HER2 표적 자기 나노센시타이저로 HER2 양성 암의 생체 내 MRI 향상

초록

본 연구는 높은 자기 감도를 가진 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2) 표적 자기공명영상(MRI) 조영제 개발을 목표로 한다. 항-HER2 압타머 변형 자기 나노센시타이저(Apt_HER2-MNS)는 5'-티올 변형 압타머와 말레이미드화 자기 나노결정(MNC) 접합으로 제조하였다. 물리화학적 특성과 표적 능력을 확인하였고, Apt_HER2-MNS의 HER2 단백질 결합 친화도(K_d)는 0.57 ± 0.26 nM였다. HER2 양성 암세포(NIH3T6.7) 이종이식 마우스 모델(n=3)에서 3T 임상 MRI로 생체 내 조영 증강 능력 검증. 대조군은 비표지 MNC 사용. Apt_HER2-MNS 주입 후 T2 가중 영상에서 종양 부위 조영 증강이 최대 150% 달성됨.

배경

표피 성장 인자 수용체(EGFR) 패밀리인 HER2는 인간 악성 종양에서 핵심 역할 수행, 약 30% 유방암에서 과발현[1]되며 위, 방광, 난소, 폐암 등에서도 과발현[1-4]. HER2 과발현 유방암 환자는 비과발현 환자보다 생존율 현저히 낮음[5]. 또한 HER2 과발현은 유방암 전이 증가시킴[6-8]. 이러한 이유로 HER2는 암 진단의 중요 바이오마커. 임상에서는 HER2를 에스트로겐 수용체(ER), 프로게스테론 수용체(PR)와 함께 유방암 진단의 전형적 생물학적 표지자로 사용. 환자는 HER2, ER, PR 발현 수준의 조직학적 검증 후 확진. 그러나 조직 검증은 침습적이며 제한적 병변만 가능. 이에 비침습적 영상 진단으로 진단 마커 시각화 연구 다수: CT[9,10], PET[11-13], SPECT[14-16], MRI[17-20], 다중 모달 영상[21-23].

산화철 나노입자(IONP)는 임상 관련 바이오마커 관찰을 위한 다양한 비침습적 영상에 활용[24,25]. IONP는 가돌리늄 기반 조영제(GBCA)나 니켈/코발트 함유 조영제보다 높은 자기 감도나 생체적합성으로 분자 영상에 적합. 특히 상용 MRI 조영제와 GBCA는 Gd³⁺ 이온 방출로 인한 생체 내 독성 문제 있으나, IONP 기반 조영제는 철로 분해되어 흡수/배출되므로 GBCA보다 생체 내 안전성 우수[26,27].

IONP를 분자 영상에 적용하려면 표적 모이어티가 필수적: 화학물질, 탄수화물, 단백질, 항체, 압타머[25,28,29]. 이 중 압타머는 특정 분자에 높은 결합 친화도와 특이성을 갖는 안정적 3차원 단일 가닥 핵산 구조. 압타머의 높은 친화도는 체계적 리간드 진화(SELEX) 기술 덕분[30]. SELEX는 화학 합성으로 제공되는 거대 랜덤 시퀀스 올리고뉴클레오티드 라이브러리(~10¹⁵)를 병렬 스크리닝하여 표적에 높은 친압타머 발굴. 그 결과 압타머는 일반적으로 피코몰라 농도 수준의 높은 결합 친화도 개발 가능, 다른 생체분자는 마이크로몰에서 서브나노몰 범위[31,32]. 최근 개발된 3세대 압타머는 변형 핵산 사용으로 DNase/RNase 저항성 향상되어 in vitro/in vivo 안정성 확보[33,34]. 이런 이유로 압타머는 분자 영상 연구에서 선호되는 모이어티로 부상[35].

본 연구 목적은 자기 나노결정(MNC) 기반 압타머 변형 T2 조영제 개발로, HER2 과발현 암세포에 높은 특이성 부여. 이를 위해 열분해법으로 높은 자기 감도 MNC 제조, HER2 특이적 압타머(K_d = 0.42 nM) 사용. 합성 조영제는 형태, 자화 특성, 자기 이완율 분석으로 특성화. 또한 HER2 발현 암세포주 이종이식 동물 모델에서 in vitro/in vivo 표적 분석 수행.

실험 방법

재료

TWEEN® 80(T80), 4-(디메틸아미노)피리딘, N,N'-다이사이클로헥실카르보디이미드, 트리에틸아민, 무수 디클로로메탄, 아세틸아세톤산철(III), 1,2-헥사데칸디올, 도데칸산, 도데실아민, 벤질 에테르는 Sigma-Aldrich(미국), 3-말레이미도프로피온산(MPA)은 TCI America(미국) 구매. RPMI-1640, DMEM, 태아우혈청, Gibco® 항생제-항진균 용액은 Life Technologies(미국). NIH3T6.7은 American Tissue Type Culture(미국). DEPC 처리수는 Biosesang Inc.(한국). 티올화 항-HER2 압타머[Apt_HER2, 서열: 5'-6CC 6GG CA6 G66 CGA 6GG AGG CC6 66G A66 ACA GCC CAG A-3' (6: NapdU), 5'-SH 변형, 40-mer]는 Aptamer Science Inc.(한국) 구매.

MNC 합성

단분산 자성 산화철 나노입자는 Sun의 열분해법[36]으로 합성. 이 자성 나노입자는 아세틸아세톤산철(III)과 올레산 전구체로 인해 MNC라 명명. 간략히: 아세틸아세톤산철(III)(2 mmol), 올레산(6 mmol), 1-옥타데센(6 mmol), 1,2-헥사데칸디올(10 mmol), 벤질 에테르(20 mL)를 삼구 플라스크에 넣고 기계 교반. 잔류 산소와 물 제거 위해 100°C에서 30분 예열. 이후 200°C에서 2시간, 300°C에서 30분 질소 분위기 하 환류. 냉각 후 과량 에탄올로 정제. 원심분리 3회 반복으로 미분산 잔여물 분리. Fe₃O₄ 나노입자 생성물을 5 mL 헥세인에 재분산. 위 과정을 100 mg Fe₃O₄와 전구체로 반복하여 최종 생성물 합성. MNC 형태는 고분해능 투과전자현미경(HR-TEM, JEM-2100, JEOL, 일본)으로 평가. 포화 자화는 진동 시료 자력계(VSM, MODEL-7300, Lakeshore, 미국)로 상온 측정. 생성물 중 MNC 함량은 열중량 분석기(SDT-Q600, TA Instrument)로 중량 측정 분석, Fe₃O₄ 함량 약 80% 도달까지 세척.

말레이미딜-TWEEN® 80 합성

말레이미딜 T80(Tm80) 제조 위해 15.3 mmol MPA와 22.9 mmol N,N'-다이사이클로헥실카르보디이미드를 각각 10 mL 디클로로메탄에 용해 후 혼합. 이 혼합물에 7.6 mmol T80 함유 20 mL 디클로로메탄 첨가, 이어 3.2 mL 트리에틸아민 첨가. 마지막으로 22.9 mmol 4-(디메틸아미노)피리딘을 10 mL 디클로로메탄에 용해, 모든 시약을 70 mL 바이알에 혼합. 자석 교반기로 48시간 교반. 혼합물 색상이 살구색에서 적포도주색으로 변화. 48시간 후 결정화된 요소 여과 제거. 디클로로메탄 제거 위해 회전증발기(N-1100, EYELA, 일본)로 증발 여과. 생성물 탈염수에 현탁, 미반응 시약 투석(Spectra/Por®, 1 kDa MWCO, Spectrum Laboratory, 미국)으로 제거. 동결건조로 최종 생성물 제조. 합성된 Tm80은 MPA, T80과 UV-Vis 분광광도계(UV-1800, Shimadzu, 일본), FT-IR 분광기(PerkinElmer, spectrum two), ¹H-NMR 분광기(Bruker Biospin, Advance II, 추가 파일 1: Figure S1)로 비교 확인.

말레이미딜 MNC 제조

수분산성 말레이미딜 MNC(mWMNC)는 나노에멀전법[37]으로 제조. 간략히: 100 mg Tm80을 20 mL 탈염수에 완전 용해, 20 mg MNC 함유 4 mL n-헥세인을 초음파(190 W)와 교반(1200 rpm) 하에 Tm80 용액에 급속 주입. 에멀전 과정 얼음 냉각 하 10분 지속. 잔류 유기 용매 상온 12시간 증발, 생성물 투석(Spectra/Por®, 3.5 kDa MWCO, Spectrum Laboratory, 미국)으로 3일간 과량 계면활성제 제거. mWMNC를 원심 필터(NMWL 3000, Amicon® Ultra, Merck Milipore, 독일)로 1.25 mg_Fe/mL(DEPC 처리수)까지 농축. T80 피복 MNC(WMNC)도 동일 법으로 제조.

Apt_HER2-MNS 제조

mWMNC와 항-HER2 압타머 접합 전 티올 변형 압타머 환원 단계 수행. 간략히: 1 nmol 압타머를 0.3 mL 탈염수에 용해, 트리에틸아민 아세테이트와 1,4-다이티올레톨 용액 첨가하여 최종 농도 각 50, 25 mM. 실온 1.5시간 진탕, 에탄올 침전으로 정제 및 탈염. Apt_HER2-MNS 제조 위해 MNC 분자량 이론적 계산(추가 파일 1: Figure S2) 후 mWMNC:압타머 혼합비 1:7 지정. 따라서 100 µg(Fe) mWMNC(Fe₃O₄ 환산 45 pmol)를 PBS(1 mL)에 용해, 5 µg(0.35 nmol) 압타머 첨가. 실온 5분 교반 후 4°C 2시간 인큐베이션. Apt_HER2-MNS의 수동적 직경 분포는 동적 빛산란 분석기(ELS-Z, Otsuka Electronics, 일본)로 분석. MRI 조영제로서 능력 확인 위해 1.5T 임상 MRI와 마이크로-47 표면 코일(Intera, Philips, 네덜란드)로 다양한 농도 팬텀으로 T2 이완율(R2) 분석. R2는 Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG) 시퀀스로 상온 측정: TR=10 s, 12 ms 간격 32 에코, 획득 수 1, 포인트 해상도 156×156 µm, 두께 0.6 mm. R2 단위는 s⁻¹로 1/T2 정의.

Apt_HER2-MNS 결합 친화도 분석

니트로셀룰로오스 필터 결합법[38]으로 HER2 특이성 검증. 네이키드 Apt_HER2와 Apt_HER2-MNS를 알칼리 포스파타제(New England Biolabs, 미국)로 탈인산화. 압타머 5' 또는 3' 말단을 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제와 [³²P]-ATP(Amersham Pharmacia Biotech, 미국)로 표지[39]. 결합 분석은 ³²P 표지 압타머 10 pM을 HER2 단백질(100-10 pM 농도 범위)과 선택 버퍼(20 mM Tris·HCl, pH 7.5 at 4°C, 6 mM NaCl, 5 mM 2-메르캅토에탄올, 1 mM Na₃EDTA, 10% v/v 글리세롤)에서 37°C 30분 인큐베이션. 혼합물 G-50 컬럼(GE Healthcare, 영국)으로 여과하여 자유 방사성 동위원소 제거. 여과액 재사용 필름에 전개, 포스포이미저(Fuji FLA-5100, 도쿄, 일본)로 HER2 결합 압타머 분율 정량. 비특이적 배경 결합 효과 제거 위해 ³²P 표지 압타머만으로 실험 수행하여 원시 데이터 보정.

생체 내 MRI

모든 동물 실험은 국제실험동물평가인증협회 승인 하 수행. 생체 내 MRI는 시너지닉 마우스 종양 모델로 수행: 5주령 암컷 BALB/c 누드 마우스 대퇴부에 NIH3T6.7 세포(1.0×10⁷) 이식 후 2주 경과 시 MRI로 종양 크기 평가. 종양 약 500 mm³ 도달 시 꼬리정맥으로 100 µg(5 mg/kg) Apt_HER2-MNS 주입. 3.0T 임상 MRI와 8채널 인간 손목 코일로 생체 내 MRI 수행. 3.0T T2 가중 MRI 파라미터: TR/TE=1054/70 ms, 획득 수 2, 포인트 해상도 400×319 mm, 두께 1 mm, TSE factor=8. 대조군은 WMNC로 동일 방법. 모든 T2 신호 강도는 각 마우스 모델(n=3)의 T2 가중 영상에서 약 5개 ROI 평균으로 계산, R2(또는 R2*, T2 역수)를 신호 강도 분석에 사용. 상대 신호 강도 시간 변화는 초기 신호 강도(주입 전)로 정규화. ROI 내 복셀 R2 신호 강도 히스토그램 분석도 수행.

조직학적 분석

프러시안 블루 염색으로 종양 조직 내 Fe 이온 검출, 생체 내 MRI 후 각 종양 모델에서 종양 조직 수확하여 Apt_HER2-MNS의 HER2 발현 암 표적화 확인. 수확 조직 10% 포르말린 24시간 고정, 에탄올 농도 기울기로 탈수, Histo-Clear®(National Diagnostics, 미국)로 투명화 후 파라핀 포매. 프러시안 블루 염색: 조직 절편(두께 5 µm)을 유리 슬라이드에 마운트, Histo-Clear®와 고농도 에탄올로 탈파라핀화 및 수화. 프러시안 블루 작동액(10% 페로시안화칼륨과 20% 염산 1:1)에 1시간 침지. 핵은 Nuclear Fast Red 염색액(Sigma Aldrich, 미국)으로 염색. 조직 시료 30분씩 3회 세척 후 마운팅 용액 2-3방울 떨어뜨리고 커버슬립 덮음. 염색 조직 절편 Olympus BX51과 Olyvia 소프트웨어(Olympus, 일본)로 관찰.

결과 및 고찰

Apt_HER2-MNS는 IONP 기반 단일 분자 표적 에이전트로 설계되어 MRI로 HER2 발현 종양 분자 영상 구현. 따라서 높은 표적 특이성과 큰 자기 감수성 필요. 높은 자기 감도 확보 위해 MNC, 단분산 Fe₃O₄ 나노입자를 열분해 및 시드 성장법[36]으로 합성. Apt_HER2-MNS 제조 및 생체 내 적용 실험 절차 Fig. 1에 도시. 우선 HR-TEM으로 MNC 크기와 형상 확인(Fig. 2a,b). Fig. 2c에서 TEM 이미지에서 무작위 선정한 130개 MNC 크기 측정, 매우 좁은 크기 분포(10.49 ± 1.74 nm)와 구형 관찰. MNC 초상자성도 VSM으로 평가, 포화 자화 98.8 emu/g_Fe(Fig. 2d). 현재 정맥 주입 가능한 T2 조영제는 초상자성 산화철(SPIO) 또는 초미세 초상자성 산화철(USPIO) 기반[40]. SPIO/USPIO도 초상자성이나 포화 자화 70 emu/g_Fe 미만[40-43]. 초상자성은 IONP가 자기장에서만 자성 띠게 하여 응집 방지, 정맥 주입 조영제 필수 조건. 또한 MNC의 높은 포화 자화는 SPIO/USPIO 기반 조영제보다 주입 용량 감소에 도움.

생체 내 실험용 MNC로 WMNC와 mWMNC를 T80 또는 Tm80 사용 나노에멀전법으로 제조. 제조된 Tm80과 전구체 MPA, T80의 물리화학적 특성은 흡광도, FT-IR, ¹H-NMR 스펙트럼 분석으로 확인(추가 파일 1: Figure S1). 선행 연구[44]에서 Tm80 사용 나노에멀전법으로 제조된 mWMNC는 물에 안정 분산. 또한 mWMNC의 말레이미딜 기는 중성 pH 티올 기 보유 분자와 쉽게 접합되며 부생성물 생성 안 함. NapdU 변형 압타머로 생체 내 반감기 연장, 사람 혈청에서 반감기 151 h(추가 파일 1: Figure S3). Apt_HER2-MNS는 mWMNC와 Apt_HER2-SH 접합으로 제조, 수동적 특성 동적 빛산란과 MR 이완율 분석으로 평가(Fig. 3). WMNC와 Apt_HER2-MNS 직경 각각 28.8 ± 7.2, 34.1 ± 8.2 nm(Fig. 3a). Apt_HER2가 40-mer 올리고뉴클레오티드로 약 5-10 nm 길이이므로 수동적 직경 차이 원인 가능. WMNC와 Apt_HER2-MNS 이완율 각각 265.7, 257.2 mM⁻¹_Fe s⁻¹(Fig. 3b), MRI 조영제로서 자기 감도 확인. FDA 승인 SPIO/USPIO 기반 T2 조영제는 주로 공동침전법 합성으로 결정성 낮아 자기장에서 낮은 이완율(190 mM⁻¹_Fe s⁻¹ 미만)[40]. 본 연구 MNC 사용으로 Apt_HER2-MNS는 SPIO/USPIO 기반 대비 35-500% 향상된 자기 이완율 보유.

Apt_HER2-MNS의 HER2 단백질 결합 친화도 필터 결합 분석으로 평가(Fig. 4a), Apt_HER2-SH와 Apt_HER2-MNS의 K_d 각각 26.88 ± 8.24, 0.57 ± 0.26 nM 측정(Fig. 4b,c). Apt_HER2-OH는 K_d 0.42 ± 0.05 nM로 HER2에 매우 높은 특이성, Herceptin®(5 nM) 대비 약 10배 높음[45]. 그러나 네이키드 Apt_HER2 결합 친화도는 화학물질, 분자, 나노입자 접합 시 변할 수 있음. 따라서 mWMNC 접합 후 Apt_HER2의 HER2 결합 친화도 평가 필요. Apt_HER2-SH의 HER2 친화도는 네이키드 Apt_HER2보다 티올 기 존재로 감소(단백질 내 다른 티올 잔기나 티올 변형 압타머와 결합 가능). 그러나 Apt_HER2-MNS 친화도는 Apt_HER2와 유사하게 측정됨. 이는 압타머-HER2 단백질 상호작용을 방해할 만큼 충분한 비결합 Apt_HER2-SH가 없거나 mWMNC가 압타머 결합 친화도에 영향 거의 없음을 의미.

생체 내 MRI 실험은 시너지닉 마우스 종양 모델로 수행하여 Apt_HER2-MNS의 HER2 과발현 종양 표적 능력 평가. NIH3T6.7 세포 이식으로 생성된 종양 모델에서 WMNC 또는 Apt_HER2-MNS 주입 전부터 120분 후까지 MRI 실험 수행(Fig. 5, 추가 파일 1: Figure S4 참조). IONP 기반 조영제의 T2 조영 증강은 주변 양성자 T2 단축 효과로 영상 어두워짐으로 관찰. 따라서 신호 강도 분석에서 T2 또는 T2* 값을 R2 또는 R2*로 표현. R2는 T2 역수로 양수 값으로 신호 강도 비교. WMNC 경우 주입 30분 후 최고 R2 신호 강도 관찰 후 점진적 감소(Fig. 5a,b). WMNC 주입 120분 후 T2 신호 강도는 주입 전 상태와 유사. 평균 R2 신호 강도 변화율 10% 미만으로 T2 가중 영상에서 육안 인지 어려움. 선행 연구[46]에서 표적 모이어티 없는 T80 피복 산화철 나노입자도 종양 조직 주변 축적 입증되었으나, 그 연구에서는 T2 가중 MRI에 1.4 mg_Fe/마우스 용량 사용으로 본 연구 용량(0.1 mg_Fe/마우스, 5 mg_Fe/kg)보다 14배 높음. 즉 WMNC는 0.1 mg_Fe/마우스 용량에서 효과적 조영 증강 못 보임. R2* 신호 강도 시계열 변화도 10% 미만, 통계적 유의성 없음. 반면 Apt_HER2-MNS는 WMNC와 동일 주입 용량에서도 주입 120분 후 주입 전 대비 130% 높은 신호 강도 증강 유도(Fig. 5c,d). 이 주입 용량은 압타머 변형 자기 나노입자 기반 조영제 타 연구[44,47,48] 대비 2-30배 낮음. 이는 Apt_HER2-MNS가 WMNC나 타 압타머 변형 조영제보다 높은 표적 능력 보유, 더 낮은 용량에서도 높은 조영 증강 효과 기대됨을 시사. 조영 증강은 주로 종양 조직 주변 혈관과 중심부에서 출현. 주변 혈관은 Apt_HER2-MNS 주입 직후 어두워짐, 종양 병변 중심부 조영 증강은 60분 최초 출현 후 120분까지 증가 경향.

주입 전후 Apt_HER2-MNS 조영 증강 효과 가시적 변화 강조 위해 T2 가중 MRI 영상 ROI에서 R2 신호 강도 히스토그램 분석 수행(Fig. 5e). T2 신호는 T2 가중 영상에서 음성 증강으로 나타나므로 R2로 표현. Apt_HER2-MNS 주입 후 히스토그램 중심이 우측 이동. 히스토그램 중심 차이 계산 시 약 10% 조영 증강 증가 관찰.

Apt_HER2-MNS 종양 내 존재 조직학적 확인 위해 프러시안 블루 염색 수행(Fig. 5f). 프러시안 블루 염색 조직에서 핵과 세포질은 진한/연한 분홍색, 종양 세포 주변에 여러 파란 점 관찰. Apt_HER2-MNS가 종양 표적화 시 조직 파란색 염색 예상. 염색 결과 종양 조직에서 파란 점 관찰, Apt_HER2-MNS 조직 슬라이드는 WMNC 대비 약 3배 많은 파란 점 보유. 프러시안 블루 염색은 조직 내 Fe 이온 검출 가능하므로 IONP 기반 조영제의 종양 조직 축적 확인에 활용[44,49,50].

결론

결론적으로 물리화학적 특성 분석과 HER2 발현 마우스 종양 모델 생체 내 MRI 실험으로 Apt_HER2-MNS가 생체 내 HER2 표적 MRI 조영제로 작동함 확인. Apt_HER2-MNS는 높은 이완율과 HER2 특이성 보유, 철산화물 나노입자 덕분에 타 T2 조영제보다 낮은 투여 용량에서도 현저한 조영 증강 효과 입증. 이 조영제는 암환자 HER2 발현 정보 제공 및 HER2 표적 약물 화학요법 중 HER2+ 암환자 모니터링에 활용 기대. 본 연구 결과가 HER2 과발현 암 진단과 환자 치료를 위한 유망한 전략 제공하길 기대.