다기능 나노복합체를 기반으로 한 복합 요법은 암 치료 효능을 향상시키는 유망한 접근 방식으로 간주되었습니다. 여기에서 우리는 표적화된 다기능 poly(N -이소프로필아크릴아미드)(PNIPAM) 기반의 나노복합체는 유방암 세포에 대한 시너지 화학-광열 요법을 위한 것입니다. 전이 온도를 높이기 위해 PNIPAM의 합성 과정에서 아크릴산(AAc)이 추가되었으며, 이는 고유한 하임계 용액 온도가 42°C로 변경되었음을 보여줍니다. 근적외선(NIR) 레이저 조사(808nm)에서 광열 효과를 생성하기 위해 폴리피롤(ppy) 나노입자를 PNIPAM-AAc에 균일하게 장식했습니다. 암 표적 리간드인 엽산(FA)은 PNIPAM 네트워크의 잉여 카르복실기에 성공적으로 접합되었습니다. PNIPAM-ppy-FA 나노복합체의 약물 방출은 NIR 레이저 조사에 의한 온도 변화에 반응하여 효율적으로 촉발되었습니다. 우리는 또한 PNIPAM-ppy-FA가 엽산 수용체 매개 endocytosis에 의해 MDA-MB-231 유방암 세포에 내재화되었고 화학 광열 효과의 조합 치료로 암 치료 효능이 크게 향상되었음을 확인했습니다. 따라서 우리의 연구는 다양한 유형의 암세포에 대한 시너지 치료 접근법을 위한 다기능 나노운반체 제제의 추가 탐구를 장려합니다.
약물 전달 시스템(DDS)은 암 치료에서 치료 효과를 달성하기 위해 약제학적 화합물을 투여하는 강력한 방법 중 하나입니다[1]. DDS의 목적은 활성 약물을 전달하여 원하는 부위에 축적하는 것이지만, 기존의 DDS는 심각한 부작용과 비효율적인 치료 효율을 동반하는 경우가 많다[2, 3]. 이러한 장애를 극복하기 위해 고도 DDS 및 항원 농도를 포함하는 온도, 빛, pH, 전기장, 산화 환원, 효소 활성 및 항원 농도와 같은 특정 내부 또는 외부 자극에 반응할 수 있는 다양한 나노캐리어가 개발되었습니다. 지속적이고 제어된 약물 방출을 유도하는 데 사용됩니다[4,5,6].
다양한 자극 중 하나인 열반응성 나노운반체는 특정 온도에서 나노입자로 약물이 방출될 수 있기 때문에 암 치료를 향상시키는 강력한 접근 방식입니다[7]. 게다가, 열에 민감한 나노입자의 장점은 완전한 암 근절을 유도하기 위해 다른 자극과 결합될 수 있다[8, 9]. 열반응성 나노입자로서 폴리(N -isopropylacrylamide)(PNIPAM)은 약 32°C의 낮은 임계 용액 온도(LCST)에서 상전이를 나타내기 때문에 가장 주목을 받았습니다[10, 11]. LCST 아래에서 PNIPAM의 전체 폴리머 네트워크는 수소 결합으로 인해 팽창된 상태로 존재합니다. 반면에 PNIPAM은 소수성 상태로 전환되고 수소 결합이 감소하여 LCST 위의 폴리머 네트워크가 붕괴됩니다[12, 13]. PNIPAM 기반 나노운반체는 다른 나노입자에 비해 높은 약물 캡슐화 효율, 약물 방출 용량 조절, 우수한 생체적합성 등의 장점이 있다[14]. 그러나 체온에서 자발적인 약물 방출로 인해 PNIPAM 기반 나노 캐리어는 고급 DDS에서 사용하기에 충분하지 않습니다. 이를 극복하기 위해 이전 연구에서는 PNIPAM의 합성 과정에서 유기산(예:비닐 아세트산, 아크릴 및 알릴 아세트산)을 추가하여 지속적인 약물 방출로 인한 부작용을 줄였습니다[15].
최근에는 2개 이상의 자극을 통합하여 나노입자를 유발하여 암 치료 효능을 높이는 새로운 치료법에 대한 많은 연구가 이루어지고 있다[16,17,18]. 예를 들어, 광열 요법(PTT)은 종양에 대한 정밀한 광 제어, 비침습적 침투 및 정상 세포에 대한 낮은 독성과 같은 여러 이점을 나타냅니다[19, 20]. 나노입자와 PTT를 결합하기 위해서는 광열제(예:금 나노막대, 탄소나노튜브, 폴리피롤(ppy), 산화그래핀)가 PNIPAM 기반 나노입자에 균일하게 캡슐화되어야 합니다[21,22,23]. 이전 연구에서는 열 및 pH 반응성 PNIPAM 껍질을 사용하여 메조포러스 실리카 코팅 금 나노막대를 제작하고 생체 내 암 치료 응용 분야를 추가로 조사했습니다[24]. 그러나 이러한 PNIPAM 기반 나노복합체는 다단계 합성 공정이 필요합니다. 또한, 나노복합체는 특정 암세포에 대한 표적 부분이 없기 때문에 다른 장기나 정상 조직에 심각한 부작용을 일으킬 수 있습니다. 이전 보고서에서 우리는 PNIPAM의 열 및 pH에 민감한 특성을 사용하여 양방향 제어 방출 시스템을 개발했습니다[15]. PNIPAM 나노겔은 LCST의 효율적인 제어를 위해 아크릴산(AAc) 함량과 공중합되었습니다. 암 표적화 및 치료 효능을 더욱 향상시키기 위해 화학 및 광열 효과를 이용한 암 표적화 병용 요법을 개발했습니다(Scheme 1). NIR 레이저 조사에 의해 온도가 상승함에 따라 열 반응성 PNIPAM 나노복합체에서 약물이 방출되고 광열 효과가 후속적으로 활성화되었습니다. 공액 엽산(FA)으로 인해 PNIPAM 기반 나노복합체는 MDA-MB-231 유방암 세포에 대해 상당히 향상된 치료 효능을 나타냈습니다.
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a의 개략도 NIR 빛과 보온병으로 작동되는 Dox@PNIPAM-ppy-FA 나노복합체 및 b 합성 유방암 세포에서 강화된 화학-광열 병용 요법에 대한 적용
NIPAM, 엔,엔 '-메틸렌비스아크릴아미드(MBA), 과황산칼륨(KPS, 99%), N-(3-디메틸아미노프로필)-N '-에틸카르보디이미드 염산염(EDC) 및 N -Hydroxysuccinimide(NHS)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입했습니다. 폴리비닐피롤리돈(PVP) 및 피롤(98%)은 Alfa Aesar(Ward Hill, MA, USA)에서 입수했습니다. AAc는 대정화학에서 구입했습니다. (주) (한국). FA-PEG-아민(FA-PEG-NH2 , MW:5kDa)는 Nanocs, Inc.(New York, NY, USA)에서 제공했습니다. 독소루비신 염산염(Dox)은 Tokyo Chemical Industry에서 입수했습니다. Co. Ltd(도쿄, 일본). 모든 화학 물질과 재료는 추가 정제 없이 상업적으로 사용되었습니다.
AAc 나노입자와 공중합된 열반응성 PNIPAM은 이전 보고서에 따라 합성되었다[15]. 1.13g의 NIPAM 단량체, 0.077g의 MBA 및 0.136g의 AAc를 100mL 탈이온수에 용해시키고 250mL 3구 둥근 바닥 플라스크에 첨가했습니다. 30분 후, 반응 온도를 80°C로 증가시키고 1시간 동안 격렬하게 교반했습니다. 중합을 유도하기 위해 혼합물에 KPS(1.5mg)를 첨가하고 4시간 동안 교반하였다. 혼합물을 7일 동안 탈이온수에서 분자량 컷오프(MWCO) 12-14kDa 투석막에 대해 투석하여 미반응 단량체, 개시제, 분배성 이온을 제거하고 48시간 동안 동결 건조하여 PNIPAM-AAc 나노입자를 얻었다. 광열 효과를 기능화하기 위해 ppy를 PNIPAM-AAc 나노 입자로 장식했습니다[25]. PVP(50 및 100mg) 및 피롤 단량체(50 및 100μL)를 10mg/mL의 PNIPAM-AAc 용액에 빠르게 첨가하고 실온에서 12시간 동안 교반했습니다. 그런 다음, KPS(3.4mg)를 PNIPAM-AAc 용액에 삽입하고 14시간 동안 추가로 교반했습니다. ppy로 장식된 PNIPAM-AAc를 증류수로 3회 원심분리했습니다. PNIPAM-ppy-5 및 PNIPAM-ppy-10은 48시간 동안 동결 건조하여 얻었습니다.
암 표적 PNIPAM-ppy 나노복합체(PNIPAM-ppy-FA)를 얻기 위해 10mg의 PNIPAM-ppy를 인산완충식염수(PBS, 10mL, pH 5.5)에 용해하고 5분 동안 초음파 처리했습니다. EDC(15mg, 0.078mmol) 및 NHS(15mg, 0.13mmol)를 PNIPAM-ppy 용액에 첨가했습니다. 1시간 후, FA-PEG-NH2 (5 mg)을 첨가하고 추가로 밤새 교반하였다. 미반응 FA-PEG-NH2 , PNIPAM-ppy 용액의 EDC 및 NHS는 투석막(MWCO 6-8kDa)으로 제거하고 PNIPAM-ppy-FA 나노복합체를 48시간 동안 동결건조했습니다.
10mg의 PNIPAM-ppy-FA를 탈이온수에 용해하고 5분 동안 초음파 처리했습니다. 0.5mg/mL Dox를 PNIPAM-ppy-FA 용액에 적가하면서 실온에서 격렬하게 교반했습니다. 로딩되지 않은 Dox를 원심분리(14,000rpm, 10분)로 제거하고 탈이온수로 정제했습니다. Dox-loaded PNIPAM-ppy-FA(Dox@PNIPAM-ppy-FA)는 48시간 동안 동결 건조하여 얻었습니다.
투과 전자 현미경(TEM, JEOL-2100F, JEOL, Japan)을 사용하여 PNIPAM-ppy-FA 나노복합체의 크기, 형태 및 분포를 특성화했습니다. TEM 측정을 위해 탄소로 코팅된 200메시 구리 그리드에 탈이온수(농도:1g/L)에 담긴 샘플 용액을 한 방울 떨어뜨려 샘플을 준비했습니다. Zetasizer Nano Z(Malvern Instruments, UK)를 사용하여 탈이온수에 용해하고 5분 동안 초음파 처리한 PNIPAM-ppy-FA 나노복합체의 크기 분포 및 표면 전하를 측정했습니다. PNIPAM-ppy-FA 나노복합체의 표면 개질 및 화학적 결합은 푸리에 변환 적외선 분광법(FT-IR)에 의해 확인되었습니다. FT-IR 스펙트럼은 Nicolet iS50 기기(Thermo Fisher Scientific, Inc., USA)를 사용하여 400–4000cm −1 범위에서 KBr 펠릿에 기록되었습니다. 4cm −1 해상도에서 . PNIPAM-ppy-FA 나노복합체의 광학적 특성과 Dox 로딩 용량은 UV-Vis 분광법(UV 1800, Shimazu, Japan)으로 관찰되었습니다.
Dox가 로딩된 PNIPAM-ppy-FA 나노복합체(Dox@PNIPAM-ppy-FA)의 광열 특성은 온도 변화를 실시간으로 감지하여 평가되었습니다. Dox@PNIPAM-ppy-FA를 0.05, 0.1, 0.2mg/mL 농도의 수용액에 녹이고 808nm NIR 레이저(MDL-N-808, CNI Optoelectronics Tech. Co. Ltd., 중국) 2W/cm 2 전력 밀도에서 . NIR 레이저 출력 밀도의 영향은 출력 밀도 1, 2, 3 W/cm 2 로 20분 동안 NIR 레이저를 조사하여 연구했습니다. , 각각. 또한 NIR 레이저에 대한 광열 안정성을 조사하기 위해 Dox@PNIPAM-ppy-FA 용액(0.1mg/mL)을 15분 동안 노출시키고 자연 냉각 과정을 5회 수행했습니다. NIR 레이저 조사 동안 Dox@PNIPAM-ppy-FA 용액의 온도는 디지털 온도계(DTM-318, Tecpel Co., Taiwan)에 연결된 열전대로 60초마다 15분 동안 측정되었습니다.
열 반응에 의한 Dox의 방출 프로필을 연구하기 위해 Dox@PNIPAM-ppy-FA 용액(1mg/mL)을 5mL 바이알에 준비한 다음 25, 37 및 50°C에서 교반했습니다. 정의된 방출 시간(0~72시간)에 각 샘플의 상층액을 원심분리에 의해 수집하고 동일한 부피의 새 배지로 교체했습니다. PNIPAM-ppy-FA 나노복합체에서 방출된 Dox의 양은 480nm에서 UV-Vis 분광법을 측정하여 추정했습니다. 또한 NIR 레이저 자극 반응 Dox@PNIPAM-ppy-FA 용액(1 mg/mL)을 통한 Dox 방출 거동을 37°C에서 격렬하게 교반하고 미리 결정된 시점(1, 2, 3)에서 10분 동안 조사했습니다. , 4, 5시간). 대조군으로서 NIR 레이저 조사가 없는 Dox@PNIPAM-ppy-FA 용액을 사용하였다. 출시된 Dox는 위와 같은 방법으로 결정되었습니다.
PNIPAM-ppy-FA 및 Dox@PNIPAM-ppy-FA를 포함하는 PNIPAM-ppy-FA 나노복합체의 세포독성은 MTT 분석을 사용하여 확인되었습니다. A549 및 MDA-MB-231 세포를 96웰 플레이트에 1 × 10 4 의 밀도로 시딩했습니다. 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 RPMI 1640 배지 200µL에서 웰당 세포를 5% CO2가 포함된 습한 분위기에서 37°C에서 배양했습니다. . 1일 후 다양한 농도(20~100µL)의 PNIPAM-ppy-FA 나노복합체 200µL를 각 세포에 처리하고 플레이트를 24시간 동안 배양했습니다. 세포를 DPBS로 세척한 다음 배지를 MTT 제제(0.5mg/mL)가 포함된 새로운 배지로 교체했습니다. 4시간 동안 다시 배양한 후 배지를 조심스럽게 제거하고 200μL의 DMSO를 각 웰에 첨가하여 내재화된 보라색 포르마잔 결정을 용해했습니다. iMark™ 마이크로플레이트 리더(Bio-rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 595nm에서 흡수를 측정했습니다.
PNIPAM-ppy-FA 나노복합체의 특정 암세포에 대한 표적화 능력을 평가하기 위해 A549 및 MDA-MB-231 세포를 2 × 10의 밀도로 8-well plate(ibidi, Munich, Germany)에 접종하였다. 4 cells/mL로 24시간 동안 배양되었습니다. 그런 다음 세포를 PNIPAM-ppy-FA 나노복합체(60μg/mL)와 함께 6시간 동안 인큐베이션했습니다. 이어서, 세포를 DPBS로 2회 세척하여 남아있는 나노복합체를 제거하고 4% 파라포름알데히드로 15분 동안 고정하였다. 실온에서 15분 동안 0.1% Triton-X를 처리한 후, 세포를 최종적으로 Alexa Fluor 488 phalloidin(1:200, Invitrogen, USA)으로 4°C 및 4,6-diamidino-2-에서 1일 동안 염색했습니다. 각각 10분 동안 페닐린돌(DAPI, Thermo Fisher Scientific, USA). 세포 흡수 이미지는 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM, LSM 710, Carl Zeiss, Germany)을 사용하여 관찰되었습니다.
유방암 세포에 대한 NIR 및 열 반응성 PNIPA-ppy-FA를 사용하여 향상된 치료 효능을 MTT 분석으로 조사했습니다. MDA-MB-231(1 × 10 4 세포/mL)를 96웰 플레이트에 접종하고 24시간 동안 배양했습니다. 그런 다음 세포를 DPBS로 세척하고 다양한 농도(20, 40, 60, 80 및 100μg/mL)의 Dox@PNIPAM-ppy-FA 및 Dox@PNIPAM-ppy-FA 나노복합체를 농도 의존적 방식으로 각 웰에 첨가했습니다. . 밤새 배양한 후, 배지를 제거하고 새로운 배지를 첨가하였다. NIR 레이저 조사 그룹의 경우 세포를 5W/cm 2 로 처리했습니다. 5분 동안 그런 다음, MDA-MB-231을 DPBS로 세척하고 MTT 용액을 포함하는 새로운 배지를 첨가하였다. 4시간 후 배지를 조심스럽게 제거하고 200μL의 DMSO를 각 웰에 추가했습니다. 마지막으로 iMark™ 마이크로플레이트 판독기로 595nm에서의 흡광도를 측정하여 세포 생존력을 측정했습니다. 암 치료 효과를 관찰하기 위한 또 다른 방법으로, live and dead assay를 수행하였다. PNIPAM-ppy-FA 및 Dox@PNIPAM-ppy-FA(60μg/mL)를 MDA-MB-231로 처리했습니다. 24시간 후 MDA-MB-231은 NIR 레이저 조사(5 W/cm 2 , 5분) calcein AM 및 ethidium homodimer-1로 염색했습니다. 30분 후, 세포를 DPBS로 여러 번 세척했습니다. 살아있는/죽은 이미지는 역형광현미경(Olympus Ix73, Japan)을 사용하여 얻었다.
열 반응성 PNIPAM 기반 나노복합체의 생성을 위해 PNIPAM-AAc 나노입자를 라디칼 중합법으로 제작하였다[15]. NIR 레이저 조사를 통해 LCST를 제어하기 위해 준비된 PNIAPM-AAc에서 ppy를 중합 반응으로 덮었습니다. 암 표적 PNIPAM-ppy-FA는 FA-PEG-NH2를 화학적으로 접합하여 합성되었습니다. PNIPAM-AAc의 카르복실기에 그림 1a의 TEM 이미지에 따르면 PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy 및 PNIPAM-ppy-FA의 형태, 크기 및 분산이 관찰되었습니다. 준비된 PNIPAM-AAc는 평균 직경이 274.32 ± 11.62nm인 균일한 형태를 나타냈습니다. ppy 장식 후, PNIPAM-ppy 및 PNIPAM-ppy-FA는 275.99 ± 11.41 및 285.77 ± 17.92nm로 유사한 크기를 보였다. Dox가 로딩된 PNIPAM-ppy-FA의 크기는 285.77 ± 17.92에서 290.73 ± 12.28 nm로 약간 증가하여 PNIPAM-ppy-FA 나노복합체에 항암제가 로딩되었음을 나타냅니다[26]. 흥미롭게도, PNIPAM-AAc와 비교할 때, PNIPAM-ppy-FA 나노복합체 내 ppy의 존재는 작은 검은 반점으로 명확하게 나타났습니다. 또한, PEG 사슬로 인해 PNIPAM-ppy-FA 나노복합체는 응집 없이 수용액에 잘 분산되었다[27]. PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA 및 Dox@PNIPAM-ppy-FA의 평균 유체역학적 직경은 DLS 분석에 의해 측정되었습니다(추가 파일 1:그림 S1). PNIPAM-AAc, PNIPAM의 직경 -ppy, PNIPAM-ppy-FA, Dox@PNIPAM-ppy-FA는 각각 432, 450.7, 468.6, 486.7nm였습니다. 서로 다른 분석 방법으로 인해 각 나노복합체의 직경은 TEM보다 더 컸지만 PNIPAM-ppy-FA 나노복합체의 입자 크기와 분포는 유사한 경향을 나타냈습니다.
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아 PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA 및 Dox@PNIPAM-ppy-FA 나노복합체의 TEM 이미지. ㄴ DLS에 의한 Dox@PNIPAM-ppy-FA의 LCST 분석. ㄷ 다양한 온도 조건(25°C, 37.5°C 및 50°C)에 따른 PNIPAM-AAc 및 Dox@PNIPAM-ppy-FA의 평균 직경
중합된 ppy가 PNIPAM-AAc에 미치는 영향을 조사하기 위해 PNIPAM-AAc 및 Dox@PNIPAM-ppy-FA의 LCST 값을 서로 다른 온도에서 측정했습니다(그림 1b). 이전 작업[15]과 비교하여 Dox@PNIPAM-ppy-FA의 LCST는 PNIPAM-AAc(42°C)보다 약간 감소했습니다. 이러한 차이는 중합된 ppy 및 접합된 암 표적 리간드로 인해 PNIPAM-AAc에서 감소된 카르복실기 때문일 수 있습니다[28]. 이어서 온도에 따른 입자 크기의 변화를 그림 1c에서 모니터링했습니다. 이를 위해 PNIPAM-AAc 및 Dox@PNIPAM-ppy-FA의 직경을 25~50°C의 온도 범위에서 측정했습니다. 온도가 증가함에 따라 PNIPAM-AAc는 436nm에서 177nm로 감소했습니다. 또한 Dox@PNIPAM-ppy-FA의 크기는 630nm에서 420nm로 크게 감소했으며, 이는 PNIPAM 나노복합체에 ppy로 장식된 것이 제어되고 열 반응하는 DDS의 적용에 큰 영향을 미치지 않았음을 나타냅니다[27].
PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA 및 Dox@PNIPAM-ppy-FA의 제타 전위 값은 수정 전후의 나노복합체의 표면 변화를 나타냅니다(그림 2a). PNIPAM-AAc의 제타 전위는 AAc의 카르복실 그룹으로 인해 - 37.1 ± 1.61mV였습니다[29]. PNIPAM-ppy 및 PNIPAM-ppy-FA의 값은 - 29.6 ± 0.96 및 - 15.6 ± 0.26 mV로 증가했으며, 이는 양전하를 띤 폴리피롤 및 FA-PEG-NH2 PNIPAM-ppy-FA 나노복합체에 성공적으로 도입되었습니다[27]. 음전하를 띤 Dox로 인해 Dox@PNIPAM-ppy-FA의 제타 전위는 더 많은 음전하(− 28.6 ± 0.23mV)로 변경되었습니다. 그림 2b와 같이 PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy 및 PNIPAM-ppy-FA의 성공적인 합성은 FT-IR 분광법으로 확인되었습니다. PNIPAM-AAc의 스펙트럼은 C-N과 CH2의 신축진동 피크를 보여주었습니다. 1100~1200cm −1 C=O, NH 및 COOH의 피크는 1545, 1645 및 1750cm -1 에서 관찰되었습니다. , PNIPAM-AAc [15]에 속해 있습니다. PNIPAM-ppy 및 PNIPAM-ppy-FA의 폴리피롤은 935 및 1050cm −1 에서 추가 피크를 보여주었습니다. 관찰되었다[30]. PNIPAM-ppy-FA의 스펙트럼에서 새로운 진동 피크는 1107 및 2880cm −1 에서 나타났습니다. , 이는 PEG 사슬의 CO-C에 기인합니다. 이 결과는 FA-PEG-NH2의 성공적인 화학적 접합을 나타냅니다. [31]. 그러나 FA의 표적 리간드는 그 구조가 PEG와 유사하기 때문에 FT-IR에 의해 검출되지 않았다. PNIPAM 나노복합체에서 FA의 존재를 확인하기 위해 PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy 및 PNIPAM-ppy-FA를 UV-Vis 분광법으로 수행했습니다(그림 2c). PNIPAM-AAc 및 PNIPAM-ppy(FA 없음)의 스펙트럼은 흡수 피크를 나타내지 않았지만 PNIPAM-ppy-FA는 FA에서 두드러진 280nm에서 추가 피크를 나타냈습니다[32]. 이 결과는 PNIPAM 기반 나노복합체에 FA 분자가 접목되었음을 뒷받침합니다.
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아 PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA 및 Dox@PNIPAM-ppy-FA의 제타 전위 분석. ㄴ PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy 및 PNIPAM-ppy-FA의 FT-IR 스펙트럼. ㄷ PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA 및 Dox@PNIPAM-ppy-FA의 UV-Vis 스펙트럼
PNIPAM 기반 나노복합체를 광열치료에 사용하기 위해 PNIPAM-ppy-FA 나노복합체의 광학적 특성을 UV-Vis 분광법으로 조사했습니다. 그림 2c와 같이 PNIPAM-AAc는 NIR 영역에서 흡광도를 나타내지 않았습니다(λ =700–1000 nm). 그러나 PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA 및 Dox@PNIPAM-ppy-FA의 스펙트럼은 중합된 ppy 나노입자로 인해 동일한 범위에서 강한 흡광도를 분명히 보여주었다. 이러한 흡광도 결과는 PNIPAM-ppy-FA 나노복합체가 NIR 빛을 열로 전환할 수 있음을 보여주었습니다[26]. 다음으로 NIR 레이저 조사에 의해 PNIPAM-ppy-FA 나노복합체의 광열 특성을 평가했습니다(그림 3). 광열 효과를 최적화하기 위해 PNIPAM-FA(피롤 없음), PNIPAM-ppy-5-FA(ppy 50μL) 및 PNIPAM-ppy-10-FA(ppy 100μL)를 동일한 농도(0.1mg/mL)로 준비했습니다. ) 그런 다음 2W/cm 2 밀도에서 808nm NIR 레이저 조사에 노출되었습니다. 20분 동안(그림 3a) PNIPAM-ppy-10-FA의 온도는 PNIPAM-ppy-5-FA보다 2배 높은 14.5°C로 증가했습니다. 대조군으로 ppy가 없는 PNIPAM-FA를 조사했지만 온도는 무시할 정도로 상승했습니다(2.4°C). 따라서 추가 광열 실험을 조사하기 위해 PNIPAM-ppy-10-FA를 선택했습니다. 농도별 온도 변화를 관찰하기 위해 NIR 레이저를 PNIPAM-ppy-FA에 다양한 농도(0.05, 0.1, 0.2 mg/mL)로 조사했습니다. 그림 3b에서는 농도에 따라 온도가 각각 10, 14.5, 18°C로 증가했습니다. 또한 PNIPAM-ppy-FA 용액(0.1 mg/mL)에 다양한 레이저 출력 밀도(1–3 W/cm 2 ) 그림 3c. 예상대로 나노복합체의 온도 상승은 레이저 출력에 크게 의존했습니다. 그 후, 우리는 그림 3d에서 PNIPAM-ppy-FA 나노복합체의 광열 안정성을 관찰했습니다. 근적외선 레이저 조사를 5회 이상 반복했지만 온도는 꾸준히 33°C까지 상승하여 PNIPAM-ppy-FA 나노복합체가 광열 요법으로 적합한 나노캐리어임을 보여주었습니다.
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PNIPAM-ppy-FA 나노복합체의 광열 성능. 아 808nm NIR 레이저 조사(2W/cm 2 )에서 Dox@PNIPAM-ppy-5-FA 및 Dox@PNIPAM-ppy-10-FA의 온도 분석 ). ㄴ 808nm NIR 조사(2W/cm 2 )에서 Dox@PNIPAM-ppy-FA의 다양한 농도에 대한 온도 분석 ). ㄷ 다양한 전력 밀도(1, 2, 3 W/cm 2 )에서 Dox@PNIPAM-ppy-FA의 광열 효과 ). (D) NIR 레이저 조사(2 W/cm 2 )를 사용한 5회 켜기/끄기 주기에 대한 Dox@PNIPAM-ppy-FA의 온도 곡선 )
NIR 및 열 반응을 통한 약물 방출 프로파일을 평가하기 위해 Dox@PNIPAM-ppy-FA 나노복합체의 캡슐화 및 방출 특성을 분석했습니다. 처음에 우리는 약물이 장착된 PNIPAM-ppy-FA의 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 측정했으며 480nm 근처에서 강한 흡수 피크가 관찰되었습니다(그림 2c). 이 결과는 Dox가 PNIPAM-ppy-FA 나노복합체에 성공적으로 로드되었음을 나타냅니다. PNIPAM-ppy-FA 나노복합체의 Dox 로딩 효율은 Dox 보정 곡선을 사용하여 15%로 계산되었습니다(데이터는 표시되지 않음). 그림 4a에서 PNIPAM-ppy-FA의 Dox 방출 프로필은 다양한 온도에서 연구되었습니다. 우리는 25°C, 37°C, 50°C에서 72시간 동안 Dox 방출 행동을 관찰했으며 PNIPAM-ppy-FA에서 Dox의 누적 방출은 각각 15%, 42%, 67%였습니다. PNIPAM-ppy-FA의 LCST가 42°C로 약간 감소했기 때문에 체온에서 누적 방출은 실온보다 상대적으로 높은 것으로 나타났습니다. 많은 양의 Dox가 방출되었지만, Dox@PNIPAM-ppy-FA 나노복합체는 이전에 설명한 것처럼 엽산 수용체 양성 세포에서만 내재화될 수 있기 때문에 방출된 Dox는 치료 효율에 영향을 미치지 않았습니다[26, 32]. LCST(50°C) 이상에서 PNIAPM-ppy-FA 나노복합체의 Dox 양이 실온보다 4배 더 높게 방출되었으며, 이는 PNIPAM-ppy-FA 나노복합체가 열 반응을 통해 제어된 약물 방출 시스템에 사용될 수 있음을 시사합니다. 또한, 우리는 그림 4b에서 PNIPAM-ppy-FA 나노복합체의 NIR 광 유발 방출 거동을 조사했습니다. Dox@PNIAPM-ppy-FA 용액(1mg/mL)을 NIR 레이저(3W/cm 2 )에 노출시켰습니다. ) 10분 동안 조사하고 이 작업을 1시간마다 반복했습니다. 6시간 동안 NIR 레이저 조사를 통한 Dox의 총량은 35%에 도달한 반면 NIR 레이저 조사 없이 Dox 방출 프로파일은 약 5% 및 15%(25°C 및 37°C)를 나타냈습니다. 이 결과는 NIR 레이저 조사가 나노복합체의 LCST보다 더 높은 온도를 초래하고 PNIPAM-ppy-FA 나노복합체에서 Dox 방출을 유도한다는 것을 보여주었습니다.
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아 열 반응 및 b를 통한 Dox@PNIPAM-ppy-FA의 누적 Dox 방출 프로필 808nm NIR 레이저 조사
문헌에 따르면, PNIPAM-ppy-FA 나노복합체의 세포독성이 폐암 및 유방암 세포에 대해 조사되었습니다(추가 파일 1:그림 S2)[33, 34]. 샘플 농도에 관계없이 24시간 동안 PNIPAM-ppy-FA와 함께 배양한 후 두 세포 생존율이 모두 관찰되었습니다(> 85%). 따라서 우리의 PNIPAM-ppy-FA 나노복합체는 약물 전달 응용을 위한 나노운반체로서 세포독성을 나타내지 않았습니다[35, 36]. PNIPAM-ppy-FA가 암세포에 선택적으로 전달할 수 있는지 여부를 조사하기 위해 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 세포 내 PNIPAM-ppy-FA 나노복합체의 형광 신호를 조사했습니다(추가 파일 1:그림 S3). PNIPAM-ppy-FA 및 Dox@PNIPAM-ppy-FA의 세포 흡수 행동은 엽산 수용체 음성(A549) 및 양성(MDA-MB-231) 세포주에서 평가되었습니다[37]. MDA-MB-231 유방암 세포를 Dox@PNIPAM-ppy-FA와 배양한 후 강한 적색 형광이 관찰되었으며 Dox@PNIAPM-ppy-FA가 MDA-MB-231 세포의 리소좀으로 내재화되었음을 보여줍니다. 계속해서 PNIPAM-ppy-FA와 Dox@PNIPAM-ppy-FA를 A549 세포로 처리했을 때 Dox 신호는 관찰되지 않았습니다. 이러한 공초점 이미지는 PNIAPM-ppy-FA 나노복합체가 이전에 설명한 바와 같이 수용체 매개 세포내이입 경로를 통해 엽산 수용체 과발현된 암세포로 선택적으로 내재화될 수 있음을 보여줍니다[38, 39].
PNIPAM-ppy-FA 나노복합체의 시험관 내 조합 치료 효능을 확인하기 위해 NIR 레이저 조사 유무에 관계없이 MDA-MB-231 세포에서 PNIPAM-ppy-FA 나노복합체를 평가하고 세포 생존율을 그림 5a에서 MTT 분석으로 평가했습니다. . 광열 요법을 위해 PNIPAM-ppy-FA가 포함된 MDA-MB-231 유방암 세포를 12시간 동안 배양한 후 NIR 레이저(5 W/cm 2 , 5 분). MDA-MB-231 유방암 세포의 세포 생존율은 PNIPAM-ppy-FA 농도에 따라 70-90%로 감소했습니다. 유일한 화학요법 효과를 확인하기 위해 Dox가 로딩된 PNIPAM-ppy-FA 나노복합체를 처리했습니다. 우리는 그림 4의 방출 프로필에 해당하는 나노복합체로부터의 Dox 방출로 인해 생존율이 50%로 감소하는 것을 관찰했습니다. 흥미롭게도 Dox@PNIPAM-ppy-FA 나노복합체를 사용하여 MDA-MB-231 세포에서 NIR 레이저 조사 후, 세포 생존율은 대조군(NIR 레이저 조사가 있는 PNIPAM-ppy-FA, NIR 레이저 조사가 없는 Dox@PNIPAM-ppy-FA)보다 높은 최대 24%까지 급격히 감소했습니다. 이 결과는 근적외선 레이저 조사 매개 화학-광열 병용 요법의 최적의 시너지 효과를 나타냈다. 또한 암세포의 치료효율을 직접 관찰하기 위해 Fig. 5b와 같이 live/dead assay를 수행하였다. 대조군으로서 우리는 NIR 레이저 조사(5W/cm 2 , 5분) 대부분의 세포가 녹색 형광을 나타냈습니다(살아 있는 세포). 그것은 NIR 레이저 조사가 세포 생존력에 명백하게 영향을 미치지 않는다는 것을 입증했습니다. 또한, NIR 레이저 조사 하에서 PNIPAM-ppy-FA를 갖는 MDA-MB-231 세포는 약간의 적색 형광(죽은 세포)을 보여 PNIPAM-ppy-FA 나노복합체로 인한 광열 치료 효과를 나타냅니다. Dox@PNIPAM-ppy-FA를 사용하는 MDA-MB-231 세포에서 NIR 레이저 조사가 없음에도 불구하고 몇 가지 산발적인 적색 형광이 관찰되어 화학 요법을 나타냅니다. 또한 MDA-MB-231 세포에 나노복합체와 NIR 레이저를 조사했을 때 대부분의 암세포가 약간의 적색 형광을 보였다[39, 40]. 이러한 결과는 NIR 레이저 조사 및 열 반응성 Dox@PNIPAM-ppy-FA 나노복합체를 통한 화학 광열 요법의 시너지 치료 효과를 뒷받침합니다.
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아 PNIPAM-ppy-FA 및 Dox@PNIPAM-ppy-FA로 처리된 MDA-MB-231 유방암 세포의 생존력에 대한 정량적 분석은 농도가 다르고 808nm NIR 레이저 조사가 있거나 없는 경우입니다. ㄴ NIR 레이저 조사 유무에 관계없이 PNIPAM-ppy-FA 및 Dox@PNIPAM-ppy-FA 나노복합체(60μg/mL) 처리 후 MDA-MB-231 세포에서 살아있는/죽은 분석의 형광 이미지. 살아있는 세포와 죽은 세포를 Calcein AM(녹색)과 Ethidium homodimer-1(빨간색)로 염색합니다. 눈금 막대는 200μm
입니다.우리는 화학-광열 조합 요법을 위한 암 표적 NIR 및 열 반응성 PNIPAM-ppy-FA 나노복합체를 성공적으로 구축했습니다. 808 nm NIR 레이저 조사를 통해 제어 방출 및 광열 효과를 유도하기 위해 ppy 나노 입자를 중합 방법에 의해 PNIPAM-AAc에 균일하게 장식했습니다. Dox-loaded PNIPAM-ppy-FA는 상당한 광열 효과와 광안정성을 보였다. 또한 Dox@PNIPAM-ppy-FA는 다양한 조건에서 열에 민감한 전이의 유리한 특성을 보여주었고 PNIPAM-ppy-FA 나노복합체로부터의 약물 방출은 NIR 광 및 열 반응에 의해 제어될 수 있었습니다. 시험관 내 연구는 PNIPAM-ppy-FA 나노복합체가 유방암 세포에 대해 우수한 생체 적합성과 향상된 치료 효능을 나타냄을 확인했습니다. 나노복합체를 통한 이러한 향상된 항암 효능은 (1) 엽산 수용체 매개 세포내이입에서 나노복합체의 특정 세포 흡수, (2) NIR 및 열 반응을 통한 PNIPAM-ppy-FA로부터 축적된 Dox 방출, (3) ) 화학-광열 조합에 의한 시너지 치료 효과. 따라서 우리의 PNIPAM-ppy-FA 나노복합체는 부작용이 감소된 다양한 유형의 암에 대한 시너지 치료 접근법을 위한 다기능 나노운반체로 잠재적으로 사용될 수 있습니다.
현재 작업의 데이터 및 분석은 합리적인 요청에 따라 교신저자로부터 제공됩니다.
광열 요법
근적외선
엽산
FA-PEG 아민
낮은 임계 용액 온도
폴리(N -이소프로필아크릴아미드)
폴리피롤
투과현미경
자외선-가시광선 분광법
나노물질
초록 비소세포폐암(NSCLC)은 전 세계적으로 두 번째로 많이 진단되는 악성 종양이 되었습니다. 암 치료 전략을 개발하기 위해 나노물질을 찾는 데 대한 장기적인 관심으로 여기에서 새로운 CoFe2를 구성했습니다. O4 - 명백한 독성 없이 NSCLC를 효율적으로 억제하는 탁월한 시너지적 광열/광역학적 특성을 가진 양자점(QD). 우리는 CoFe2의 조합이 O4 -QDs + NIR 처리는 NSCLC 세포의 세포자멸사를 유도합니다. 또한 CoFe2 O4 -QDs + NIR 처리는 또한 PI3K/AKT 경로 조절을 통해 세포 사멸을 유
초록 빠르고 통제할 수 없는 세포 성장이 합병증과 조직 기능 장애를 일으키는 질병인 암의 유병률 증가는 과학자와 의사의 심각하고 긴장된 우려 중 하나입니다. 오늘날 암 진단과 특히 그 효과적인 치료는 지난 세기 건강과 의학의 가장 큰 과제 중 하나로 여겨져 왔습니다. 약물 발견 및 전달의 상당한 발전에도 불구하고 일반적으로 건강한 조직 및 기관에 손상을 일으키는 많은 부작용과 부적절한 특이성 및 민감도가 약물 사용에 큰 장벽이 되어 왔습니다. 이들 치료제의 투여 기간과 양에 대한 제한도 도전적이다. 반면에, 화학 요법 및 방사선
