세포외 소포체(EVs)는 대부분의 세포 유형에서 자연적으로 분비되는 나노 크기의 지질 이중층 소포로, 단백질, 지질, 유전 물질을 전달하는 세포 간 소통 기전입니다. EVs의 치료적 잠재력에도 불구하고 EV 섭취 동역학과 특이성에 대한 정보는 제한적입니다. 여기서는 이미징 유세포 분석법(IFC) 기반 플랫폼을 최적화해 인간 배아 신장 세포(HEK293T) EV의 내부화를 고처리량으로 정량 평가했습니다. 용량, 시간, 표적 세포 특이성 효과를 분석한 결과, HEK293T EV 섭취는 용량 및 시간 의존적인 능동적 과정임이 밝혀졌습니다. 또한 in vitro에서 EV 섭취 특이성을 정량화한 결과, HEK293T EV는 동일 기원 세포에 의해 더 많이 내부화되었습니다. 끝으로 신경줄기세포가 성숙 뉴런보다 HEK293T EV를 유의미하게 더 많이 내부화했으며, 이는 말단 분화 세포보다 대사적으로 더 활발한 줄기세포나 전구세포가 능동적 EV 내부화율이 더 높을 수 있음을 시사합니다. EV 섭취, 특히 특이성, 용량 및 시간 의존성, 동역학 분석의 특성화는 표적화되고 효율적인 EV 기반 치료제 개발에 기여할 것입니다.
세포외 소포체 연구는 천연 및 조작 EVs의 치료적·진단적 유용성 덕분에 급성장하는 분야입니다. EVs는 지름 50~1000 nm 범위이며, 모든 세포 유형에서 생성되며 CD63, CD81, CD9 등 막관통 단백질, 지질, 단백질, DNA, RNA, mRNA, microRNA가 풍부합니다 [1-5]. 특히 활성 mRNA와 miRNA 등 EV 내용물은 표적 세포에서 de novo 번역 및 번역 후 조절을 통해 수신 세포를 조절하는 데 관여합니다 [4, 6]. 운동학적 EV 섭취와 내부화를 이해하고 조절하면 결국 EV 내용물을 충분한 농도로 표적 세포에 최적화해 전달함으로써 치료적 이점을 얻을 수 있습니다.
한때 '세포의 쓰레기'로 여겨졌던 EVs는 생체적합성, 낮은 면역원성과 독성, 반복 투여 가능, 다양한 투여 경로, 약물 및 유전자 치료제 전달 잠재력 등 많은 이점 덕분에 세포 치료제의 대안으로 활용되고 있습니다 [3]. 우리 연구진은 신경줄기세포 유래 EV가 뇌졸중과 외상성 뇌손상에서 긍정적 효과를 보임을 보고한 바 있습니다. 마우스와 돼지 뇌졸중 모델 모두에서 EV가 뇌졸중 후 조직 및 기능적 회복을 개선했습니다 [3, 7, 8]. 또한 설치류 외상성 뇌손상 모델에서 EV가 신경보호 효과와 기능적 이점을 보임을 입증했습니다 [9]. 이러한 관측된 효과와 EVs의 미래 잠재력에도 불구하고, EV 섭취 특이성과 동역학에 대한 이해가 부족해 EV 치료제의 임상 전환을 방해할 수 있습니다.
EVs는 유전자 치료제와 화학 물질을 포함한 치료제를 탑재한 전송 벡터로도 조작되어 나노입자 치료제 및 전달 벡터의 대안으로 연구되고 있습니다 [4, 10-12]. HEK293T 세포는 빠른 증식, 높은 EV 수율, 쉬운 유전자 조작 덕분에 EV 생산 세포로 널리 사용됩니다 [13-17]. HEK293T EV는 유방암 miRNA 치료제 등 유전자 치료제를 전달했으며 [12], 슈반노마 모델에서 화학요법제와 치료용 단백질 구축물을 전달하는 데 사용되었습니다 [18]. 합성 나노입자 in vitro 세포독성 연구와 유사하게, MTT 독성 시험에서 비탑재 HEK293T EV는 낮은 독성을, 화학요법제 탑재 시 높은 세포독성을 보였습니다 [10, 18-21]. HEK293T EV의 이러한 광범위한 활용을 고려해 본 연구에서 이들의 동역학과 특이성을 분석했습니다.
선택적 또는 특이적 섭취란 EV가 특정 세포 유형을 표적화하는 타고난 능력을 말합니다. EV 내부화 메커니즘에 대한 풍부한 증거가 있으나 섭취 특이성에 대한 합의는 부족합니다 [22]. 종종 EV는 모세포와 유사한 수신 세포에 의해 선택적으로 섭취되며, 상피세포는 다른 수신 세포보다 상피 유래 EV를 더 많이 내부화합니다 [23, 24]. 중간엽 줄기세포(MSC)는 in vitro에서 다른 세포주보다 MSC 유래 EV를 유의미하게 더 많이 내부화합니다 [24]. 그러나 다른 연구에서는 EV가 모든 세포 유형에 의해 내부화되며 in vivo 투여 시 비선택적 생체분포를 보인다고 보고했습니다 [22, 25]. EV의 막대한 치료적 잠재력과 관심에도 불구하고 EV 섭취 특이성 이해에 결핍이 있습니다. EV 섭취 특이성을 더 잘 이해하면 관심 있는 수신 세포에 선택적으로 내부화되는 EV 생산 세포를 적절히 선택해 EV 치료 적용성을 높일 수 있습니다.
상충하는 EV 섭취 결과의 잠재적 이유는 측정 플랫폼의 표준화 부족, 특히 용량과 시간 효과 분석 부재입니다. 최근 국제 세포외 소포체 학회(ISEV) 전문가 그룹은 EV 섭취에 대한 용량, 시간 등 교란 요인 분석의 필요성을 강조하는 입장문을 발표했습니다 [26]. 이들은 '한 가지 용량이 모든 경우에 맞지 않는다'고 밝히며 용량이 EV 섭취나 선택성에 영향을 줄 수 있다고 지적했습니다 [26]. HEK293T EV 용량 증가가 in vivo 생체분포 패턴을 변화시킵니다 [27]. 혈청 유래 EV 섭취 프로파일도 용량에 따라 유의미하게 변합니다 [28]. 또한 EV와 수신 세포 공동배양 시간이 15분~48시간 [24, 29-33]으로 다양해 섭취 측정이 달라질 수 있습니다. EV 연구자와 산업계가 채택한다면, 표준 용량과 시간 곡선을 결정해 최소 유효 용량을 식별하는 정량화 가능하고 신뢰할 수 있는 공정이 더 견고하고 유용한 연구로 이어질 것입니다.
이전에는 표준 유세포 분석과 공초점 현미경 등 다양한 저처리량 현미경 기법을 사용해 EV 섭취를 분석했습니다 [32-34]. 그러나 이들 기술엔 여러 한계가 있습니다. 공초점 현미경은 시간 소모적이고 주관적일 수 있습니다. 기존 유세포계는 세포 크기 생물학적 입자 측용으로 설계돼 EV 군집 또는 우연 일치를 구별 못 하며, 트리거링으로 인한 노이즈가 증가합니다 [35-38]. ISEV 그룹이 언급했듯 기존 유세포 분석의 물리적 한계에 대한 인식이 커지고 있으며, 100 nm 범위 검출 한계를 가진 특수 유세포 분석 수요가 강조됩니다 [26, 38]. 이미징 유세포 분석(IFC)은 유세포 분석의 고처리량 정량적 특성과 형광 이미징 기술을 결합해 100 nm 직경까지의 본질적으로 작은 형광 입자를 분해할 수 있습니다 [38]. IFC 역량은 낮은 노이즈/배경, 감소된 군집, 영상 선명도를 위한 전하 결합 소자(CCD)로 이어집니다 [37, 39]. 이러한 특성은 시각적 확인과 함께 고처리량 방식으로 EV 특성화와 섭취를 위한 게이팅 전략 개발을 돕습니다 [36, 37, 40].
본 연구에서는 CD63-eGFP 발현 HEK293T 세포를 EV 생산용 공여 세포주로 사용했습니다. 치료제 개발에 흔히 쓰이기 때문입니다. 분리된 형광 EV를 수신 세포주(신경 및 내피 세포)와 공동배양했습니다. 섭취를 IFC로 정량화해 in vitro 세포 시스템에서 중요한 운동학적 EV 섭취와 내부화 특성을 측정하는 표준화된 플랫폼을 구축했습니다. 또한 다양한 조건과 배양 세포주에서 형광 EV 섭취를 정량화하는 공정 데이터를 제공해 선택적 EV 섭취를 규명했습니다.
인간 배아 신장 세포(HEK293T)는 ATCC에서 구입해 10% 태아 소 혈청, 100 U/mL 페니실린, 100 µg/mL 스트렙토마이신이 든 DMEM에서 배양했습니다. 인간 신경줄기세포(hNSC), SH-SY5Y 신경세포, C3A 간 상피세포, 인간 탯줄 정맥 내피세포(HUVEC), 뉴런은 모두 37 °C, 5% CO₂ 표준 조건에서 EV 섭취 분석 전 배양했습니다.
CD63-eGFP 플라스미드 DNA는 Addgene(#62964)에서 구했습니다. CD63-pEGFP C2는 Paul Luzio의 기증(Addgene plasmid #62964)입니다. HEK293T 세포를 10-cm 접시에서 70% 컨플루엔시까지 배양한 후 Lipofectamine 2000으로 제조사 지침에 따라 10 µg 플라스미드 DNA를 형질주입했습니다. 형질주입 24시간 후 배지를 표준 HEK293T 배지(태아 소 혈청 무함유)로 교체하고 3일 연속 수집했습니다. 앞서 기술한 방법 [3]대로 HEK293T 배지를 0.22-µm 필터로 여과하고 100-kDa 재생 셀룰로오스 Amicon 원심 필터 장치로 초여과 농축한 후 PBS++로 두 번 세척했습니다. EV를 1 mL로 농축하고 Nanosight NS300으로 제조사 프로토콜(영국 Malvern)에 따라 농도와 크기 분포를 측정했습니다. EV는 서로 다른 HEK293T 배양 용기에서 분리했으며, 각 용기를 별도 생물학적 반복으로 간주하고 각 생물학적 반복 내 3회 기술적 반복(조건당 최소 9개 샘플)을 수행했습니다.
수신 세포주를 6-well 플레이트에서 60% 컨플루엔시로 파종해 37 °C 표준 배양 조건으로 24시간 배양했습니다. 표준 배지를 태아 소 혈청 무함유(FBS⁻) 배지로 교체한 후 EV 공동배양을 수행했습니다. GFP-표지 EV를 다양한 용량과 시간점에서 세포에 투여했습니다. 공동배양 후 세포를 5% 트립신으로 재현탁해 약 100만 세포/50 µL로 농축해 유세포 분석용으로 준비했습니다. 37 °C는 우리 분석에서 EV 섭취 실험 표준으로, 세포 배양과 in vitro EV 섭취 플랫폼 모두에서 표준으로 사용되어 왔습니다 [31, 41-44].
EV를 수신 세포와 4 °C에서 공동배양해 세포 증식을 효과적으로 '일시정지'하고 능동적 과정을 억제했습니다 [45]. 4 °C는 모든 능동적 형태의 EV 섭취를 억제합니다 [31, 41-44].
수신 세포를 4% 파라포름알데히드로 얼음 위에서 30분간 고정한 후 PBS로 세척하고 즉시 EV와 공동배양해 모든 능동적 EV 섭취를 억제했습니다.
측정은 ImageStreamX Mark II 이미징 유세포계(Luminex Corporation, 시애틀, 워싱턴)로 INSPIRE 소프트웨어를 사용해 수행했습니다. 최소 5,000~10,000 세포 이벤트를 획득했습니다. 각 생물학적 샘플은 3개 기술적 반복 웰로 반복되고 개별적으로 ISX에서 획득했습니다. 밝은 시야 이미지는 채널 1, 측면 산란(785 nm)은 채널 6에서 수집했습니다. 녹색 형광 단백질(GFP)은 488 nm 아르곤 레이저(200 mW)로 여기시키고 채널 2(480-560 nm)에서 형광을 수집했습니다. 모든 샘플에 60× 배율을 사용했으며 높은 감도를 위해 낮은 획득 속도를 적용했습니다.
데이터와 이미지 분석은 IDEAS 소프트웨어(Luminex)로 수행했습니다. 게이팅 전략은 다음과 같습니다:
초점 게이트: Gradient RMS 값을 사용해 초점 밖 세포 제거.
초점 맞은 세포 게이팅: 밝은 시야 면적 대 밝은 시야 종횡비로 이중체와 파편 제거. 게이팅된 데이터로 히스토그램 생성 및 형광 강도(이미지 내 모든 픽셀 합), 최대 픽셀 강도(이미지 내 가장 밝은 픽셀 강도), 내부 알고리즘을 통한 스팟 카운트 값 등 통계 참고치 생성. 스팟 카운트 특성은 해당 IDEAS 위자드로 생성. 스팟 카운트, 평균 강도, 최대 픽셀 비율은 (EV 포함 출력값 / EV 미포함 출력값) 공식으로 계산.
모든 정량 데이터는 GraphPad Prism 8.1.2(캘리포니아 샌디에이고)로 분석했으며 3회 반복했습니다. 데이터는 평균 ± 표준오차(SEM)로 표시했습니다. 통계적 유의성은 비짝지음 T 검정 또는 일원분산분석(ANOVA)에 Tukey 또는 Dunnett 사후 검정을 적절히 적용해 대조군과 비교했습니다. p < 0.05를 유의미한 것으로 간주했습니다.
EV 동역학과 섭취 분석을 위한 형광 표지 EV 생성을 위해 HEK293T 세포에 CD63-eGFP 융합 단백질 플라스미드를 형질주입했습니다. CD63은 엑소좀 막에 흔히 풍부한 테트라스파닌 단백질로 EV 형광 표지의 최적 표적입니다 [46, 47]. HEK293T 세포 배양에서 소모된 배지를 수집하고 앞서 보고한 방법 [8]으로 EV를 분리했습니다. CD63-eGFP 형질주입 HEK293T 세포에서 분리한 EV와 비형질주입 HEK293T 세포에서 분리한 EV의 크기와 분포를 비교했습니다. 대조군과 CD63-eGFP 형질주입 HEK293T EV는 나노트래킹 소프트웨어 측정 결과 평균 중앙값 직경이 각각 110.28 nm와 103.616 nm로(그림 1a), 보고된 HEK293T EV 크기와 일치합니다 [13, 15, 27, 48]. 비형질주입과 CD63-eGFP 형질주입 HEK293T EV 간 중앙값 직경(p = 0.1615)과 분포(p = 0.4225)에 유의미한 차이는 없었습니다. eGFP 표지는 HEK293T EV 크기를 변화시키지 않았습니다(그림 1b).
CD63-eGFP 표지 HEK293T EV 특성화. HEK293T(대조군)와 CD63-eGFP 발현 HEK293T 배양 배지에서 EV 분리. a 나노트래킹 소프트웨어로 기록한 대표 EV 크기 분포. b 형질주입 vs 비형질주입 HEK293T EV 평균 직경 분포 정량화. c IFC 이미지: 음성 대조 비드, HEK293T 대조군 EV, CD63-eGFP 표지 EV. BF=밝은 시야, GFP=녹색 형광 단백질(488 nm 여기 레이저), SSC=측면 산란. GFP 채널 양성 신호는 형광 HEK293T EV 의미. d 유세포 분석 기반 MACSPlex 표면 표지자 발현: 비형질주입 HEK293T EV와 HEK293T CD63-eGFP EV. 두 EV 출처 모두 CD29, CD9, CD63, CD81 양성(상대 형광 단위, X로 양성 표시). 막대는 평균 ± SEM; N = 3; 비짝지음 T 검정. n.s. = p > 0.05
IFC 분석으로 CD63-eGFP가 EV와 연관돼 있는지 확인했습니다. 형광 음성 대조로 버퍼 용액 내 1.34 µM 비드(그림 1c 위)는 488 nm 여기 파장에서 형광이 없었으나 밝은 시야(BF)와 측면 산란(SSC)에서 보였습니다. 비표지 HEK293T EV는 BF, GFP, SSC 모두에서 음성이었으며, 이는 BF 임계값 이하의 작은 크기와 형광 부재를 시사합니다(그림 1d 중간). BF 부재는 EV 크기가 300 nm 미만임을 의미하며, EV 군집이 최소화됨을 시사합니다. 마지막으로 CD63-eGFP 표지 EV는 BF에서 음성, GFP 채널에서 양성으로 HEK293T EV의 양성 형광을 나타냈습니다(그림 1c 아래). GFP 채널 양성 신호는 단일 EV 또는 형광 EV 그룹을 나타낼 수 있습니다. 종합하면 분리된 HEK293T EV는 표준 크기와 단백질 표지자 프로파일을 가지며, eGFP 표지가 HEK293T EV 크기를 변화시키지 않음을 보여줍니다 [5, 27].
상용 유세포 분석 기반 법으로 공통 EV 표지자를 측정해 전체 EV 테트라스파닌 프로파일을 확인했습니다 [5]. 대조군과 CD63-eGFP 발현 HEK293T 세포에서 분리한 EV는 CD9, CD63, CD81 등 표준 EV 표지자에 양성이었습니다(그림 1d). 앞서 보고된 대로 CD29도 HEK293T EV와 CD63-eGFP 형질주입 HEK293T EV 표면에서 발견되었습니다 [5]. 이 결과는 본 연구의 HEK293T EV 분리 및 표지 방법이 공통 HEK293T 엑소좀 표지자를 가진 EV를 생성함을 나타냅니다.
두 가지 억제 내부화 분석을 수행했습니다. HEK293T EV를 수신 세포와 4 °C(저온)에서 공동배양하거나 파라포름알데히드로 미리 고정한 수신 세포(고정)와 공동배양했습니다. 두 처리 모두 생리적 조건(37 °C)에서 EV와 공동배양한 수신 세포에 비해 eGFP 표지 EV 존재를 감소시켰습니다(그림 2a). 저온 및 고정 억제 분석은 처리 없는 수신 세포에 비해 형광 신호의 스팟 카운트(저온: p = 0.0127, 고정: p = 0.0078), 강도(저온: p = 0.0105, 고정: p = 0.0374), 최대 픽셀(저온: p = 0.0159, 고정: p = 0.0149)을 유의미하게 감소시켜 EV 섭취 억제를 나타냈습니다. 이 결과는 eGFP 국소화와 출력 매개변수 증가가 이후 섭취 분석에서 HEK293T EV 내부화를 의미함을 추론하게 합니다.
EV 내부화 억제 분석. HEK293T 세포를 다양한 조건에서 HEK293T EV와 공동배양. 대조군(37 °C)은 생리적 37 °C 환경 공동배양. 저온은 4 °C 환경 공동배양. 고정 억제는 수신 세포를 PFA 고정 후 공동배양. a 수신 세포 대표 IFC 이미지. 열 1: BF(밝은 시야). 열 2: GFP(녹색 형광 단백질, 488 nm 여기 레이저). 열 3: BF와 GFP 병합. 대조군은 EV 내부화를 나타내는 양성 GFP. b–d 대조군 대비 억제 분석 정량화: 스팟 카운트, 평균 형광 강도, 최대 픽셀. 막대: 평균 ± SEM; N = 3; 일원분산분석 후 Tukey 사후 검정으로 대조군 비교. *p < 0.05; ***p < 0.01
IFC 플랫폼 표준 용량 곡선 개발을 위해 HEK293T EV를 HEK293T 수신 세포와 37 °C에서 0~20,000 EV/세포 증가 용량으로 공동배양했습니다. 대표 IFC 이미지에서 EV 용량 증가에 따른 eGFP 형광 시각적 증가가 관찰되었습니다(그림 3a). 공동배양 HEK293T 세포당 6,000 EV에서 최저 검출 한계가 나타났습니다. 이 수준에서 스팟 카운트(p = 0.0012), 강도(p = 0.0075), 최대 픽셀(p = 0.0005) 측정값이 EV 없는 수신 세포보다 유의미하게 높았습니다(그림 3b-d). 따라서 우리 실험 조건에서 6,000 HEK293T EV가 섭취 저역치입니다. 마찬가지로 10,000과 20,000 EV 용량에서 스팟 카운트(10,000: p = 0.0009; 20,000: p < 0.0001), 강도(10,000: p < 0.0001; 20,000: p < 0.0001), 최대 픽셀(10,000: p < 0.0001; 20,000: p < 0.0001)이 EV 없는 세포보다 유의미하게 높았습니다. 높은 용량 간 비교에서 6,000 vs 10,000(p = 0.999, p = 0.0927), 10,000 vs 20,000(p = 0.8482, p = 0.999, p = 0.6056, p = 0.5281) 간 스팟 카운트, 강도, 최대 픽셀에 유의미한 차이는 없었습니다. 6,000 vs 20,000 비교에서도 스팟 카운트(p = 0.0787)와 강도(p = 0.8083)에 통계적 차이는 없었으나 최대 픽셀에서 유의미한 차이(p = 0.0140)가 있었습니다. 전반적으로 수율 곡선은 모든 매개변수(스팟, 강도, 최대 픽셀, p < 0.0001)에서 유의미한 용량 의존성을 보였습니다. 이는 HEK293T EV 섭취가 세포당 최소 6,000 EV 역치를 가진 용량 의존적 과정임을 나타냅니다.
HEK293T EV 섭취의 용량 효과, 최소 역치 6,000 EV. HEK293T 세포를 0~20,000 EV/세포 증가 용량으로 HEK293T EV와 공동배양. a 각 EV 용량별 수신 세포 대표 IFC 이미지. GFP 국소화는 HEK293T EV 섭취 의미. b–d 대조군 및 그룹 간 비교 정량화: 스팟 카운트, 평균 형광 강도, 최대 픽셀 비율. 막대: 평균 ± SEM; N = 3; 일원분산분석 후 Tukey 사후 검정. *p < 0.05; ***p < 0.01
세포당 6,000 EV로 HEK293T EV를 HEK293T 세포와 공동배양하며 IFC 전 공동배양 시간을 5분~24시간으로 늘렸습니다. EV 노출 길이가 수신 세포 가시 형광량에 핵심적 역할을 했으며, 12시간 후 감소했습니다(그림 4a). 초기 30분 공동배양에서 스팟 카운트 유의미 증가(p = 0.0081)로 EV 섭취 경향이 나타났으나 다른 매개변수(강도: p = 0.3073, 최대 픽셀: p = 0.0952)에서는 유의미하지 않았습니다(그림 4b-d). 2시간 공동배양에서 스팟 카운트(p = 0.0028), 강도(p = 0.0420), 최대 픽셀(p = 0.0006)이 EV 없는 수신 세포보다 유의미하게 높았습니다. 4시간에서도 모든 매개변수가 대조군보다 높았습니다(스팟 카운트: p = 0.0003, 강도: p < 0.0001, 최대 픽셀: p < 0.0001). 강도와 최대 픽셀은 4, 12, 24시간에서 대조군보다 높게 유지되었습니다. 4시간과 12시간 공동배양 간 모든 섭취 매개변수에 차이는 없었습니다(스팟: p = 0.999, 강도: p = 0.5797, 최대 픽셀: p = 0.2489). 그러나 12시간과 24시간 사이 강도(p = 0.0191)와 최대 픽셀(p = 0.0027)이 감소했습니다(그림 4c, d). 용량 곡선과 유사하게 HEK293T EV 섭취는 시간 의존적이며 4시간 배양에서 일관된 섭취, 12시간에서 피크를 보입니다. 종합적으로 세포당 6,000 EV 용량과 4시간 공동배양을 후속 섭취 분석 표준으로 정했습니다.
HEK293T EV 섭취의 시간 의존성. HEK293T 세포를 세포당 6,000 HEK293T EV로 증가 시간 공동배양. a 수신 세포 대표 IFC 이미지. GFP 국소화는 HEK293T EV 섭취 증가 의미. b–d 대조군 및 그룹 간 비교 정량화: 스팟 카운트, 평균 형광 강도, 최대 픽셀 비율. 막대: 평균 ± SEM; N = 3; 일원분산분석 후 Tukey 사후 검정. *p < 0.05; ***p < 0.01
EV 섭취가 자발 세포 유형에 의해 선호적으로 이루어지는 선택적 과정이라는 가설을 IFC로 검증했습니다. HEK293T EV를 HEK293T 세포 또는 다른 세포주(상피: C3A 간세포, 내피: HUVEC, 신경: SH-SY5Y 교모세포종 세포)와 공동배양했습니다. eGFP 형광이 다른 세포 유형보다 HEK293T 세포에서 더 풍부했습니다(그림 5a). HEK293T EV 공동배양 시 HEK293T 세포가 C3A와 HUVEC보다 유의미하게 높은 형광 강도(C3A: p = 0.0321; HUVEC: p = 0.0055)를 보였습니다(그림 5c). 또한 HEK293T 세포는 모든 다른 수신 세포주보다 높은 최대 픽셀(C3A: p = 0.0221; HUVEC: p = 0.0079; SH-SY5Y: p = 0.0486)을 보였습니다(그림 5d). 강도 측면에서 SH-SY5Y 세포는 HUVEC보다 HEK293T EV 공동배양 시 유의미하게 높았습니다(p = 0.0304). 이 결과는 HEK293T EV가 in vitro에서 다른 세포주보다 HEK293T 세포에 의해 선택적으로 섭취됨을 지지합니다.
HEK293T EV의 HEK293T 세포 섭취 선호도. HEK293T EV를 HEK293T 세포, C3A 상피세포, HUVEC, SY5Y 신경세포와 공동배양. a HEK293T EV 공동배양 수신 세포 대표 IFC 이미지. b–d 대조군 및 상호 비교 정량화: 스팟 카운트, 평균 형광 강도, 최대 픽셀 비율. 막대: 평균 ± SEM; N = 3; 일원분산분석 후 Tukey 사후 검정. *p < 0.05; ***p < 0.01
EVs가 신경질환 표적 치료 및 전달 목적으로 연관돼 있어, 인간 신경줄기세포(hNSC)와 성숙 인간 뉴런을 수신 세포주로 사용해 수신 세포 분화 상태가 EV 선택적 섭취에 미치는 역할을 조사했습니다. IFC 대표 이미지에서 두 세포 유형 모두 섭취 증거를 보였으나 hNSC에서 가장 큰 eGFP 국소화가 관찰되었습니다(그림 6a). HEK293T EV와 공동배양한 hNSC는 성숙 뉴런보다 높은 스팟 카운트(p = 0.0082)와 최대 픽셀(p = 0.0083)을 보였습니다. 이 결과들은 신경세포 분화 상태가 HEK293T EV 섭취에 영향을 미침을 시사합니다.
신경 분화 상태가 HEK293T EV 섭취에 미치는 영향. HEK293T EV를 성숙 인간 뉴런과 인간 신경줄기세포와 공동배양. a HEK293T EV 공동배양 수신 세포 대표 IFC 이미지. b–d 대조군 및 상호 비교 정량화: 스팟 카운트, 평균 형광 강도, 최대 픽셀 비율. 막대: 평균 ± SEM; N = 3; 비짝지음 T 검정. *p < 0.05; ***p < 0.01 (0 EV 대조군 대비)
EV 국제 전문가 그룹은 EV 섭취 분석을 위한 최소 유효 용량 결정 필요성을 강조했으며, 여기에서 해당 분야가 효과적으로 채택할 수 있는 시스템을 개발했습니다 [26]. EV 섭취 분석에는 과제가 있습니다. 우리와 다른 연구자들이 관찰했듯 EV 용량과 노출 시간을 변경하면 결과가 달라질 수 있습니다 [26]. 우리는 HEK293T EV 용량과 농도를 운동학적 변수로 다뤘습니다. 또한 in vitro 최소 유효 용량은 in vivo EV 생체분포를 더 균일하게 예측하고 EV 치료제 및 전달을 위한 일관된 in vivo 투여 매개변수 개발에 활용될 수 있습니다. in vivo 마우스 EV 생체분포 연구에서 HEK293T EV 용량 증가가 장기 내 상대적 EV 분포 변화를 초래했습니다 [27]. 방광암 EV를 사용한 이전 in vitro 연구 [39]와 유사하게, HEK293T EV는 우리 연구에서 6,000 EV 최소 유효 용량으로 강한 용량 의존성을 보였습니다. 우리는 in vitro에서 입자/세포를 민감한 용량 측정으로 처음 사용했으며, 이는 입자/체중을 사용하는 in vivo 모델과 더 잘 연관됩니다. 우리 데이터는 6,000 EV 이후 용량 포화 한계도 시사하며, 이는 더 높은 용량이 제한적 이점만 가질 수 있음을 나타내 향후 in vivo 용량 범위 연구에 정보를 줄 수 있습니다.
EV 섭취 측정의 또 다른 교란 변수는 시간적 효과입니다. 우리 시스템에서 2시간부터 강한 시간 의존성이 나타났으며 12~24시간 사이 잠재적 감소가 있었습니다. 우리 결과와 유사하게 방광암 세포, 종양 세포 등을 사용한 소수 연구에서 15분~24시간 사이 시간 의존성이 보고되었습니다 [29-33, 39, 43, 49]. HEK293T EV에서 24시간 공동배양 시 낮은 값은 세포 분열이나 초기 시점에 내부화된 EV의 재활용/분해 결과일 수 있습니다 [50]. 구체적으로 EV가 내부화 후 분해되거나 방출됨이 24시간 후 나타날 수 있어 더 긴 배양이 부정확한 내부화 판독값을 낳을 수 있습니다 [31, 50]. 우리 연구는 IFC를 사용해 HEK293T EV 섭취의 시간 의존적 수율 곡선에 대한 시각적·정량적 증거를 최초로 제공했습니다.
ISEV 입장문이 제안하듯 EV 표지 선택이 섭취에 영향을 줄 수 있어, 우리 연구에서 사용한 GFP 표지법 같은 덜 파괴적 기술이 필요합니다. 구체적으로 설문 참여 연구자 72%가 적절한 대조군 없이는 지질 염색 실험이 신뢰할 수 없다고 주장했습니다 [26]. EV 염색제는 작은 EV 내용물과 안정적으로 연관되지 않으며 베시클 크기를 증가시킬 수 있습니다. 잘못 표지된 지단백과 단백질 오염, 염료 응집이 위양성에 기여했습니다 [51, 52]. 따라서 우리는 CD63과 eGFP를 융합해 HEK293T EV를 표지했습니다. 다른 단백질 표지 보고와 유사하게, HEK293T EV는 GFP 양성이었으며 직경 차이 없이 표준 EV 표면 단백질 조성을 유지했습니다 [38, 46]. 그럼에도 불구하고 특정 EV 단백질로 EV를 표지하면 해당 표지자를 발현하는 일부 EV 아형만 추적 가능해질 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 다른 잠재적 한계는 형광 강도가 단백질 발현 수준, EV 막 표지 효율, 광원 여기 강도에 의존할 수 있다는 점입니다 [53]. 그러나 IFC는 100 nm 범위에서 CD63-GFP 입자를 정확한 시각화와 함께 낮은 형광 강도도 검출할 만큼 민감합니다 [38, 54].
EVs는 선택적 섭취를 부여할 수 있는 단백질과 기타 신호를 표출합니다 [22, 23, 55]. EV 발생 첫 단계가 세포막 함입이므로, EV 막은 공여 세포막과 유사한 단백질, 수용체, 부착 분자, 인테그린을 포함합니다 [22, 24, 55]. 공여 세포가 조절하는 EV 막 지질 조성과 테트라스파닌 단백질이 수신 세포와의 EV 친화성에 기여할 수 있습니다 [23, 34, 56]. MSC EV는 단구와 더 가까운 근접성에도 불구하고 MSC로 내용을 선택적으로 수송했습니다 [24]. 반면 천연 EV가 EV 기원과 무관하게 모든 세포 유형에 의해 동등하게 섭취된다는 보고도 있습니다 [11, 22, 25, 57] (이미징 또는 기능적 녹다운 분석 사용 시). IFC 플랫폼을 사용해 우리는 HEK293T 세포외 소포체가 다른 보고된 세포주보다 HEK293T 세포에 의해 더 많은 양으로 섭취됨을 발견해 고유한 EV 섭취 특이성이 있음을 시사했습니다. 이 결과와 IFC의 다재다능함을 통해 EV 출처를 적절히 선택하고 분석해 특정 수신 세포를 표적화할 수 있습니다. 우리 지식으로는 HEK293T EV 특이성을 이미징 유세포 분석으로 분석한 첫 연구입니다.
자체 선택성 외에도 수신 세포 분화 상태가 EV 섭취에 역할을 할 것으로 가설화되었습니다 [32, 58, 59]. 우리 그룹과 다른 연구자들이 보인 바와 같이 EV는 중추신경계에서 치료 효과가 있으며 신경 발달과 성인에서 세포 기능을 조절하는 것으로 알려져 있습니다 [3, 7-9, 60]. 여기서 최초로 뉴런 분화 상태가 EV 섭취에 영향을 미침이 밝혀졌으며, 인간 신경줄기세포가 성숙 뉴런보다 HEK293T EV를 유의미하게 더 많이 섭취했습니다. 미성숙 hNSC가 휴지 상태의 성숙 뉴런보다 외인성 EV를 더 능동적으로 내부화합니다. hNSC가 배양에서 고증식성 세포이므로 영양소와 EV를 비특이적으로 내부화할 수 있습니다. 유사하게 미성숙 수지상세포가 성숙 수지상세포보다 EV를 더 많이 내부화했습니다 [32, 59]. 그러나 골수 전구세포 연구에서는 성숙 수지상세포와 대식세포가 미성숙 수지상세포와 단구보다 더 많은 EV를 내부화했습니다 [58]. 관찰된 차이는 더 분화된 골수 세포의 식균 활동에 기인할 수 있습니다. in vitro 증거가 선택적 섭취를 지지하므로, HEK293T EV는 미래 치료 적용에서 미분화 뉴런 조절에 사용될 수 있습니다.
요약하면, 우리는 HEK293T EV 섭취 동역학을 정량화하기 위한 정량적이고 고처리량 플랫폼을 추가 개발했습니다. 이 플랫폼은 다른 공여 EV, 수신 세포 유형, 리포좀 및 합성 나노입자 전달 벡터 분석으로 확장 가능합니다. 중요한 것은 HEK293T EV 섭취가 HEK293T 세포에 특이적인 선택적 과정임을 발견했습니다. 여기서 개발된 IFC 분석은 in vivo 용량 증량 및 생체분포 연구에 사용되는 매개변수를 더 잘 정의하고 in vivo EV 섭취 결과를 예측하는 모델에 기여할 수 있습니다.
현재 연구 동안 생성 및/또는 분석된 데이터셋은 합리적 요청 시 교신저자로부터 제공 가능합니다.
나노물질
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