나노물질
산업 제조
세포외 소포(EV)는 단백질, 지질 및 유전 물질을 전달하기 위한 통신 메커니즘으로 대부분의 세포 유형에서 자연적으로 분비되는 나노 크기의 지질 이중층 결합 소포입니다. EV의 치료 잠재력에도 불구하고 EV 흡수 역학 및 특이성에 대한 정보는 제한적입니다. 여기에서 우리는 고처리량 방식으로 인간 배아 신장 세포(HEK293T) EV 내재화에 대한 용량, 시간 및 수용자 세포 특이성 효과를 정량적으로 평가하기 위해 이미징 유세포 분석(IFC) 기반 플랫폼을 최적화했습니다. 우리는 HEK293T EV 흡수가 용량과 시간에 의존하는 능동적인 과정이라는 것을 발견했습니다. 또한, EV 흡수의 선택성을 시험관 내 정량화했습니다. , 그리고 우리는 HEK293T EV가 동일한 기원의 세포에 의해 더 많은 양으로 내재화되었음을 발견했습니다. 마지막으로, 신경 줄기 세포는 성숙한 뉴런에 비해 훨씬 더 많은 HEK293T EV를 내재화했으며, 이는 말단 분화 세포보다 대사적으로 더 활성인 줄기 세포 또는 전구 세포가 활성 EV 내재화의 더 높은 비율을 가질 수 있음을 시사합니다. EV 섭취의 특성화, 특히 특이성, 용량 및 시간 의존성, 운동 분석은 표적화되고 효율적인 EV 기반 치료제를 알리고 개발하는 데 도움이 될 것입니다.
세포외 소포 연구는 자연 및 조작된 세포외 소포(EV)의 치료 및 진단 유틸리티로 인해 급성장하는 분야입니다. EV는 직경이 50~1000 nm 범위이며 모든 세포 유형에서 생산되며 CD63, CD81 및 CD9를 포함한 막관통 단백질이 풍부합니다. 지질; 단백질; 및 DNA, RNA, mRNA 및 microRNA[1,2,3,4,5]. EV 함량, 특히 활성 mRNA 및 miRNA는 신규 번역 및 표적 세포의 번역 후 조절을 통한 수용 세포의 조절에 연루되어 있다[4, 6]. 운동 EV 흡수 및 내재화를 이해하고 수정하면 결국 치료 이점을 가질 수 있을 만큼 충분히 높은 농도로 표적 세포에 EV 콘텐츠가 최적화된 방식으로 전달될 것입니다.
한때 "세포의 쓰레기"로 여겨졌던 전기차는 생체 적합성, 낮은 면역원성 및 독성, 반복 투여 능력, 다양한 투여 경로 및 약물 전달 가능성 등 많은 이점으로 인해 세포 치료의 대안으로 활용되었습니다. 및 유전 요법 [3]. 우리 그룹은 이전에 뇌졸중 및 외상성 뇌 손상에서 신경 줄기 세포 유래 EV의 긍정적인 효과를 보고했습니다. 쥐 및 돼지 뇌졸중 모델 모두에서 EV는 뇌졸중 후 조직 및 기능 회복을 개선했습니다[3, 7, 8]. 우리는 또한 설치류 외상성 뇌 손상 모델에서 EV가 기능적 이점과 함께 신경 보호적인 것으로 나타났습니다[9]. 이러한 관찰된 EV의 효과와 미래 잠재력에도 불구하고 EV 흡수 특이성과 동역학에 대한 이해가 거의 없어 EV 치료제를 임상으로 옮기는 데 방해가 될 수 있습니다.
EV는 또한 전이 벡터로 설계되었으며 나노입자 치료제 및 전달 벡터에 대한 대안으로 유전자 요법 및 화합물을 포함한 치료제가 탑재되었습니다[4, 10, 11, 12]. HEK293T 세포는 고유의 빠른 증식, 높은 EV 수율 및 유전자 조작의 용이성으로 인해 EV 생산자 세포로 널리 사용되었습니다[13,14,15,16,17]. HEK293T EV는 유방암에 대한 miRNA 치료제를 포함한 유전자 치료법을 전달했으며[12] 신경초종 모델에서 화학요법 및 치료 단백질 구성을 전달하는 데 사용되었습니다. 시험관 내 세포 독성을 평가하는 합성 나노 입자 연구와 유사하게, MTT 독성 분석은 로드되지 않은 HEK293T EV의 낮은 독성과 화학 요법이 로드된 경우 높은 세포 독성을 나타냈습니다[10, 18, 19, 20, 21]. HEK293T EV의 이러한 풍부한 활용으로 인해 우리는 이 연구에서 이들의 동역학 및 특이성을 분석했습니다.
선택적 또는 특정 흡수는 특정 세포 유형을 대상으로 하는 EV의 자연스러운 능력을 나타냅니다. 흡수 특이성에 대한 합의가 거의 없는 EV 내재화의 메커니즘에 대한 풍부한 증거가 있습니다[22]. 종종 EV는 모세포와 유사한 수용체 세포에 의해 선택적 흡수를 나타내며, 상피 세포는 다른 수용체 세포보다 더 많은 상피 유래 EV를 내재화하고[23, 24], 중간엽 줄기 세포(MSC)는 비교하여 훨씬 더 많은 양의 MSC 유래 EV를 내재화합니다. 시험관 내 다른 세포주와 함께 [24]. 그러나 다른 연구에 따르면 EV는 모든 세포 유형에 의해 내재화되고 생체 내에서 투여될 때 비선택적 생체 분포를 나타냅니다[22, 25]. EV의 엄청난 치료 잠재력과 관심에도 불구하고 EV 흡수 특이성에 대한 이해가 부족합니다. EV 흡수 특이성을 더 잘 이해함으로써 관심 수용 세포에 의해 선택적으로 내재화되는 EV 생산자 세포를 적절하게 선택하여 EV의 치료 적용 가능성을 향상시킬 수 있습니다.
EV 섭취 결과가 상충하는 잠재적인 이유는 선량 및 시간 효과 분석을 포함한 측정 플랫폼의 표준화 부족입니다. 최근 국제 세포외 소포 학회(ISEV) 전문가 그룹은 EV 섭취에 대한 다른 교란 요인 중에서 선량 및 시간 분석의 필요성을 강조하는 입장 보고서를 발표했습니다[26]. 그룹은 "하나의 용량이 모든 사람에게 적합하지 않다"고 언급했으며 해당 용량은 EV 흡수 또는 선택성에 영향을 미칠 수 있습니다[26]. HEK293T EV의 용량을 높이면 생체 내 생체 분포 패턴이 바뀝니다[27]. 혈청 유래 EV의 흡수 프로파일은 용량에 따라 유의하게 변경되었습니다[28]. 또한 15분에서 48시간[24, 29,30,31,32,33] 범위의 수용자 세포와 EV의 공동 배양 시간은 섭취 측정을 변경할 수 있습니다. EV 연구원과 업계에서 채택하면 최소 유효 선량을 식별하는 데 도움이 되는 표준 선량 및 시간 곡선을 결정하는 정량화 가능하고 신뢰할 수 있는 프로세스가 더 강력하고 유용한 연구로 이어질 수 있습니다.
이전에 연구자들은 EV 흡수를 분석하기 위해 공초점 현미경을 포함한 다양한 형태의 저처리량 현미경과 함께 표준 유세포 분석을 사용했습니다[32,33,34]. 그러나 이러한 기술에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 공초점 현미경은 시간이 많이 걸리고 주관적일 수 있습니다. 기존의 유세포 분석기는 세포 범위의 생물학적 입자를 측정하도록 설계되었으며 EV 떼 또는 우연의 일치를 구별할 수 없으며 트리거로 인해 노이즈가 증가했습니다[35,36,37,38]. ISEV 그룹이 언급한 바와 같이, 전통적인 유세포 분석의 물리적 한계에 대한 인식이 높아지고 있으며 100nm 범위의 검출 한계를 가진 전문화된 유세포 분석에 대한 요구가 강조되고 있습니다[26, 38]. 이미징 유세포 분석(IFC)은 유세포 분석의 고처리량 정량적 특성과 직경이 100 nm 이하인 본질적으로 작은 형광 입자를 분해할 수 있는 형광 이미징 기술을 결합합니다[38]. IFC 기능은 저잡음/배경, 감소된 스웜(swarming) 및 이미지 선명도를 위한 전하 결합 장치로 이어집니다[37, 39]. 이러한 특성은 정확하고 정량화 가능한 EV 흡수 플랫폼으로서 높은 처리량 방식으로 시각적 확인을 통해 EV 및 흡수를 특성화하기 위한 게이팅 전략을 개발하는 데 도움이 됩니다[36, 37, 40].
이 연구에서 CD63-eGFP를 발현하는 HEK293T 세포는 치료 개발에서 공통적으로 사용되기 때문에 EV 생산을 위한 기증자 세포주로 활용되었습니다. 분리된 형광 EV는 신경 및 내피 세포를 포함한 수용 세포주와 공동 배양되었습니다. IFC를 사용하여 흡수를 정량화하여 시험관 내 세포 시스템에 대한 중요한 운동 EV 흡수 및 내재화 기능을 측정하기 위한 표준화된 플랫폼을 만들었습니다. 또한, 우리는 선택적 EV 흡수를 설명하기 위해 다양한 조건 및 배양된 세포주에서 형광 EV 흡수의 흡수를 정량화하는 프로세스에 대한 데이터를 제공합니다.
인간 배아 신장 세포(HEK293T)를 ATCC에서 구입하고 10% 소 태아 혈청, 100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM에서 배양했습니다. 인간 신경 줄기 세포(hNSC), SH-SY5Y 신경 세포, C3A 간 상피 세포, 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC) 및 뉴런은 모두 37 °C, 5% CO2의 표준 조건에서 배양되었습니다. 하위> 세포 외 소포 흡수 분석 전.
CD63-eGFP 플라스미드 DNA는 Addgene(#62964)에서 입수했습니다. CD63-pEGFP C2는 Paul Luzio(Addgene 플라스미드 #62964)의 선물이었습니다. HEK293T 세포를 10cm 접시에서 70% 컨플루언시로 배양하고, 제조사의 지침에 따라 Lipofectamine 2000을 사용하여 10 μg 플라스미드 DNA를 형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후, 배지를 소 태아 혈청이 없는 표준 HEK293T 배지로 교체하고 연속 3일 동안 수집하였다. 이전에 설명한 대로 [3], HEK293T 배지를 0.22μm 필터를 통해 여과하고 100kDa 재생 셀룰로오스 Amicon 원심 필터 장치를 사용하여 한외여과로 농축하고 PBS++로 두 번 세척했습니다. EV는 1 mL로 농축되었고 농도 및 크기 분포는 제조업체의 프로토콜(Malvern, UK)에 따라 Nanosight NS300에서 측정되었습니다. EV는 다른 HEK293T 배양 용기에서 분리되었으며, 각 용기는 별도의 생물학적 복제로 간주되었으며 각 생물학적 복제 내에서 3개의 기술적 복제가 있습니다(각 조건에 대해 총 9개의 샘플 최소).
받는 세포주는 37°C의 표준 배양 조건에서 24시간 동안 6웰 플레이트에 60% 컨플루언시로 시딩되었습니다. 표준 배지는 세포외 소포 공동 배양 전에 FBS-(fetal bovine serum-free) 배지로 변경되었습니다. 녹색 형광 단백질(GFP) 태그가 지정된 EV를 다양한 용량 및 시점에서 세포에 투여했습니다. 공동 배양 후, 세포를 5% 트립신에 재현탁하고 유세포 분석을 위해 50 μL당 약 100만 세포로 농축했습니다. 섭씨 37도는 세포 배양 및 시험관 내 EV 흡수 플랫폼 모두에 사용되는 표준이었기 때문에 우리 분석에서 EV 흡수 실험의 표준입니다[31, 41,42,43,44].
EV는 세포 배양 성장을 효과적으로 "일시 중지"하고 활성 과정을 억제하기 위해 4 °C에서 수용 세포와 공동 배양되었습니다[45]. 섭씨 4도는 모든 활성 형태의 EV 흡수를 억제합니다[31, 41,42,43,44].
수혜자 세포를 얼음 위에서 30분 동안 4% 파라포름알데히드에 고정하고 EV와 공동 배양하기 직전에 PBS로 세척하여 모든 활성 형태의 EV 흡수를 억제했습니다.
INSPIRE 소프트웨어를 사용하여 ImageStreamX Mark II Imaging Flow Cytometer(Luminex Corporation, Seattle, Washington)에서 수집을 수행했습니다. 최소 5000-10,000개의 세포 이벤트가 획득되었습니다. 각 생물학적 샘플은 3개의 기술 복제 우물에서 복제되었고 ISx에서 개별적으로 획득되었습니다. 명시야 이미지는 채널 1에서 수집되었고 측면 산란(785 nm)은 채널 6에서 수집되었습니다. 녹색 형광 단백질(GFP)은 200 mW에서 488 nm 아르곤 레이저에 의해 여기되었고 형광은 채널 2(480-560 nm)에서 수집되었습니다. 모든 샘플에 60배의 배율을 사용하고 높은 감도를 위해 낮은 획득률을 사용했습니다.
데이터 및 이미지 분석은 IDEAS 소프트웨어(Luminex)를 사용하여 수행되었습니다. 게이팅 전략은 다음과 같습니다.
Gradient RMS 값을 사용하여 초점 영역에 있지 않은 셀을 제거하기 위해 Focus gate를 결정했습니다.
초점을 맞춘 세포는 영역 명시야 대 종횡비 명시야를 사용하여 이중선 및 파편을 제거하기 위해 게이팅되었습니다. 게이트 데이터를 사용하여 히스토그램을 만들고 형광 강도(이미지의 모든 픽셀 합계), 최대 픽셀 강도(이미지에서 가장 밝은 픽셀의 강도)를 측정하는 통계 참조를 생성하고 모든 샘플에 대한 내부 알고리즘을 통해 스폿 카운트 값을 생성했습니다. 스팟 카운트 기능은 해당 IDEAS 마법사를 사용하여 생성되었습니다. Spot 개수, 평균 강도 및 최대 픽셀 비율은 공식(EV가 있는 출력 값/EV가 없는 출력 값)으로 계산됩니다.
모든 정량적 데이터는 GraphPad Prism 8.1.2(San Diego, California)를 통해 분석되었으며 3회 수행되었습니다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 표시됩니다. 통계적 유의성은 짝을 이루지 않은 T를 사용하여 결정되었습니다. 적절한 경우 대조군과 비교하여 사후에 Tukey 또는 Dunnett의 다중 비교를 사용한 검정 또는 일원 분산 분석(ANOVA). 피 <0.05는 유의미한 것으로 간주되었습니다.
<섹션 데이터-제목="결과">세포외 소포의 역학 및 흡수를 분석하기 위해 형광 표지된 EV를 생성하기 위해 HEK293T 세포를 CD63-eGFP 융합 단백질을 운반하는 플라스미드로 형질감염시켰다. CD63은 엑소좀 막에 일반적으로 풍부한 테트라스파닌 단백질로 EV 형광 태깅의 최적 표적이 됩니다[46, 47]. 사용된 배지는 HEK293T 세포 배양에서 수집되었고 EV는 이전에 보고된 대로 분리되었습니다[8]. 우리는 CD63-eGFP-transfected HEK293T 세포에서 분리된 EV의 크기와 분포를 non-transfected HEK293T 세포와 비교했습니다. 대조군 및 CD63-eGFP로 형질감염된 HEK293T EV는 나노트래킹 소프트웨어(그림 1a)에 의해 측정된 바와 같이 각각 110.28 nm 및 103.616 nm의 평균 중앙 직경을 표시했으며, 이는 보고된 HEK293T EV의 크기와 일치합니다[13, 15,2 , 48]. 중앙 직경(p)에 큰 차이가 없습니다. =0.1615) 및 분포(p =0.4225) 비-형질감염 및 CD63-eGFP-형질감염 HEK293T 세포에서 분리된 EV가 관찰되었습니다. eGFP 라벨링은 HEK293T EV의 크기를 변경하지 않았습니다(그림 1b).
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CD63-eGFP로 태그가 지정된 HEK293T EV의 특성화. EV는 CD63-eGFP 세포 배양 배지를 발현하는 HEK293T(대조군) 및 HEK293T에서 분리되었습니다. 아 nanotracking 소프트웨어를 통해 기록된 대표적인 EV 크기 분포. ㄴ 형질감염된 HEK293T EV 대 형질감염되지 않은 HEK293T EV의 평균 직경 분포의 정량화. ㄷ 음성 대조군 비드, HEK293T 대조군 EV 및 CD63-eGFP 태그 EV의 IFC 이미지. BF는 명시야, GFP는 녹색 형광 단백질(488 nm 여기 레이저), SSC는 측면 산란을 의미합니다. GFP 채널의 양성 eGFP는 형광 HEK293T EV를 나타냅니다. d 형질감염되지 않은 HEK293T EV 및 HEK293T CD63-eGFP EV의 유세포 분석 기반 MACSPlex 표면 마커 발현. 두 EV 소스는 상대 형광으로 측정된 CD29, CD9, CD63 및 CD81에 대해 양성입니다(양성인 경우 X로 표시). 막대는 평균 ± SEM을 나타냅니다. 아니 =3; 짝을 이루지 않은 T 테스트. n.s. p를 의미합니다.> 0.05
IFC 분석은 CD63-eGFP가 EV와 관련이 있는지 확인하기 위해 수행되었습니다. 형광 음성 대조군으로서 완충 용액의 1.34 μM 비드(그림 1c, 상단)는 488nm 여기 파장에 노출되었을 때 형광이 부족했지만 명시야(BF) 및 측면 산란(SSC)에서는 볼 수 있었습니다. 태그가 지정되지 않은 HEK293T EV는 BF, GFP 및 SSC에서 음성이었고, 이는 BF 임계값 미만의 작은 크기와 형광 부족을 시사합니다(그림 1d, 중간). BF가 없다는 것은 300 nm보다 작은 EV 크기를 의미하며, 이는 EV의 군집을 최소화함을 의미합니다. 마지막으로 CD63-eGFP 태그가 지정된 EV는 BF에서 음성이고 GFP 채널에서 양성으로 HEK293T EV의 양성 형광을 나타냅니다(그림 1c, 하단). GFP 채널의 긍정적인 신호는 단일 EV 또는 형광 EV 그룹을 나타낼 수 있습니다. 종합적으로, 이러한 결과는 분리된 HEK293T EV가 HEK293T 엑소좀의 이전 보고서와 일치하는 표준 크기 및 단백질 마커 프로필을 가지며 eGFP 라벨링이 HEK293T EV의 크기를 변경하지 않는다는 것을 보여줍니다[5, 27].
일반적인 EV 마커를 측정하기 위해 상업적으로 이용 가능한 유세포 분석 기반 방법을 사용하여 전체 EV 테트라스파닌 프로필을 결정했습니다[5]. 대조군 및 CD63-eGFP 발현 HEK293T 세포에서 분리된 HEK293T EV는 상대 형광 단위로 측정된 CD9, CD63 및 CD81을 포함한 표준 EV 마커에 대해 양성이었습니다(그림 1d). 이전에 보고된 바와 같이 CD29는 HEK293T EV 및 CD63-eGFP로 형질감염된 HEK293T EV의 표면에서도 발견되었습니다[5]. 이러한 결과는 HEK293T EV에 대한 분리 및 태깅 방법이 공통 HEK293T 엑소좀 마커를 갖는 EV를 생성함을 나타냅니다.
두 가지 억제 내재화 분석을 수행했습니다. HEK293T EV는 4 °C(저온)에서 수용 세포와 함께 또는 이전에 파라포름알데히드로 고정된 수용 세포(고정)와 공동 배양되었습니다. 처리는 생리학적 조건에서 EV와 공동 배양된 수용체 세포와 비교하여 수용체 세포에서 eGFP 표지된 EV의 존재를 감소시켰다(그림 2a). 저온 및 고정 억제 분석은 스팟 수를 감소시켰습니다(cold:p =0.0127, 고정:p =0.0078), 강도(콜드:p =0.0105, 고정:p =0.0374) 및 최대 픽셀(cold:p =0.0159, 고정:p =0.0149) 처리하지 않은 수용자 세포의 형광 신호는 EV 흡수의 억제를 나타냅니다. 이러한 결과는 eGFP 현지화 및 출력 매개변수의 증가가 HEK293T EV가 다음 흡수 분석을 위해 내재화되었음을 의미한다고 추론합니다.
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EV 내재화 억제 분석. HEK293T 세포는 다양한 조건에서 HEK293T EV와 공동 배양되었습니다. 대조군(37 °C)은 생리학적 37 °C 환경에서 공동 배양을 의미합니다. 감기는 4 °C 환경에서 공동 배양을 의미합니다. 고정 억제는 공동 배양 전에 수용 세포를 PFA로 고정한 분석을 의미합니다. 아 수신자 세포의 대표적인 IFC 이미지. 열 1, BF는 명시야를 나타냅니다. 2열 GFP는 녹색 형광 단백질(488 nm 여기 레이저)을 의미하고 3열은 BF와 GFP의 병합을 의미합니다. 대조군은 EV 내재화를 나타내는 양성 GFP를 보여줍니다. ㄴ –d 스팟 카운트, 평균 형광 강도 및 최대 픽셀을 통한 대조군과 비교한 억제 분석의 정량화. 막대는 평균 ± SEM을 나타냅니다. 아니 =3; 일원 ANOVA는 대조군과 비교하여 Tukey의 사후 검정을 따랐습니다. *p <0.05; ***p <0.01
IFC 플랫폼에 대한 표준 용량 곡선을 개발하기 위해 HEK293T EV를 37°C에서 세포당 0에서 20,000EV 범위의 증가하는 용량으로 HEK293T 수용 세포와 공동 배양했습니다. 대표적인 IFC 이미지는 EV의 용량이 증가함에 따라 eGFP 형광이 시각적으로 증가하는 것으로 나타났습니다(그림 3a). 감지할 수 있는 가장 낮은 EV 수는 공동 배양된 HEK293T 세포당 6000 EV였습니다. 이 수준에서 스팟 카운트(p =0.0012), 강도(p =0.0075) 및 최대 픽셀(p =0.0005) 측정값은 EV가 없는 수혜자 세포보다 유의하게 컸습니다(그림 3b-d). 따라서 6000 HEK293T EV의 용량은 실험 조건에서 흡수에 대한 낮은 임계값입니다. 유사하게, 10,000 및 20,000 EV의 선량이 더 높은 스팟 카운트를 가졌습니다(10,000:p =0.0009; 20,000:p <0.0001), 강도(10,000:p <0.0001; 20,000:p <0.0001) 및 최대 픽셀(10,000:p) <0.0001; 20,000:p <0.0001) EV가 없는 셀과 비교했습니다. 더 높은 복용량과 비교할 때 스팟 수에는 큰 차이가 없습니다(6000 대 10,000:p =0.999, 10,000 대 20,000:p =0.0927), 강도(6000 대 10,000:p =0.8482, 10,000 대 20,000:p =0.999) 및 최대 픽셀 수(6000 대 10,000:p =0.6056, 10,000 대 20,000:p =0.5281) 6000과 10,000 사이, 10,000과 20,000 사이. 유사하게, 6000과 20,000을 비교할 때 스팟 수에는 통계적 차이가 없습니다(p =0.0787) 및 강도(p =0.8083). 6000에서 20,000 사이의 최대 픽셀에는 상당한 차이가 있습니다(p =0.0140). 전반적으로, 수율 곡선은 모든 매개변수(스팟, 강도, 최대 픽셀, p <0.0001). 이러한 결과는 HEK293T EV 흡수가 셀당 6000 HEK293T EV의 최소 임계값으로 용량 의존적임을 나타냅니다.
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HEK293T EV 흡수는 최소 임계값이 6000EV인 선량 효과가 있습니다. HEK293T 세포는 0에서 20,000/세포로 증가하는 용량으로 HEK293T EVS와 공동 배양되었습니다. 아 각각의 EV 용량이 있는 수용자 세포의 대표적인 IFC 이미지. GFP 현지화는 HEK293T EV 활용을 의미합니다. ㄴ –d 스팟 카운트, 평균 형광 강도 및 최대 픽셀 비율을 통해 대조군 및 각 그룹과 비교한 용량 분석의 정량화. 막대는 평균 ± SEM을 나타냅니다. 아니 =3; 일원 ANOVA는 Tukey의 사후 검정을 따랐습니다. *p <0.05; ***p <0.01
세포당 6000개의 EV를 사용하여 HEK293T EV를 HEK293T 세포와 공동 배양하여 IFC 이전의 시간을 5분에서 24시간 사이로 늘렸습니다. EV 노출의 길이는 수용체 세포에서 가시적 형광의 양에 중요한 역할을 했으며, 12 h 후에 감소했습니다(그림 4a). 처음에 30 분의 공동 배양은 스팟 수가 크게 증가한 것으로 나타났습니다(p =0.0081) EV 흡수에 대한 가능한 경향을 제안하지만 다른 흡수 매개변수에서는 그렇지 않음(강도:p) =0.3073, 최대 픽셀:p =0.0952) (그림 4b-d). 공동 배양 2 h에서 현저히 높은 스팟 수(p =0.0028), 강도(p =0.0420) 및 최대 픽셀(p) =0.0006) EV가 없는 수혜자 세포와 비교하여 기록되었습니다. 다시, 공동 배양 4 h에서 모든 매개변수는 대조군보다 컸습니다(spot count:p =0.0003, 강도:p <0.0001, 최대 픽셀:p <0.0001). 농도 및 최대 픽셀은 4, 12 및 24 h 공동 배양에서 대조군보다 계속 높았다. 공동 배양의 4 와 12 h 사이에 어떤 흡수 매개변수에도 차이가 없었습니다(spot:p =0.999, 강도:p =0.5797; 최대 픽셀:p =0.2489). 그러나 강도(p =0.0191) 및 최대 픽셀(p =0.0027)은 공동 배양의 12~24 h 사이에 감소했습니다(그림 4c,d). 용량 곡선과 유사하게, HEK293T EV 흡수는 배양 4 h에서 일관된 EV 흡수와 12 h에서 피크로 시간 의존적입니다. 종합적으로, 시드된 세포당 6000EV의 용량과 4 h의 공동 배양은 다음 섭취 분석에 대해 표준화되었습니다.
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HEK293T EV 흡수는 시간에 따라 다릅니다. HEK293T 세포는 시간의 길이를 늘리기 위해 6000 HEK293T EV/세포와 공동 배양되었습니다. 아 각각 받는 세포의 대표적인 IFC 이미지. GFP 현지화는 HEK293T EV 흡수 증가를 의미합니다. ㄴ –d 스폿 카운트, 평균 형광 강도 및 최대 픽셀 비율을 통해 대조군 및 각 그룹과 비교한 시간 경과 분석의 정량화. 막대는 평균 ± SEM을 나타냅니다. 아니 =3; 일원 ANOVA는 Tukey의 사후 검정을 따랐습니다. *p <0.05; ***p <0.01
EV 흡수는 EV가 자체 기원 세포에 의해 우선적으로 흡수되는 선택적 과정이라는 가설은 IFC를 사용하여 테스트되었습니다. HEK293T EV는 상피(C3A 간 세포), 내피(인간 제대 정맥 내피 세포) 및 신경(SH-SY5Y 교모세포종 세포)과 같은 HEK293T 세포 또는 기타 세포주와 공동 배양되었습니다. eGFP 형광은 다른 세포 유형에 비해 HEK293T 세포에서 더 풍부합니다(그림 5a). C3A 및 HUVEC와 비교하여 HEK293T 세포는 형광 강도가 훨씬 더 높았습니다(C3A:p =0.0321; HUVEC:p =0.0055) (그림 5c), HEK293T EV와 공동 배양할 때. 또한 HEK293T 셀은 최대 픽셀이 더 높았습니다(C3A:p =0.0221; HUVEC:p =0.0079; SH-SY5Y:p =0.0486)(그림 5d)와 다른 모든 수혜자 세포주(그림 5b). 강도와 관련하여 SH-SY5Y 세포는 HEK293T EV와 공동 배양할 때 HUVEC보다 유의하게 더 높았습니다(p =0.0304). 이러한 결과는 시험관 내에서 다른 세포주와 비교하여 HEK293T 세포에 의한 HEK293T EV 선택적 흡수를 뒷받침합니다.
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HEK293T EV는 HEK293T 셀보다 흡수 선호도를 표시합니다. HEK293T EV는 HEK293T 세포, C3A 상피 세포, 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC) 및 SY5Y 신경 세포와 공동 배양되었습니다. 아 HEK293T EV와 공동 배양된 수용 세포의 대표적인 IFC 이미지. ㄴ –d 스팟 카운트, 평균 형광 강도 및 최대 픽셀 비율을 통해 대조군 및 서로 비교한 EV 섭취 선호도 분석의 정량화. 막대는 평균 ± SEM을 나타냅니다. 아니 =3; 일원 ANOVA는 Tukey의 사후 검정을 따랐습니다. *p <0.05; ***p <0.01
EV는 신경 질환을 표적으로 하는 치료 및 전달 목적에 연루되어 있기 때문에 인간 신경 줄기 세포(hNSC)와 성숙한 인간 뉴런을 우리 시스템에서 수용 세포주로 사용하여 수용 세포의 분화 상태가 선택적 흡수에 역할을 하는지 조사했습니다. 전기차의. IFC의 대표적인 이미지는 두 세포 유형 모두에서 흡수의 시각적 증거를 표시했지만 hNSC에서 가장 큰 eGFP 국소화를 나타냈습니다(그림 6a). HEK293T EV와 공동 배양된 hNSC는 스팟 수가 더 많습니다(p =0.0082) 및 최대 픽셀(p) =0.0083) 성숙한 뉴런과 비교. 함께, 이러한 결과는 신경 세포의 분화 상태가 HEK293T EV의 흡수에 영향을 미친다는 것을 시사합니다.
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신경 분화 상태는 HEK293T EV 흡수에 영향을 미칩니다. HEK293T EV는 성숙한 인간 뉴런 및 인간 신경 줄기 세포와 공동 배양되었습니다. 아 HEK293T EV와 공동 배양된 수용 세포의 대표적인 IFC 이미지. ㄴ –d 스팟 카운트, 평균 형광 강도 및 최대 픽셀 비율을 통해 대조군 및 서로 비교한 EV 섭취 선호도 분석의 정량화. 막대는 평균 ± SEM을 나타냅니다. 아니 =3; 페어링되지 않은 T 테스트. *p <0.05; ***p <0.01 EV 0대(대조군)
EV에 대한 국제 전문가 그룹은 uptake assay를 위해 EV의 최소 유효 선량을 효과적으로 결정할 필요성을 강조했으며 여기에서 현장에서 효과적으로 채택할 수 있는 시스템을 개발했습니다[26]. EV 활용을 분석할 때 어려움이 있습니다. 예를 들어, 우리와 다른 사람들이 관찰했듯이 EV 선량과 노출 시간이 변경되면 결과가 달라질 수 있습니다[26]. HEK293T EV 용량 및 농도를 운동 변수로 다루었습니다. 또한 시험관 내 최소 유효 용량은 EV의 생체 내 생체 분포를 보다 균일하게 예측하고 EV 치료제 및 전달을 위한 보다 일관된 생체 내 투여 매개변수를 개발하는 데 사용할 수 있습니다. 생체 내 마우스 EV 생체 분포 연구에서 HEK293T EV의 용량 증가는 장기의 상대적 EV 분포의 이동을 초래했습니다[27]. 방광암 EV를 사용한 이전 시험관 내 연구의 결과와 유사하게[39], HEK293T EV는 우리 연구에서 6000EV에서 최소 유효 선량으로 강한 선량 의존성을 나타냈습니다. 우리는 체중당 입자를 사용하는 생체 내 모델과 더 나은 상관 관계가 있는 시험관 내 민감한 용량 측정으로 세포당 입자를 처음으로 사용했습니다. 우리의 데이터는 또한 6000 EVs 이후의 용량 포화 한계를 나타내어, 더 높은 용량이 제한된 이점을 나타낼 수 있음을 나타내어 향후 생체 내 용량 범위 연구에 잠재적으로 정보를 제공할 수 있습니다.
EV 섭취를 측정하는 또 다른 혼란스러운 변수는 EV 섭취에 대한 잠재적인 시간적 영향입니다. 우리 시스템에서 우리는 12~24 h 사이에 잠재적인 감소와 함께 일찍 2 h 흡수와 함께 강한 시간 의존성을 발견했습니다. 우리의 발견과 유사하게, 방광암 세포, 종양 세포 및 기타를 사용하는 소수의 연구에서 시간 의존성이 보고되었으며 빠르면 15분에서 24시간까지 흡수됩니다[29,30,31,32,33, 39, 43, 49]. HEK293T EV에서 볼 수 있듯이 공동 배양 24 h에서 더 낮은 값은 초기 시점에 내부화된 EV의 세포 분열 또는 재활용/분해의 결과일 수 있습니다[50]. 특히, EV는 내부화되었다가 분해되거나 내부화되어 24시간 후에 출시되는 것으로 나타났기 때문에 더 긴 배양은 부정확한 내부화 판독값을 생성할 수 있습니다[31, 50]. 우리의 연구는 HEK293T EV 흡수에 대한 시간 종속 수익률 곡선의 시각적 및 정량적 증거를 제공하기 위해 IFC를 사용한 최초의 연구입니다.
ISEV 입장 보고서에서 알 수 있듯이 EV 라벨의 선택은 흡수에 영향을 미칠 수 있으므로 연구에 사용된 GFP 태깅 방법과 같은 덜 파괴적인 기술이 필요합니다. 특히 조사에 참여한 연구원의 72%는 적절한 대조군이 사용되지 않는 한 지질 염료 실험을 신뢰할 수 없다고 주장합니다[26]. EV 염료는 작은 EV 함량과 확실하게 상관관계가 없으며 소포 크기를 증가시킬 수도 있습니다. Contamination of mislabeled lipoproteins and protein content and dye aggregation contributed to false positives [51, 52]. Therefore, we fused CD63 with an eGFP to label the HEK293T EVs. Similar to other reports of protein tagging, HEK293T EVs were GFP positive with no observed differences in diameter and maintained standard EV surface protein composition [38, 46]. Despite this, it is important to note that labeling EVs with specific EV proteins may limit the tracking to only a few subtypes of EVs expressing the respective markers. Other potential limitations may be that the fluorescence intensity is dependent on protein expression level, the efficiency of EV membrane labeling, and excitation strength of the light source [53]. However, IFC is sensitive, detecting low fluorescence intensity with accurate visualization of CD63-GFP particles at the 100-nm range [38, 54].
EVs display proteins and other signals that may confer selective uptake [22, 23, 55]. Since the first step of EV biogenesis is the invagination of the plasma membrane, the EV membrane contains similar proteins, receptors, adhesion molecules, and integrins when compared with the donor cell membrane [22, 24, 55]. The lipid composition and tetraspanin proteins on EV membranes regulated by donor cells may contribute to EV tropisms with recipient cells [23, 34, 56]. MSC EVs selectively transported contents into MSCs, despite closer proximity to monocytes [24]. In contrast, others report that natural EVs were taken up equally by any cell type, regardless of EV origin [11, 22, 25, 57] when utilizing imaging or functional knockdown assays. Using the IFC platform, we found that HEK293T extracellular vesicles are taken up at greater quantities by HEK293T cells than other reported cell lines, thus suggesting an inherent EV uptake specificity. Through this outcome and the versatility of IFC, EV sources can be appropriately selected and analyzed for targeting specific recipient cells. To our knowledge, this is the first study utilizing imaging flow cytometry to analyze the specificity of HEK293T EVs.
In addition to self-selectivity, differentiation status of recipient cells has been hypothesized to play a role in uptake of EVs [32, 58, 59]. As our group and others have shown, EVs have therapeutic effects in the central nervous system and are known to modulate cell functions in neuronal development and adults [3, 7,8,9, 60]. Here for the first time, differentiation status of neurons affected EV uptake, where human neural stem cells had significantly greater uptake of HEK293T EVs compared to mature neurons. Immature hNSCs more actively internalize exogenous EVs than quiescent mature neurons. Since hNSCs are highly proliferative cells in culture, they may nonspecifically internalize nutrients and EVs. Similarly, immature dendritic cells internalized EVs at higher levels than mature dendritic cells [32, 59]. However, another study with myeloid precursor cells found that the mature dendritic cells and macrophages internalized more EVs than immature dendritic cells and monocytes [58]. The observed differences can be attributed to the phagocytic activity of further differentiated myeloid cells. Due to the in vitro evidence supporting selective uptake, HEK293T EVs can be used to modulate undifferentiated neurons in future therapeutic applications.
In summary, we have further developed a quantitative and high-throughput platform for quantifying HEK293T EV uptake kinetics. This platform can be extended to other donor EVs and recipient cell types and assays for liposomes and synthetic nanoparticle delivery vectors. Significantly, we found that HEK293T EV uptake is a selective process, with specificity towards HEK293T cells. The IFC assays developed here can be used to better define parameters used in in vivo dose escalation and biodistribution studies and provide instrumental information for a predictive model of EV uptake outcomes in vivo.
The datasets generated and/or analyzed during the current study are available from the corresponding author on reasonable request.
Extracellular vesicles
Human embryonic kidney cell line
Imaging flow cytometry
Human neural stem cell
Green fluorescent protein
Bright field
Side scatter
International Society of Extracellular Vesicles
나노물질
구성품 및 소모품 Arduino UNO × 1 Arduino용 PHPoC WiFi 실드 × 1 저항 100k 옴 × 1 저항 1M 옴 × 1 점퍼 와이어 × 1 이 프로젝트 정보 데모 Arduino를 처음 사용하는 경우 초보자를 위한 Arduino 자습서를 시작할 수 있습니다. 작동 방식 Arduino 아날로그 입력 핀을 사용하여 전압을 측정할 수 있습니다. 단, 측정 가능한 최대 전압은 5V입니다.
구성품 및 소모품 Arduino Nano R3 × 1 ElectroPeak 0.96 OLED 64x128 디스플레이 모듈 × 1 RDA Microelectronics RDA8057M FM 라디오 모듈 × 1 필요한 도구 및 기계 3D 프린터(일반) 이 프로젝트 정보 최근에 RDA5807을 발견했습니다. 아주 작은 패키지의 FM 라디오 튜너인 모듈. 매우 저렴하고 통신에 I2C 프로토콜을 사용하므로 IC와 통신하는 데 두 개의