs caused significant cell membrane damage, highly affected Chl fluorescence and caused oxidative stress. Ag and Pd NPs mostly inhibited photosystem II, while it was not much affected by CuO (only the highest concentration of 20 mg/L significantly decreased QY) and Au or Pt. Generally, metal and metal oxide NPs were successfully synthesised following green chemistry rules, without harmful side-products and showing high stability. Some could find reasonable application in algicides (Ag and CuO) or antimicrobial surfaces (Pd, Ag and CuO), while Au and Pt proved to be almost non-toxic to green alga C. reinhardtii .
