표적 화학요법: 압타머 기능화 메조포러스 실리카 나노입자로 백혈병 세포에 독소루비신 직접 전달

서론

급성 림프모구성 백혈병(ALL)은 인간 건강을 심각하게 위협하는 이질적 악성 종양입니다[1,2,3]. 미국에서 매년 약 6000건의 급성 림프모구성 백혈병이 진단되며, 특히 아동과 청소년에서 많습니다. ALL은 아동 중 가장 흔한 암이며 20세 이전 암 사망의 가장 흔한 원인입니다[4].

화학방사선요법과 골수 조혈모세포 이식은 ALL 표준 치료입니다. 방사선요법은 상당한 전신 부작용과 관련되며 최적 조사 부위가 불분명합니다. 골수 조혈모세포 이식은 비용, 환자 연령, 기증자 골수 부족으로 종종 비현실적입니다. 화학요법은 원격 병소를 제거하여 재발 예방에 효과적일 수 있으나, 대부분의 항종양 약물은 순환계를 통해 종양에 도달하는 비율이 극히 일부에 불과합니다. 이는 낮은 약물 생체이용률과 정상 세포 대비 병든 세포에 대한 낮은 선택성을 초래하여 심각한 부작용과 약물 내성 위험을 증가시킵니다.

나노 약물 전달 시스템은 약물 단독보다 훨씬 더 효과적이고 표적화된 항종양 약물 전달을 제공할 수 있으며, 종양 미세환경의 특정 조건에 의해 유발되는 약물 방출을 포함합니다[5, 6]. 이러한 시스템 중 메조포러스 실리카 나노입자(MSN)는 크고 수정 가능한 표면, 다양한 양과 유형의 약물을 탑재할 수 있는 조절 가능한 기공 부피, 우수한 생체적합성으로 주목받아 왔습니다[7, 8]. 기능성 반응기와의 표면 개질로 특정 조건에서 약물 방출 MSN 생성 가능하며, 표적 분자 개질로 MSN이 원하는 조직에 선택적으로 약물 전달 가능합니다[9, 10].

MSN과 호환되는 표적 분자 유형 중 하나가 압타머입니다. 압타머는 표적에 특이적이고 강력하게 결합하는 "화학적 항체" 역할을 하는 단일 가닥 DNA 또는 RNA입니다. 압타머는 단일클론 항체보다 작고 제조 및 수정이 용이하며, 조직 투과성이 더 좋고 독성과 면역원성이 낮습니다. 따라서 압타머는 종양 검출과 표적 화학요법에 널리 사용됩니다[11,12,13]. SELEX 법으로 CEM 인간 급성 T 림프구 백혈병 세포에 특이적으로 결합하는 압타머 Sgc8이 확인되었습니다[14, 15]. Sgc8은 CEM 세포막의 단백질 티로신 키나아제-7(PTK-7)을 인식합니다. Sgc8을 화학요법 약물 및 특정 나노소재에 추가하면 백혈병 세포 표적화와 사멸을 개선할 수 있습니다[16, 17].

우리는 백혈병 세포를 높은 민감도와 특이도로 검출하기 위한 Sgc8 압타머 변형 형광 실리카 나노입자 시스템(Sgc8-FSNPs)을 설계했으며, 이는 백혈병 진단뿐만 아니라 항백혈병 약물 표적 전달에도 유용함이 입증되었습니다[18]. 이 연구를 기반으로 본 연구에서는 독소루비신(Dox)을 MSN에 캡슐화하고 Sgc8로 장식했습니다(그림 1). 결과적인 Sgc8-MSN/Dox는 약물 전달에 적합한 양호한 형태와 크기를 보였으며, 배양에서 나노입자가 백혈병 세포에 선택적으로 섭취되어 종양 세포를 효과적으로 사멸시켰습니다. 본 연구 목적은 압타머 변형 메조포러스 실리카 나노입자가 종양 표적 진단뿐만 아니라 약물 탑재로 종양 사멸도 가능함을 밝혀 종양 표적 테라노스틱스 아이디어를 제공하는 것입니다.

Sgc8 압타머 변형 메조포러스 실리카 나노입자의 효율적인 세포 표적 약물 전달 시스템 개략도. CEM 세포, CCRF-CEM 인간 급성 T 림프구 백혈병 세포; Dox, 독소루비신; MSN, 변형 실리카 나노입자; PTK-7, 단백질 티로신 키나아제-7

실험 재료 및 방법

시약 및 재료

독소루비신 염산염(Dox)은 베이징 화펑 연합 기술(베이징, 중국)에서 구입. 분석급 테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS)와 3-트리에톡시실릴프로필아민(APTES)은 상하이 화학 시약 공장 I(상하이, 중국)에서, 세틸-트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB, 99% 순도)는 상하이 지즈 생화학 기술(상하이, 중국)에서 구입. 기타 모든 시약은 분석급. 카복실 변형 Sgc8 압타머(5′-ATCTAACTGCCGCCGCGGGAAAATGTACGGTTAG(T)₁₀-COOH-3′)[16]는 상하이 바이오엔지니어링(상하이, 중국)에서 합성.

세포주

다음 세포주들은 중국과학원 세포은행(상하이, 중국)에서 구입: 인간 급성 T 림프구 백혈병 세포주 CCRF-CEM, 인간 버킷 림프종 B 세포주 라모스, 인간 정상 간 세포주 L02, 인간 배아 신장 세포주 293T. 모든 세포주는 DMEM에 10% 태아 소 혈청(FBS, 하이클론)과 페니실린-스트렙토마이신(깁코, 그랜드 아일랜드, NY, USA) 보충, 37°C, 5% CO₂에서 배양.

Sgc8-MSN/Dox 제조

MSN은 문헌[19] 방법으로 제조: 0.50g CTAB을 240mL 초순수에 녹이고, 1.75mL 2M NaOH 용액 첨가, 오일 배스에서 80°C 가열. 강한 교반 하에 2.50mL TEOS를 서서히 방울방울 첨가, 2시간 지속 교반하여 흰색 침전물 얻음. 원심분리 10,000rpm 10분, 상등액 제거, 침전물을 초순수와 무수 에탄올로 번갈아 3회 세척, 60°C 진공 오븐에서 하룻밤 건조하여 MSN 획득.

Sgc8-MSN/Dox 제조: 0.2365g MSN을 삼구 플라스크에 23.65mL 무수 에탄올과 혼합, 710µL APTES 방울방울 첨가, 24시간 환류. 메탄올-HCl 용액(4:1)과 탈이온수로 번갈아 3회 세척 후 건조하여 MSN-NH₂ 획득. 실온에서 MSN-NH2 물질을 10mL 원심분리 튜브에 넣고 적량 인산염 완충액(PBS)에 분산, Dox(5mg/mL) 방울방울 첨가, 24시간 교반. 마지막으로 카복실 변형 Sgc8 압타머(100nM/mL) 첨가, 1시간 교반, 원심분리, PBS로 무색해질 때까지 세척하여 Sgc8-MSN/Dox 획득.

Sgc8-MSN/Dox 특성 분석

나노입자 X선 회절 패턴(XRD)은 XRD D4 디프랙토미터(브루커, 독일)로 측정. N₂ 흡착-탈착 등온선은 비표면적 및 기공 크기 분석기(TriStar 3000, GA Inc., USA)로 측정. BET 비표면적은 BET 플롯에서 계산. 기공 크기 분포는 등온선 흡착 분지에서 BJH 법으로 추정. 입자 크기와 정전기적 포텐셜은 나노 S 동적 빛 산란 분석기(말번, 영국)로 측정. 각 시료 3회 측정 평균. 입자 크기와 형태는 투과 전자 현미경(H-7650, 도쿄, 일본)으로 전자빔 가속 전압 100kV에서 평가. 한편, Sgc8 압타머의 MSN 표면 접합은 FT-IR 분광법(니코렛-5700, USA)으로 평가. 압타머 변형 MSN/Dox 효율 검출을 위해 Sgc8-MSN/Dox 제조 과정 세척 상등액 수집, 260nm에서 자외선 흡광도 측정, 표준 곡선 법으로 비결합 압타머 양 결정. 따라서 첨가 총량에서 비결합량 빼서 압타머 변형량 계산.

Sgc8-MSN/Dox로부터 Dox 방출

Sgc8-MSN/Dox로부터 Dox 방출은 다음과 같이 시험관 내 측정. Sgc8-MSN/Dox(10mg)을 pH 5.0 또는 7.4 완충액 10mL에 37°C에서 녹이고 100rpm 교반. 정해진 시간에 시료 채취, 5000rpm 10분 원심분리, 상등액을 Thermo Scientific 마이크로플레이트 리더(81 와이만 스트리트, 월섬, USA)로 482nm에서 분광광도법으로 Dox 분석[9].

Sgc8-MSN/Dox 표적화 능력

CEM 또는 라모스 세포(3×10⁶)를 PBS에 넣어 15mL 원심분리 튜브에 담고 Sgc8-MSN/Dox 또는 MSN/Dox(압타머 농도 200nM)와 혼합. 37°C에서 20-30분 배양, 원심분리로 세포 회수, PBS로 3회 세척, 4% 파라포름알데히드 30분 고정, PBS 3회 세척. 1mg/ml DAPI로 5분 배양, PBS 3회 세척 원심분리. 세포 펠렛을 PBS에 재현탁하여 슬라이드에 올리고 형광 공초점 현미경(니콘 DS-Ri1, 도쿄, 일본)으로 분석.

별도 실험에서 CEM과 라모스 세포(3×10⁵)를 대수 증식기에서 50µL PBS, 45µL 결합 버퍼[5mM MgCl₂, 4.5g/L 포도당, 1mg/ml 우혈청알부민(BSA) 보충 PBS], 10µL FBS[1mg/ml BSA 보충 PBS] 혼합물에 재현탁, 지시된 물질 200nM 압타머 농도로 포함. 혼합물을 4°C 암실에서 30분 흔듦. 세척 버퍼로 세척, 1000rpm 5분 원심분리, 추가 3회 세척. 마지막으로 500µL 세척 버퍼에 재현탁하여 유세포 분석(벡만 쿨터 Epics X L, 벡만 쿨터, 브레아, CA, USA)으로 분석.

MSN 세포독성

Dox나 압타머 없는 MSN 세포독성은 MTT 법으로 평가. CEM, 라모스, 293T, L-02 세포를 대수 증식기에서 96웰 플레이트(웰당 1.5×10⁴)에 접종. 웰당 100µL MSN 첨가, 5% CO₂ 인큐베이터 37°C에서 24 또는 48시간 배양. 웰당 20µL MTT 첨가, 37°C 30분 추가 배양, 1500rpm 10분 원심분리, 배양 상등액 폐기. 웰당 200µL DMSO 첨가, 암실 10분 흔듦, 자동 마이크로플레이트 리더로 570nm 광학 밀도(OD) 측정. 각 시료 6반복, 결과 평균±SD로 표현.

Sgc8-MSN/Dox에 의한 세포 사멸

CEM, 라모스, 293T, L-02 세포를 96웰 플레이트(웰당 1×10⁵ 세포)에 접종, 자유 Dox, MSN/Dox, 또는 Sgc8-MSN/Dox를 Dox 농도 1, 5, 10, 15, 20µg/mL로 24시간 배양. Sgc8-MSN/Dox가 압타머 수용체 통해 CEM 세포 표적 사멸하는지 추가 확인 위해, 먼저 충분한 Sgcc8 압타머를 CEM 세포와 2시간 배양, 이후 Dox 농도 20µg/ml에서 sgc8-MSN/Dox와 24시간 공동 배양. 생존율은 "MSN 세포독성" 섹션 기술 MTT 분석법으로 비교.

통계 분석

결과는 Student's t 검정과 최소 유의차 검정을 동반한 일원 분산 분석으로 통계적 분석. 모든 분석은 GraphPad Prism 6.02(그래프패드 소프트웨어, 샌디에이고, CA, USA)로 수행.

결과 및 고찰

Sgc8-MSN/Dox 특성 분석

X선 회절 데이터는 합성 나노입자가 X 영역에서 육각 메조기공의 전형적 회절 피크를 가짐 보여줌(그림 2a), MSN 구조 확인. MSN의 특정 표면적, 기공 크기 분포, 메조포러스 파라미터 추가 연구 위해 MSN 질소 흡착-탈착 시험 수행. MSN N₂ 흡착-탈착 등온선(그림 2b)은 타입 IV 등온선 특성 보여 메조포러스 특성 확인. BET 모델 계산 표면적 1389m²/g. BJH 곡선은 입자 기공 크기 분포가 좁음 보여줌(그림 2b, 삽도). 기공 크기 5.23nm, 기공 부피 2.51cm³/g. 큰 비표면적과 기공 부피, 풍부한 메조기공은 더 강한 약물 로딩 능력 가능하게 하고 우수한 약물 전달체 잠재력 제공. 전자 현미경은 Sgc8-MSN/Dox가 좋은 분산성과 균일 크기, 구형 또는 타원형 형태 가짐 보여줌(그림 3a). PBS에서 MSN/Dox 평균 제타 전위 -26.53mV, Sgc8-MSN/Dox에서 -33.87mV로 감소(그림 3b), Sgc8 압타머 음전하 반영[20]. 메조포러스 실리콘 표면 기공 채널 관찰. PBS에서 MSN/Dox 평균 수화 입자 크기 98.35nm, Sgc8 압타머 연결 후 Sgc8-MSN/Dox로 103.24nm 증가(그림 3c, d). Sgc8-MSN/Dox 성공적 접합 추가 확인 위해 FT-IR 분광법 분석 수행. 적외선 스펙트럼 그림 3e 표시. 3400cm⁻¹, 1100cm⁻¹, 500cm⁻¹ 피크는 실리카 특성 피크. ~2400cm⁻¹ 피크는 CTAB 템플릿제 피크. ~1600cm⁻¹ 피크는 NH₂ 피크. MSN 내 로드된 Dox 클러스터 염기 C=O 결합 신장 특성 피크로 ~1700cm⁻¹ 피크 고려. 1650cm⁻¹ 새 피크는 Sgc8이 NH2-MSN/Dox와 반응하여 생성된 시프 베이스(–C=N–) 때문. 이 증거들은 Sgc8-MSN/Dox 약물 전달 시스템 성공적 제조 입증. 압타머 변형 Sgc8-MSN/Dox 효율 검출 위해 자외선 분광광도계로 압타머 260nm 흡광도(OD) 측정, 나노입자 표면 압타머 변형 전후 OD 값 변화 기반 압타머 나노입자 변형 효율 계산. 압타머 용액과 상등액 자외선-가시광(UV-Vis) 스펙트럼 그림 3e 표시. 계산 결과 Sgc8 압타머의 Sgc8-MSN/Dox 변형량 약 6.87nmol mg^–1 Sgc8-MSN/Dox.

a XRD 및 b 질소 흡착-탈착 등온선 MSN; (삽도) MSN 기공 부피 및 기공 크기 분포 플롯

나노소재 특성 분석. a Sgc8-MSN/Dox 전자 현미경 사진. b 나노입자 전위도. 입자 크기 분포 c MSN/Dox 및 d Sgc8-MSN/Dox. e 나노소재 FT-IR 스펙트럼: a MSN, b MSN/Dox, c Sgc8-MSN/Dox. f UV-Vis 스펙트럼 a Sgc8 압타머 용액, b Sgc8-MSN/Dox 제조 과정 세척 상등액

Sgc8-MSN/Dox로부터 Dox 시험관 내 방출

MSN/Dox와 Sgc8-MSN/Dox는 pH 7.4에서 약물 화물을 느리게 방출: 96시간 내 50% 이하 약물 방출(그림 4). 이는 약물이 메조포러스 실리콘 내부 채널 전체에 퍼지기 때문으로 MSN이 96시간 지속 느린 약물 방출 지원 가능성 시사. pH 5.0에서 방출 훨씬 빨라 48시간 60%, 96시간 >80% 방출률 도달. Dox 방출 곡선은 Sgc8-MSN/Dox와 MSN/Dox 거의 동일, 압타머 연결이 나노입자 구조 영향 없음 시사. 산성 pH에서 더 큰 방출 유용: 종양 세포는 약산성 환경에 있고 Sgc8 코팅 나노입자는 엔도솜으로 내부화되기 때문[15]. 우리 결과는 메조포러스 실리콘이 산성 환경에서 약물 방출 가속 가능성 지지[21, 22].

pH 5.0 또는 7.4에서 Sgc8-MSN/Dox와 MSN/Dox로부터 독소루비신 시험관 내 방출

Sgc8-MSN/Dox에 의한 백혈병 세포 시험관 내 표적화

표적 세포 CEM T 림프구 백혈병 세포, 비표적 세포 라모스 B 림프종 세포로 나노입자 섭취 조사. 유세포 분석 기반, 비표적 세포는 MSN/Dox와 Sgc8-MSN/Dox 유사 정도 내부화, 반면 표적 세포는 압타머 코팅 나노입자 훨씬 더 많이 내부화(그림 5a). 일관되게 형광 공초점 현미경에서 Sgc8-MSN/Dox 처리 CEM 세포 내 강한 Dox 형광(빨강) 관찰, 동일 처리 라모스 세포에서는 미관찰(그림 5b). 이 결과들은 Sgc8 압타머 백혈병 세포 표적화 확립된 능력 반영[20]. Sgc8은 CEM 세포 표면 PTK-7 인식[18], 나노입자 표면 모집으로 섭취 효율 증대[23]. 우리 결과는 Sgc8-MSN/Dox가 원발 및 이차 부위 또는 순환계에서 PTK-7 발현 암세포 표적화 가능성 시사, 전이 제어에 유용. 다른 표적 특이성 압타머로 MSN 접근 확장 가능[24, 25].

Sgc8-MSN/Dox에 의한 백혈병 세포 시험관 내 표적화 분석: a 유세포 분석, b 형광 현미경. CCRF-CEM 및 라모스 세포 MSN/Dox 또는 Sgc8-MSN/Dox 배양 후 DAPI(파랑) 염색. Dox 적색 표시. 스케일 바, 100µm

MSN 세포독성

나노 약물 전달 시스템 생체안전성 중요성[25] 고려, 먼저 CEM, 라모스, 293T, L-02 세포에 대한 빈 MSN 독성 조사. 모든 세포주 생존율 100µg/mL MSN까지 48시간 배양 후 90% 이상 유지(그림 6). 이는 MSN이 거의 무시할 만한 세포독성 보임 시사.

MSN 시험관 내 세포독성. a CEM, b 라모스, c 293T, d L-02 세포가 표시된 MSN 농도 처리, 세포 생존율 측정

다음, 표적 종양 세포(CEM)와 비표적 세포(라모스, 293T, L-02)에 대한 Sgc8-MSN/Dox 사멸 능력 조사. 세포들을 자유 Dox, MSN/Dox, 또는 Sgc8-MSN/Dox 다양한 농도로 24시간 배양, MTT 분석법으로 생존율 평가. 표적 CEM 세포에 대해 자유 Dox가 두 MSN 제형보다 약간 더 큰 독성 보였으나, Sgc8-MSN/Dox가 동일 약물 농도에서 MSN/Dox보다 유의미하게 더 독성(그림 7). 라모스, 293T, L-02 세포에 대해 자유 Dox가 MSN 제형들보다 유의미하게 더 독성, Sgc8 유무와 관계없이 MSN 제형들 유사 독성. Sgc8-MSN/Dox가 압타머 수용체 PTK-7 통해 CEM 세포 표적 사멸하는지 추가 확인 위해, 먼저 충분한 Sgc8 압타머를 CEM 세포와 2시간 배양하여 결합 부위 차단, 이후 Sgc8-MSN/Dox 공동 배양. MTT 분석에서 자유 압타머는 CEM 세포 무독성, 충분한 Sgc8 압타머로 결합 부위 차단 후 Sgc8-MSN/Dox가 자유 Sgc8-MSN/Dox 그룹보다 유의미하게 낮은 독성 보임(그림 7e). 이 결과들은 약물 전달 표적화와 표적 세포 사멸 증진에 압타머 능력 강조. 이러한 표적화는 비표적 세포 약물 섭취 감소와 더 낮은 용량 사용 허용, 두 효과 모두 독성 부작용 위험 감소 도움[26].

자유 DOX, MSN/Dox, Sgc8-MSN/Dox 사멸 능력: a CEM 세포, b 라모스 세포, c 293T 세포, d L-02 세포. e CEM 세포 사멸 능력: 자유 압타머, 차단(CEM 세포 먼저 충분한 Sgc8 2시간 배양 후 sgc8-MSN/Dox 배양), Sgc8-MSN/Dox

압타머는 약물 및 다양한 거대분자나 나노캐리어 종양 세포 전달 위한 안내 분자로 사용 가능, 때때로 압타머 자체도 치료제로 작용 가능. 예: AS1411 압타머는 뉴클레올린 특이적 결합, 뉴클레올린은 세포 분화, 생존, 염증, 혈관신생, 종양 발달 관여 종양 세포 내 및 표면 발현. AS1411 압타머는 뉴클레올린 결합으로 이종이식 모델(신장암, 폐암, MX1 유방암, 췌장암) 성장 억제 유도[27]. 게다가 AS1411 압타머 기능화 독소루비신 탑재 리포좀(Apt-Dox-Lip)이 유방암에서 시험, 큰 응용 잠재력 보임[28]. 압타머는 우수한 특성으로 광범위한 임상시험 성공. 최초 압타머 2005년 FDA 승인[29], 이후 점점 더 많은 압타머 임상시험 진입. 압타머는 전립선암[30], 폐암[31], 급성 골수성 백혈병[32] 등 항종양 임상시험 적용. 이 압타머 관련 임상시험들은 기존 치료 스타일 변화 새 희망 제공 의심 없음.

최근 몇 년간 압타머가 다양한 나노소재와 결합되어 종양 표적 치료에 활용. 압타머가 비범한 분자 인식과 표적화 능력 가짐 명백. 그러나 압타머 응용 개발에서 무시할 수 없는 문제들 남아: 뉴클레아제가 체내 압타머 안정성 영향 여부, 소분자 물질 압타머가 체내 진입 시 신장 시스템에 의해 빠르게 제거되는지, 실제 체내 표적화 성능 실현 가능 여부. 압타머 기반 표적 나노소재 완전 잠재력 활용 위해 더 많은 체내 시험과 임상 관련 실험이 현재 연구 초점. 동시에 종양 테라노스틱스는 미래 개발 중요 방향, 더 다기능 생물 기능성 소재 설계와 제조가 의심 없는 발전 트렌드.

결론

우리는 백혈병 세포를 효율적으로 표적화하고 Dox 섭취를 촉진하는 압타머 변형 MSN 전달 시스템을 구축했습니다. 이 표적화는 MSN의 느리고 산성 조건 하 선호적 약물 화물 방출 능력과 결합되어 전달 시스템이 종양 부위에 축적되어 세포를 지속적으로 사멸시키는 데 도움될 수 있습니다. 적절한 압타머 선택으로 거의 모든 유형 종양 세포 표적화 가능할 수 있음. 하지만 위에서 언급한 문제들 Sgc8-MSN/Dox에도 있을 수 있으며, 체내 안정성과 표적화 추가 연구 필요. 다음에는 이전 연구 결합하여 약물 전달 시스템에 진단 시약과 약물 모두 탑재, 표적 진단과 표적 치료의 테라노스틱 기능 부여 예정.

약어

MSN:

메조포러스 실리카 나노입자

Dox:

독소루비신

Sgc8-MSN/Dox:

압타머 변형 메조포러스 실리카 약물 전달 시스템

PTK-7:

단백질 티로신 키나아제-7

TEOS:

테트라에틸 오르토실리케이트

APTES:

3-트리에톡시실릴프로필아민

CTAB:

세틸-트리메틸암모늄 브로마이드

CEM:

CCRF-CEM 세포

PBS:

인산염 완충 염수