이 연구의 목적은 높은 자기 감도를 가진 자기 공명 영상(MRI)용 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2) 표적 가능한 조영제의 개발이었습니다. 항HER2 압타머 변형 자기 나노감작제(AptHER2 -MNS)는 5'-티올-변형된 압타머 및 말레이미딜화된 자기 나노결정(MNC)과의 접합에 의해 제조되었습니다. AptHER2의 물리화학적 특성 및 표적화 능력 -MNS 확인 및 결합 친화성(K d ) AptHER2의 HER2 단백질에 -MNS는 0.57 ± 0.26nM이었다. HER2+ 암세포(NIH3T6.7)-이종이식 마우스 모델(n =3) 3T 임상 MRI 기기에서. 대조군 실험은 표지되지 않은 MNC를 사용하여 수행되었습니다. 결과는 AptHER2 주입 후 T2 강조 MR 이미지에서 종양 영역에서 최대 150%의 대비 향상이 달성되었음을 나타냅니다. -NIH3T6.7 세포를 받은 쥐의 MNS 작용제.
<섹션 데이터-제목="배경">표피 성장 인자 수용체(EGFR) 패밀리에 속하는 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2)는 인간 악성 종양에서 핵심적인 역할을 하며 인간 유방암의 약 30%[1] 및 기타 많은 암 유형에서 과발현됩니다. , 위, 방광, 난소 및 폐 암종을 포함하여 [1,2,3,4]. HER2 과발현 유방암 환자는 비 과발현 HER2 암 환자보다 생존율이 현저히 낮은 경향이 있습니다[5]. 또한 HER2의 과발현은 유방암 전이를 증가시킨다[6,7,8]. 이러한 이유로 HER2는 암 진단에 중요한 바이오마커 역할을 합니다. 임상에서 HER2는 에스트로겐 수용체(ER), 프로게스테론 수용체(PR)와 함께 유방암을 진단하는 대표적인 생물학적 표지자로 사용된다. 따라서 유방암 환자는 HER2, ER 및 PR 발현 수준의 조직학적 검증에 따라 확실한 진단을 받습니다. 그러나 조직학적 검증은 침습적이며 제한된 수의 병변에서만 수행됩니다. 이 때문에 컴퓨터 단층촬영[9, 10], 양전자방출단층촬영[11,12,13], 단광자방출 전산화단층촬영을 기반으로 한 조직학적 검증 전에 방사선학적 검사를 통해 진단 마커를 비침습적으로 시각화하기 위한 다양한 연구가 진행되고 있다. [14,15,16], 자기공명영상(MRI) [17,18,19,20] 및 다중 모드 영상 도구 [21,22,23].
산화철 나노입자(IONP)는 임상적으로 관련된 바이오마커를 관찰하기 위한 다양한 비침습적 방사선 검사에 사용됩니다[24, 25]. IONP는 가돌리늄 기반 조영제(GBCA) 또는 니켈 또는 코발트 함유 조영제와 같은 다른 중금속 기반 MRI 조영제보다 자기 감도 또는 생체 적합성이 높기 때문에 분자 영상과 호환됩니다. 특히, 상용화된 MRI 조영제 및 GBCA는 Gd 3+ 의 방출로 인한 생체 내 독성과 관련된 문제와 관련되어 있지만 이온, IONP 기반 MRI 조영제는 철로 분해, 흡수 또는 제거될 수 있기 때문에 GBCA보다 생체 내 안전성이 더 높습니다[26, 27].
분자 이미징에 IONP를 적용하려면 표적 부분이 매우 중요하며 화학 물질, 탄수화물, 단백질, 항체 또는 앱타머가 될 수 있습니다[25, 28, 29]. 이들 분자 중 압타머는 단일 가닥 핵산의 안정적인 3차원 구조를 갖고 있어 특정 분자에 대한 높은 결합 친화도와 특이성을 갖는다. Aptamers의 높은 결합 친화도는 그들의 개발 기술과 SELEX(지수 농축에 의한 리간드의 체계적인 진화)에 기인합니다[30]. SELEX는 무작위 서열 올리고뉴클레오티드의 매우 큰 라이브러리를 사용하고 있습니다(~ 10 15 )은 화학적 합성에 의해 제공되고 표적 분자에 높은 결합 친화도를 갖는 앱타머를 찾기 위해 병렬로 스크리닝될 수 있습니다. SELEX의 결과, 다른 생체 분자의 경우 마이크로몰에서 서브나노몰에 이르는 범위에 있는 반면, 일반적으로 피코몰 농도 수준의 높은 결합 친화도로 압타머를 개발할 수 있었다[31, 32]. 최근 개발된 3세대 압타머의 경우 변형된 핵산을 이용하여 DNase 또는 RNase에 대한 저항성이 향상되어 in vitro 및 in vivo 안정성도 가지고 있다[33, 34]. 이러한 이유로 앱타머는 분자 영상 연구에서 선호되는 부분으로 부상하고 있습니다[35].
이 연구의 목적은 HER2를 과발현하는 암세포에 대해 높은 특이성을 갖는 자기 나노결정(MNC)을 기반으로 하는 압타머로 변형된 T2 조영제의 개발이었습니다. 이러한 목적을 달성하기 위해 열분해법과 HER2 특이적 압타머(K d =0.42nM)이 사용되었습니다. 합성된 조영제는 형태, 자화특성, 자기이완성을 분석하여 특성화하였다. 또한 HER2 발현 암 세포주가 이식된 종양 이종이식 동물 모델에서 HER2 단백질에 대한 in vitro 및 in vivo 표적 분석을 각각 수행했습니다.
TWEEN® 80(T80), 4-(디메틸아미노)피리딘, N ,N '-디시클로헥실카르보디이미드, 트리에틸아민, 디클로로메탄 무수물, 철(III) 아세틸아세토네이트, 1,2-헥사데칸디올, 도데칸산, 도데실아민 및 벤질 에테르는 Sigma-Aldrich(미국)에서 구입했으며, 3-말레이미도프로피온산(MPA)은 다음에서 구입했습니다. TCI 아메리카(미국). Roswell Park Memorial Institute(RPMI-1640), Dulbecco의 변형 이글 배지, 태아 소 혈청 및 Gibco® 항생제-항진균 용액은 Life Technologies(USA)에서 구입했습니다. NIH3T6.7은 American Tissue Type Culture(미국)에서 구입했습니다. 디에틸피로카보네이트(DEPC) 처리수는 바이오세상(한국)에서 구입하였다. 티올화 항-HER2 앱타머 [AptHER2 , 서열:5'-6CC 6GG CA6 G66 CGA 6GG AGG CC6 66G A66 ACA GCC CAG A-3' (6:NapdU), 5'-SH modifier, 40-mer]는 Aptamer Science Inc.(Korea)에서 구입하였다.
단분산 자성 산화철 나노입자는 Sun의 열분해 방법을 사용하여 합성되었다[36]. 이러한 자성 나노입자는 철(III) 아세틸아세토네이트 및 올레산 전구체로 인해 MNC라고 불립니다. 간단히 말해서, 철(III) 아세틸아세토네이트(2mmol), 올레산(6mmol), 1-옥타데센(6mmol), 1,2-헥사데칸디올(10mmol) 및 벤질 에테르(20mL)의 혼합물을 3구 둥근 바닥 플라스크에 넣고 기계적으로 저어줍니다. 잔류 산소 분자와 물을 제거하기 위해 혼합물을 30분 동안 100°C로 예열했습니다. 그런 다음 예열된 혼합물을 2시간 동안 200°C로 가열하고 질소 흐름 하에 300°C에서 30분 동안 환류했습니다. 열원을 제거하여 반응물을 상온으로 냉각시킨 후 과량의 에틸알코올로 정제하였다. 분산되지 않은 잔류물로부터 생성물을 분리하기 위해 원심분리를 3회 수행하였다. Fe3 O4 그런 다음 나노 입자 제품을 5mL 헥산에 재분산했습니다. 100mg Fe3로 위에서 설명한 절차를 반복하여 최종 제품을 합성했습니다. O4 및 그 전구체. MNC 형태는 고해상도 투과전자현미경(HR-TEM, JEM-2100, JEOL Ltd., Japan)을 사용하여 평가하였다. 자화 포화도는 상온에서 진동 샘플 자력계(VSM, MODEL-7300, Lakeshore, USA)를 사용하여 평가하였다. 열중량 분석기(SDT-Q600, TA Instrument)를 이용하여 중량을 측정하여 생성물 내 MNC의 양을 분석하고, MNC를 Fe3 함량이 될 때까지 세척하였다. O4 약 80%에 도달했습니다.
말레이미딜 T80(Tm80), 15.3mmol MPA 및 22.9mmol N 제조용 ,N '-디시클로헥실카르보디이미드를 각각 10mL 디클로로메탄에 용해시킨 후 혼합하였다. 그런 다음 혼합물을 7.6mmol T80을 함유하는 20mL 디클로로메탄에 첨가한 다음, 혼합물에 3.2mL 트리에틸아민을 첨가했습니다. 마지막으로 22.9mmol의 4-(디메틸아미노)피리딘을 10mL 디클로로메탄에 녹이고 모든 시약을 70mL 바이알에 혼합했습니다. 최종 혼합물을 자석을 사용하여 48시간 동안 교반했습니다. 혼합물의 색이 살구색에서 적포도주 색으로 변했습니다. 48시간 동안 반응시킨 후, 결정화된 요소를 여과에 의해 제거하였다. 디클로로메탄을 제거하기 위해 회전 증발기(N-1100, EYELA, 일본)에서 증발시켜 반응물을 여과하였다. 생성된 생성물을 탈이온수에 현탁시키고, 비접합 시약을 투석으로 제거하였다(Spectra/Por®, 1 kDa MWCO, Spectrum Laboratory Inc., USA). 최종 제품은 동결 건조로 제조되었습니다. 합성된 Tm80은 UV-vis spectrometer(UV-1800, Shimadzu, Japan), 푸리에변환적외선(FT-IR) 분광기(PerkinElmer, 스펙트럼 2)를 이용하여 MPA 및 T80과 비교하여 확인하였으며, 1 H-핵자기 공명(NMR) 분광계(Bruker Biospin, Advance II, 추가 파일 1 참조:그림 S1).
수분산성 말레이미딜 MNC(mWMNC)는 나노에멀젼 방법을 사용하여 제조되었습니다[37]. 간단히 말해서, 100mg Tm80을 20mL 탈이온수에 완전히 용해시키고 20mg MNC를 함유하는 4mL n-헥산을 Tm80 용해수에 초음파 처리(190W) 및 교반(1200rpm)하면서 빠르게 주입했습니다. 에멀젼 공정은 빙냉욕에서 10분 동안 계속되었습니다. 남아 있는 유기 용매를 실온에서 12시간 동안 증발시키고 생성물을 투석(Spectra/Por®, 3.5kDa MWCO, Spectrum Laboratory Inc., USA)으로 정제하여 3일 동안 과량의 계면활성제를 제거했습니다. 그런 다음 mWMNC를 원심 필터(NMWL 3000, Amicon® Ultra, Merk Milipore Ltd., Germany)를 사용하여 1.25mgFe까지 농축했습니다. /mL DEPC 처리수. T80으로 둘러싸인 MNC(WMNC)도 같은 방법으로 준비했습니다.
mWMNC와 항-HER2 앱타머를 접합하기 전에 티올로 변형된 앱타머의 환원 단계를 수행했습니다. 간단히 말해서, 1 nmol의 압타머를 0.3 mL의 탈이온수에 녹이고, 최종 농도가 각각 50 및 25 mM이 되도록 트리에틸아민 아세테이트 및 1,4-디틸트레톨 용액을 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 진탕하고 에탄올 침전으로 정제 및 탈염하였다. AptHER2를 준비하려면 -MNS, HER2 특정 MRI 프로브, MNC의 분자량은 이론적으로 계산되었으며(추가 파일 1:그림 S2 참조) mWMNC와 앱타머의 혼합 비율은 1:7로 지정되었습니다. 따라서 100μg(Fe) mWMNC(Fe3 O4 , 45pmol)을 PBS(1mL)에 용해하고 5μg(0.35nmol) 앱타머를 첨가했습니다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하고 4°C에서 2시간 동안 인큐베이션했습니다. AptHER2의 유체역학적 직경 분포 - 그런 다음 동적 레이저 산란 분석기(ELS-Z, Otsuka Electronics, Japan)를 사용하여 MNS를 분석했습니다. AptHER2의 능력을 확인하려면 -MNS는 MRI 조영제로서 AptHER2<의 다양한 집중 팬텀을 사용하여 micro-47 표면 코일(Intera, Philips Medical System, 네덜란드)이 있는 1.5T 임상 MRI 기기로 T2 이완성(R2) 분석을 수행했습니다. /서브> - MNS. AptHER2의 R2 -MNS는 실온에서 CPMG(Carr-Purcell-Meiboom-Gill) 시퀀스를 사용하여 측정되었습니다. TR =10 s, 12ms 짝수 에코 공간이 있는 32개의 에코, 획득 횟수 =1, 포인트 분해능 =156 μm × 156 그리고 단면 두께 =0.6mm. R2는 s −1 인 1/T2로 정의되었습니다. 단위.
AptHER2의 HER2 특이성 검증용 -MNS, 니트로셀룰로오스 필터 결합 방법이 사용되었다[38]. 네이키드 AptHER2 및 AptHER2 -MNS는 알칼리성 포스파타제(New England Biolabs, MA, USA)를 사용하여 탈인산화되었습니다. 압타머의 5' 또는 3' 말단은 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 및 [ 32 P]-ATP(Amersham Pharmacia Biotech, NJ, USA)[39]. 결합 분석은 32 선택 완충액(20mM Tris·HCl, pH 7.5 at 4°C, 6mM NaCl, 5mM 2-mercaptoethanol, 1 mM Na3 EDTA, 10% v /v 글리세롤) 37°C에서 30분 32 의 혼합물 P-표지된 앱타머 및 HER2-단백질을 G-50 컬럼(GE Heathcare Life Science, UK)으로 여과하여 유리 방사성 동위원소를 제거하였다. 여과된 혼합물을 재사용 가능한 필름에 현상하고 HER2 단백질 결합 앱타머의 분획을 포스포르이미저(Fuji FLA-5100 Image Analyzer, Tokyo, Japan)를 사용하여 정량화했습니다. 방사성 표지된 앱타머가 니트로셀룰로오스 필터에 결합하는 비특이적 배경 효과를 제거하기 위해 32 를 사용하여 실험을 수행하여 원시 결합 데이터를 수정했습니다. P 라벨이 붙은 압타머만 해당
모든 동물 실험은 국제실험동물보호협회(Laboratory Animal Care International) 평가 및 인증 협회의 승인 하에 수행되었습니다. 생체 내 MRI 스캔은 NIH3T6.7 세포의 이식에 의해 생성된 동계 마우스 종양 모델을 사용하여 수행되었습니다(1.0 × 10 7 세포)를 5주령 암컷 BALB/c 누드 마우스의 허벅지에 주입했습니다. 2주 후, MRI로 종양 크기를 평가했습니다. 종양 크기가 약 500mm에 도달한 경우 3 , 100μg(5mg/kg) AptHER2 -MNS는 꼬리 정맥에 주입되었습니다. 생체 내 MRI 실험은 3.0T 임상 MRI 기기와 8채널 인간 손목 코일을 사용하여 수행되었습니다. 3.0T에서 T2 강조 MRI의 경우 TR/TE =1054/70ms, 획득 횟수 =2, 포인트 해상도 =400 × 319 mm, 슬라이스 두께 =1 mm 1 mm 1 동일한 방법으로 WMNC를 사용하여 제어 실험을 수행했습니다. 모든 T2 신호 강도는 각 마우스 모델(n =3), T2의 역값인 R2(또는 R2*) 값은 신호 강도 분석에 사용되었습니다. 상대적 신호 강도의 시간 경과에 따른 변화는 초기 신호 강도(사전 주입)에 의해 정규화되었습니다. ROI에서 복셀의 R2 신호 강도에 대해서도 히스토그램 분석을 수행했습니다.
AptHER2를 확인하기 위해 종양 조직에서 Fe 이온을 검출하는 데 사용할 수 있는 Prussian Blue 염색을 수행했습니다. - 생체내 MRI 후 각 종양 모델에서 종양 조직의 수확 후 HER2-발현 암의 MNS 표적화. 수확된 종양 조직을 10% 포르말린 용액에 24시간 동안 고정하고 에탄올 농도를 증가시키고 Histo-Clear®(미국 내셔널 다이아그노틱스)에서 정화한 후 탈수 후 파라핀에 포매했습니다. 프러시안 블루 염색은 조직 조각(두께 =5 μm)을 유리 슬라이드에 장착한 후 각각 Histo-Clear® 및 농축 에탄올을 사용하여 탈파라핀화 및 수화하여 수행했습니다. 그 후, 슬라이드를 프러시안 블루 작업 용액(10% 페로시안화칼륨 및 20% 염산 용액 =1:1)에 1시간 동안 두었습니다. 핵은 Nuclear Fast Red 염색(Sigma Aldrich, USA)을 사용하여 염색하였다. 조직 샘플을 30분 동안 세 번 세척한 후 슬라이드에 마운팅 용액을 2~3방울 떨어뜨리고 슬라이드를 커버 슬립으로 덮었습니다. 염색된 조직 절편은 Olympus BX51 및 Olyvia 소프트웨어(Olympus, Japan)를 사용하여 관찰되었습니다.
AptHER2 -MNS는 MRI를 사용하여 HER2-발현 종양의 분자 영상화를 위해 IONP를 기반으로 하는 단일 분자 표적화제로 설계되었습니다. 따라서 AptHER2 -MNS는 표적 분자에 대한 높은 특이성과 큰 자화율을 가져야 합니다. 높은 자기 감도를 얻으려면 먼저 MNC, 단분산 Fe3 O4 나노 입자는 열분해 및 종자 성장 방법을 사용하여 합성되었습니다 [36]. AptHER2의 제조 및 생체 내 적용 실험 절차 -MNS는 그림 1에 설명되어 있습니다. 먼저 MNC의 크기와 모양을 HR-TEM으로 확인했습니다(그림 2a, b). 그림 2c에서 MNC의 평균 크기는 TEM 이미지에서 130개의 MNC를 무작위로 선택하여 측정했으며 매우 좁은 크기 분포(10.49 ± 1.74 nm)와 구형 모양이 관찰되었습니다. MNC의 초상자성 특성은 또한 VSM에 의해 평가되었으며, 이는 98.8emu/gFe의 MNC 포화 자화 값을 산출했습니다. (그림 2d). 현재 정맥주사용이 가능한 T2 조영제는 초상자성 산화철(SPIO) 또는 초소형 초상자성 산화철(USPIO)을 기반으로 한다[40]. SPIO 또는 USPIO도 초상자성 특성을 갖지만 포화 자화 값이 70emu/gFe 미만입니다. [40,41,42,43]. 초상자성 특성은 IONP가 자기장에 있을 때만 자기 특성을 갖도록 하고 IONP가 응집하는 것을 방지하기 때문에 IONP를 정맥 조영제로 사용하는 데 필요합니다. 또한 MNC의 더 높은 포화 자화 값은 SPIO 또는 USPIO 기반 조영제보다 주입량을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다.
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압타머로 변형된 자기 나노감작제(AptHER2)의 제조를 위한 실험 절차를 보여주는 개략도 -MNS) 및 생체 내 이미징 능력 평가
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다국적 기업의 형태 및 자기 특성화 결과. 아 TEM 이미지. ㄴ 확대된 TEM 이미지. ㄷ TEM 이미지에서 측정한 크기 분포(총 100개). d 자화 그래프
생체 내 실험에 MNC를 사용하기 위해 WMNC와 mWMNC를 각각 T80 또는 Tm80을 사용하는 나노에멀젼 방법으로 제조하였다. 제조된 Tm80 및 그 전구체인 MPA 및 T80의 물리화학적 특성은 흡광도, FT-IR, 1 로 확인했습니다. H-NMR 스펙트럼 분석(추가 파일 1:그림 S1 참조). 이전에 발표된 바와 같이[44], Tm80을 사용하는 나노에멀젼 방법으로 제조된 mWMNC는 물에 안정적으로 분산된다. 또한, mWMNC의 말레이미딜 그룹은 중성 pH 티올 그룹을 갖는 분자와 쉽게 접합될 수 있으며 이러한 접합은 어떠한 부산물도 생성하지 않습니다. 또한 NapdU 변형 앱타머는 생체 내 반감기를 증가시키는 데 사용되었으며 반감기는 인간 혈청에서 151시간이었습니다(추가 파일 1:그림 S3 참조). AptHER2 -MNS는 mWMNC와 AptHER2 간의 접합에 의해 준비되었습니다. -SH, AptHER2의 유체역학적 특성 -MNS는 동적 레이저 산란 및 MR 이완 분석을 사용하여 평가되었습니다(그림 3). WMNC 및 AptHER2의 직경 -MNS는 각각 28.8 ± 7.2 및 34.1 ± 8.2nm였습니다(그림 3a). AptHER2이기 때문에 40-mer 올리고뉴클레오티드로 구성되고 길이가 약 5-10nm였으며 AptHER2의 존재 유체역학적 직경의 차이를 유발할 수 있습니다. WMNC와 AptHER2의 이완성 -MNS는 265.7 및 257.2 mM −1 입니다. Fe s −1 , 각각(그림 3b), MRI 조영제로서의 자기 민감도를 확인하기 위해 평가되었습니다. FDA 승인을 받은 SPIO나 USPIO 기반의 T2 조영제의 경우 거의 공침법으로 합성됐다. 이러한 이유로 결정도가 감소하여 이완도가 낮았습니다(190mM −1 미만). Fe s −1 ) 자기장 아래 [40]. 이 연구에서 다국적 기업을 사용하여 AptHER2 -MNS는 SPIO 또는 USPIO 기반 T2 조영제보다 자기 이완성이 35~ 500% 증가했습니다.
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WMNC 및 AptHER2의 특성화 - 생체내 MRI 조영제로 사용하기 위한 MNS. 아 유체역학적 직경(n =5, WMNC 28.8 ± 7.2nm, AptHER2 -MNS 34.1 ± 8.2nm). ㄴ 이완성 분석 그래프(n =3, WMNC R 2 =265.7 mM −1 s −1 , R 2 =0.99 및 AptHER2 -MNS R 2 =257.2 mM −1 s −1 , R 2 =0.99)
AptHER2의 결합 친화도 - HER2 단백질에 대한 MNS는 필터 결합 분석을 사용하여 평가되었으며(그림 4a), 그 결과 K d AptHER2 값 -SH 및 AptHER2 -MNS는 각각 26.88 ± 8.24 및 0.57 ± 0.26 nM으로 측정되었습니다(그림 4b, c). AptHER2 -OH는 K를 갖는 HER2 단백질에 대해 매우 높은 특이성을 가지고 있습니다. d 0.42 ± 0.05nM의 값을 가지며 이 결합 친화도는 Herceptin®의 5nM보다 약 10배 더 높습니다[45]. 그러나 Naked AptHER2의 결합 친화도는 화학 물질, 분자 또는 나노 입자와의 접합에 의해 변경될 수 있습니다. 따라서 AptHER2의 결합 친화도는 HER2 단백질의 경우 mWMNC와의 접합 후에 평가해야 합니다. AptHER2의 결합 친화도 HER2에 대한 -SH는 Naked AptHER2보다는 thiol-group의 존재에 의해 감소되었습니다. 티올기가 단백질 또는 다른 티올로 변형된 앱타머의 다른 티올 잔기와 결합할 수 있기 때문입니다. 그러나 AptHER2의 결합 친화도는 -MNS는 AptHER2와 유사하게 측정되었습니다. , 이 결과는 바인딩되지 않은 AptHER2가 충분하지 않음을 의미합니다. -SH는 aptamer와 HER2 protein 또는 mWMNCs 사이의 상호작용을 방해할 수 있으며 aptamer의 binding affinity에 영향을 미치지 않거나 거의 영향을 미치지 않습니다.
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항-HER2 앱타머(AptHER2)의 결합 친화성 데이터 -OH) 티올화 항-HER2 앱타머(AptHER2 -SH) 및 AptHER2 - 필터 결합 분석을 측정하여 HER2 단백질에 대한 MNS. 아 압타머의 필터 결합 분석 과정을 보여주는 개략도. ㄴ HER2 농도에 대한 분획 결합 압타머 그래프. ㄷ 케이 d AptHER2의 값 그래프 -OH(0.42 ± 0.05nM, R 2 =0.99, p <0.0001), AptHER2 -SH(26.88 ± 8.24nM, R 2 =0.98, p <0.0001) 및 AptHER2 -MNS(0.57 ± 0.26nM, R 2 =0.91, p =0.001) b에서 계산됨 . 오차 막대는 양수 y로 표시되었습니다. -축만
생체 내 MRI 실험은 AptHER2의 능력을 평가하기 위해 동계 마우스 종양 모델을 사용하여 수행되었습니다. - HER2 과발현 종양을 표적으로 하는 MNS. NIH3T6.7 세포를 허벅지에 이식하여 생성한 종양 모델을 사용하여 WMNC 또는 AptHER2 주입 전부터 주입 후 120분까지 MRI 실험을 수행했습니다. -MNS(그림 5, 추가 파일 1 참조:그림 S4). IONP 기반 조영제에 의한 T2 조영제에 의한 조영증강 효과는 양성자 주변의 T2 단축 효과를 유도하여 영상을 어둡게 하여 관찰된다. 따라서 신호 강도 분석에서 T2 또는 T2* 값은 R2 또는 R2*로 표시되었습니다. T2의 역값인 R2는 신호 강도를 양수 값과 비교하는 데 사용됩니다. WMNC의 경우 WMNC 주입 후 30분에 가장 높은 R2 신호 강도가 관찰된 후 점차 감소했습니다(그림 5a, b). WMNC 주입 후 120분에 T2 신호 강도는 주입 전 상태와 유사했습니다. R2 신호 강도의 평균값의 변화율은 10% 미만이었습니다. 따라서 T2 강조 MR에서는 육안으로 식별하기 어려웠습니다. 이전 연구에서는 T80으로 둘러싸인 산화철 나노입자가 표적화 모이어티가 없음에도 불구하고 종양 조직 주위에 축적된다는 것이 입증되었습니다[46]. 그러나 해당 연구에서 1.4mg의 조영제Fe 마우스 당 T2 강조 MRI에 사용되었으며, 이는 이 연구에서 사용된 용량보다 14배 더 높습니다. 이는 WMNC가 0.1mgFe의 용량에서 실험에서 효과적인 조영제 향상 효능을 나타낼 수 없음을 의미합니다. 마우스당(5mgFe /킬로그램). R2* 신호 강도의 시계열 변화도 10% 미만이었고 통계적 유의성은 없었다. 대조적으로, 주사 후 120분, AptHER2 -MNS는 AptHER2 주입 전보다 130% 더 높은 신호 강도 향상을 일으켰습니다. - WMNC와 동일한 주사 용량을 사용함에도 불구하고 MNS(그림 5c, d). 이 주사량은 압타머로 변형된 자성 나노입자 기반 조영제에 대한 다른 연구보다 2~30배 낮았다[44, 47, 48]. 이 결과는 AptHER2 -MNS는 WMNCs나 다른 aptamer-modified 조영제보다 더 높은 표적화 능력을 가지고 있으며 또한 AptHER2의 고대비 증강 효과를 시사함 -MNS는 WMNC보다 낮은 선량에도 불구하고 예상될 수 있습니다. 조영증강은 주로 말초혈관과 종양조직의 중심에서 나타났다. AptHER2 주사 직후 말초혈관이 어두워졌지만 -MNS, 종양 병변 중앙의 조영증강은 60분에 처음 나타나 120분까지 증가하는 경향이 있습니다.
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WMNC를 사용한 HER2+ 종양 마우스 모델의 생체 내 MR 이미지(n =3) 또는 AptHER2 -MNS(n =3). 아 WMNC 주입 전후의 T2 및 T2* 강조 MR 이미지. ㄴ a에서 측정된 상대 신호 강도 그래프 . ㄷ AptHER2 주입 전후의 T2 및 T2* 강조 MR 이미지 - MNS. d 상대 신호 강도 그래프 및 e c에서 측정된 종양 영역의 강도 히스토그램 . 에 MR 영상 후 얻은 조직학적 분석 데이터. 오차 막대는 양수 y로 표시되었습니다. -축만. b의 상대 신호 강도 , d , 및 e a의 빨간색 실선 ROI에서 측정되었습니다. , ㄷ 및 추가 파일 1:그림 S4
AptHER2 주입 전후의 대비 강화 효과의 가시적인 변화를 강조하기 위해 -MNS, R2 신호 강도의 히스토그램 분석은 T2 강조 MRI 이미지에서 ROI에서 수행되었습니다(그림 5e). T2 신호는 T2 강조 MRI 영상에서 음의 강화로 명백하기 때문에 R2로 표현하였다. AptHER2 주입 후 -MNS, 히스토그램의 중심이 오른쪽으로 이동되었습니다. 히스토그램 중심의 차이를 계산하면 약 10% 정도의 명암비 향상이 관찰되었습니다.
AptHER2의 존재를 확인하려면 -조직학적으로 종양의 MNS는 Prussian blue 염색을 시행하였다(Fig. 5f). Prussian blue 염색 조직에서 핵과 세포질은 짙은 분홍색 또는 연한 분홍색으로 염색되었고, 종양 세포 주변에 여러 개의 파란색 점들이 관찰되었다. AptHER2인 경우 종양 조직이 파란색으로 염색된다고 가정했습니다. -MNS는 종양을 표적으로 했습니다. Prussian blue 염색 결과 종양 조직에서 파란색 점이 관찰되었으며 AptHER2의 조직 슬라이드가 관찰되었습니다. -MNS는 WMNC보다 약 3배 많은 파란색 점을 가지고 있습니다. 프러시안 블루 염색은 조직에서 Fe 이온을 감지할 수 있습니다. 따라서 종양 조직에서 IONP 기반 조영제의 축적을 확인하는 데 사용되었습니다[44, 49, 50].
결론적으로 AptHER2 -MNS는 HER2 발현 마우스 종양 모델에서 물리화학적 특성화 및 생체 내 MRI 실험에 의해 생체 내 HER2 표적 MRI 조영제로 작동합니다. AptHER2 -MNS는 HER2에 대한 이완성과 특이성이 높으며, 산화철 나노입자로 인해 다른 T2 조영제보다 낮은 투여량에도 불구하고 현저한 조영증강 효과를 보였다. 이 조영제는 암 환자에서 HER2 암의 발현에 관한 정보를 제공할 것으로 기대되며 HER2 표적 약물을 사용하는 화학 요법 동안 HER2+ 암 환자를 모니터링하는 데 활용될 수 있습니다. 우리는 이 연구의 결과가 HER2 과발현 암의 진단 및 환자 치료를 위한 유망한 전략을 제공할 것으로 기대합니다.
나노물질
초록 현재 다양한 형광 나노물질이 외과용 항법용 광학 조영제로 설계 및 합성되고 있다. 그러나, 실리콘 양자점(Si QD)을 이용한 폐암 수술 항법용 형광 조영제의 제조에 대한 보고는 없었다. 이 연구는 Pi et al.에 의해 보고된 수분산성 Si QD 미셀을 개선하고 수정했습니다. Si QD 미셀-CKAP4를 준비합니다. 데이터는 Si QD 미셀-CKAP4가 약 78.8nm의 평균 수압 직경을 갖는 구형 입자임을 보여주었습니다. Si QD 미셀-CKAP4의 UV-가시광 흡수 범위는 200~500nm입니다. 여기 파장이 330n
초록 빠르고 통제할 수 없는 세포 성장이 합병증과 조직 기능 장애를 일으키는 질병인 암의 유병률 증가는 과학자와 의사의 심각하고 긴장된 우려 중 하나입니다. 오늘날 암 진단과 특히 그 효과적인 치료는 지난 세기 건강과 의학의 가장 큰 과제 중 하나로 여겨져 왔습니다. 약물 발견 및 전달의 상당한 발전에도 불구하고 일반적으로 건강한 조직 및 기관에 손상을 일으키는 많은 부작용과 부적절한 특이성 및 민감도가 약물 사용에 큰 장벽이 되어 왔습니다. 이들 치료제의 투여 기간과 양에 대한 제한도 도전적이다. 반면에, 화학 요법 및 방사선
