Nec-1이 RIP1 조절을 통해 SH-SY5Y 세포에서 이산화 티타늄 나노입자 유도 신경독성 완화

초록

이산화 티타늄 나노물질은 우수한 물리화학적 특성으로 수많은 분야에 적용되며, 이는 잠재적으로 인간 건강을 위협합니다. 최근 체내 연구에서 이산화 티타늄 나노입자(TNPs)가 다양한 노출 경로로 동물 뇌로 운반될 수 있음이 밝혀졌습니다. 흡수된 TNPs는 뇌에 축적되어 신경세포를 교란하고 뇌 기능 장애를 초래할 수 있습니다. 체외 연구는 TNPs 신경독성을 검증했습니다. TNPs 신경독성 기전은 불분명합니다. 괴사성 세포사멸(네크롭토시스)이 TNPs 신경독성에 관여하는지 알려지지 않았습니다. 따라서 체외 연구를 수행하여 TNPs가 SH-SY5Y 세포에서 용량 의존적으로 염증 손상을 유도하며, 이는 네크로스타틴-1(Nec-1) 사전 처리로 완화됨을 발견했습니다. 수용체 상호작용 단백질 키나제 1(RIP1)이 Nec-1 표적으로 보고되어 siRNA로 침묵시켰습니다. 돌연변이 및 야생형 세포를 TNPs에 노출시키고 염증 손상을 평가했습니다. RIP1 발현 침묵은 TNPs 노출 유도 염증 손상을 억제했습니다. 종합하면 Nec-1은 RIP1을 통해 TNPs 신경독성을 완화합니다. 그러나 TNPs 신경독성과 RIP1 간 상관관계를 포괄적으로 평가하기 위해 더 많은 연구가 필요합니다.

서론

뛰어난 물리화학적 특성으로 이산화 티타늄 나노물질이 합성되어 화장품, 산업 분야, 의료 분야 등 다양한 목적으로 널리 사용됩니다. 그러나 이러한 광범위한 사용은 인간 건강에 큰 위협이 될 수 있습니다. 노출 시 대부분 TNPs가 흡입과 섭취로 인체에 진입합니다. 호흡기, 소화기, 심혈관계 모두 흡수된 TNPs에 의해 교란될 수 있습니다. 마찬가지로 중추신경계에서 가장 중요한 뇌도 교란될 수 있습니다. 순환 TNPs가 혈액-뇌 장벽을 관통할 수 있고, 흡입된 NPs가 후각 경로로 뇌로 운반될 수 있기 때문입니다. 한번 TNPs가 뇌에 진입하면 축적되어 뇌 손상을 일으키고 기능 장애를 초래할 수 있습니다. 뇌 손상은 보통 비가역적이고 심각하므로 잠재적 손상 원인은 조사되어야 합니다.

TNPs 노출과 뇌 질환 간 연관성을 탐구한 역학 연구는 없지만, 다수 체내 및 체외 연구가 TNPs 신경독성을 확인했습니다. 또한 기저 메커니즘 규명 연구가 주요 초점이었습니다. 이를 위해 이전에 알려진 TNPs 신경독성 분자 메커니즘을 검토했으며, 아포토시스와 자가포식 같은 프로그램된 세포사멸(PCD) 과정이 TNPs 신경독성에 연루됨을 발견했습니다.

네크롭토시스는 조절된 괴사로도 불리는 또 다른 PCD 유형입니다. 아포토시스가 카스파제 의존적인 반면, 네크롭토시스는 수용체 상호작용 단백질 키나제 1/3(RIP1/RIP3) 의존적입니다. 활성화된 RIP1이 RIP3을 모집하여 네크로소좀을 형성하고, 혼합 혈통 키나제 도메인 유사 단백질(MLKL)을 활성화하여 네크롭토시스를 개시합니다. 네크롭토시스는 세포사멸과 신경염증을 조절할 수 있으며, 이는 모두 TNPs 신경독성에 관여합니다. 따라서 네크롭토시스가 TNPs 유발 신경독성에 관여한다고 가설했습니다.

가설 검증을 위해 체외 연구를 수행하여 TNPs 신경독성에서 네크롭토시스 역할을 탐구했습니다. 본 연구에서 TNPs 노출 후 세포 생존율, LDH 누출, 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8)을 측정했습니다. 첫째, SH-SY5Y 세포를 다양한 농도 TNPs로 배양했습니다. 둘째, 네크롭토시스 강력한 억제제인 Nec-1 유무 하에 세포를 TNPs에 노출시켰습니다. 셋째, Nec-1로 억제될 수 있는 RIP1 유전자 발현을 siRNA로 침묵시킨 후 돌연변이 및 야생형 세포를 TNPs로 처리했습니다. 이 연구는 TNPs 신경독성 기저 분자 메커니즘 포괄적 이해에 기여합니다.

결과

TNPs 세포 생존율 억제

SH-SY5Y 세포에서 TNPs 세포독성 검증을 위해 CCK8 분석으로 세포 생존율을 먼저 평가했습니다. 세포를 5-160μg/mL TNPs 농도 범위에서 24, 48, 72시간 배양했습니다. 그림 1에서 24시간 노출 후 5, 10, 20, 40μg/mL 처리 세포 생존율은 변화 없었습니다. 48, 72시간 배양 시 5μg/mL군에서만 생존율 변화 없었습니다(p=0.4507 at 48h, p=0.1002 at 72h). 또한 80μg/mL TNPs 처리 세포에서 48시간(p=0.0007), 72시간(p=0.0008) 후 생존율이 극적으로 낮았습니다. 이 결과로 TNPs가 용량 및 시간 의존적으로 세포 생존율을 감소시킴을 결론지었으며, 장기 노출이 더 독성임을 나타냅니다.

TNPs 세포막 완전성 손상

다음으로 72시간 노출 후 TNPs 막 완전성 독성 효과를 분석했습니다. 막 완전성은 LDH 누출 측정으로 평가했습니다. 그림 1b에서 5μg/mL 이상 TNPs 처리 세포에서 LDH 수준이 유의하게 증가했습니다. 40, 80, 160μg/mL 처리 세포에서 LDH 생성 증가 관찰(p<0.0001). 이 결과는 TNPs가 CCK8 분석과 유사하게 용량 의존적으로 LDH 수준을 증가시킴을 시사합니다.

TNPs 노출 염증 촉진

TNPs 노출 후 염증 반응을 ELISA로 분석했습니다. 세포를 다양한 TNPs 농도로 72시간 처리 후 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 수준을 측정했습니다. 그림 2에서 IL-8 분비는 모든 TNPs 처리 세포에서 상향 조절되었습니다. TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 수준은 5μg/mL 이상 처리 세포에서 균일하게 상승했습니다(p<0.01). 또한 10μg/mL 이상 군에서 염증이 유의하게 더 높았습니다(p<0.0001). 종합적으로 TNPs가 용량 의존적으로 염증을 증진시킴을 확인했습니다.

우리 결과는 TNPs가 용량 의존적으로 염증 손상을 유도함을 나타냈습니다. 후속 실험에서 네크롭토시스 역할을 탐구하기 위해 80μg/mL TNPs 농도와 72시간 노출 기간을 채택했습니다.

Nec-1 병용 처리가 TNPs 신경독성 억제

염증 손상에서 네크롭토시스 역할 분석을 위해 세포를 Nec-1(네크롭토시스 억제제)과 TNPs로 병용 처리했습니다. 그림 3a에서 SH-SY5Y 세포를 TNPs 또는 TNPs+Nec-1(1, 5, 10, 15, 20μM)에 노출시켰으며, Nec-1이 TNPs 유도 세포 생존율 감소를 극적으로 완화함을 발견했습니다(10, 15, 20μM, p<0.0001). 15μM 및 20μM 처리군 세포 생존율이 10μM군보다 높지 않았습니다(p=0.6643, p=0.6292). 따라서 10μM Nec-1로 병용 처리하여 막 완전성 효과를 분석했습니다.

TNPs 또는 TNPs+Nec-1로 배양 후 TNPs+Nec-1군 LDH 수준이 TNPs 단독군보다 훨씬 낮았습니다(p=0.0005). 또한 Nec-1 단독 처리는 LDH 누출을 증가시키지 않았습니다(p=0.9878). 결론적으로 10μM Nec-1이 TNPs 세포독성을 효과적으로 억제하며 세포에 독성이 없음을 확인했습니다.

Nec-1 항염증 능력 분석을 위해 세포를 TNPs 또는 TNPs+Nec-1로 배양했습니다. 그림 4에서 TNF-α(p=0.003), IL-1β(p=0.0013), IL-6(p<0.0001), IL-8(p=0.0004) 생성이 TNPs+Nec-1군에서 TNPs군보다 유의하게 낮았습니다. 이 결과는 Nec-1이 TNPs 노출 유도 염증 반응을 완화할 수 있음을 시사합니다.

RIP1 침묵이 TNPs 유도 염증 손상 완화

Nec-1이 RIP1을 통해 TNPs 유도 염증 손상을 차단하는지 확인하기 위해 siRNA로 세포 RIP1 발현을 효과적으로 침묵시켰습니다(그림 5, p<0.0001). 다음으로 돌연변이 및 야생형 세포에서 TNPs 노출 후 염증 손상을 측정했습니다. 그림 6a에서 TNPs+si-RIP1군 세포 생존율이 TNPs+si-NC군보다 현저히 높았습니다(p=0.0002). LDH 생성(그림 6b, p<0.0001)과 TNF-α(p<0.0001), IL-1β(p=0.0001), IL-6(p<0.0001), IL-8(p=0.0001) 수준(그림 7)이 TNPs+si-RIP1군에서 TNPs+si-NC군보다 극적으로 낮았습니다. 이 결과는 TNPs가 RIP1을 통해 염증 손상을 촉진함을 나타냅니다.

고찰

본 연구에서 TNPs 노출이 SH-SY5Y 세포에 용량 의존적으로 세포독성을 유도하며 네크롭토시스가 TNPs 신경독성에 관여함을 발견했습니다. 네크롭토시스 역할 탐구를 위해 세포를 TNPs에 Nec-1 유무 하에 노출시키고 세포 생존율, LDH 누출, 염증성 사이토카인 수준을 측정했습니다. 데이터는 Nec-1 병용 처리가 TNPs 유도 염증 손상을 완화할 수 있음을 시사합니다. 연구에 따르면 Nec-1이 RIP1 활성 억제로 효과를 나타내므로, 세포를 si-RIP1로 형질주입하여 RIP1이 Nec-1 보호 효과에 관여하는지 확인했습니다. 돌연변이 및 야생형 세포를 TNPs로 처리하고 염증 손상을 평가했습니다. 이는 si-RIP1군 세포 생존율이 si-NC군보다 높고, TNPs 노출 후 LDH 누출과 염증성 사이토카인 수준이 si-RIP1군에서 si-NC군보다 낮음을 나타냈습니다. 결론적으로 본 연구는 네크롭토시스가 TNPs 유도 세포 염증 손상에 관여함을 최초로 밝혔습니다.

체외 연구에서 TNPs 신경독성을 재확인했습니다. SH-SY5Y 세포를 다양한 TNPs 농도와 배양 시간 노출 후 CCK8 분석으로 세포 생존율을 평가했습니다. 그림 1a에서 TNPs 노출이 용량 의존적으로 세포 생존율을 감소시켰으며, 48, 72시간 노출 후 80, 160μg/mL TNPs군에서 대조군 대비 생존율이 극적으로 감소했습니다(p<0.001). 세포독성 추가 확인을 위해 LDH 누출도 측정했습니다. 그림 1b 데이터에서 72시간 노출 후 LDH 생성이 용량 의존적으로 증가했으며, 40, 80, 160군 LDH 수준이 대조군보다 현저히 높았습니다(p<0.0001). 이전 연구에서 TNPs 노출로 신경염증 촉진 가능함이 밝혀져 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 수준도 측정했습니다. 그림 2에서 네 염증성 사이토카인 수준이 대조군 대비 유의하게 상향 조절되었으며, 20-160μg/mL 군에서 극적으로 높았습니다(p<0.0001). 종합적으로 TNPs가 용량 의존적으로 신경독성을 유도할 수 있음을 나타내며, 이는 이전 연구와 일치합니다. TNPs가 신경세포에 흡수되어 증식 억제, 세포 생존율 감소, LDH 누출 촉진을 용량 의존적으로 유도할 수 있습니다.

네크롭토시스가 TNPs 유발 신경독성에 관여하는지 명확히 하기 위해 세포를 Nec-1로 병용 처리했습니다. 지정된 TNPs 농도와 Nec-1 유무 하에 처리 후 세포 생존율, LDH 누출, 염증을 평가했습니다. 그림 3a에서 TNPs 노출 후 생존율 감소가 10μM Nec-1 병용 처리로 유의하게 억제되었습니다. 한편 그림 3b에서 10μM Nec-1 처리는 LDH 수준을 증가시키지 않았고, TNPs+Nec-1군 LDH 수준이 TNPs 단독군보다 극적으로 낮았습니다. 다음으로 Nec-1 병용 처리가 TNPs 유도 염증에 미치는 효과를 측정했습니다. 그림 4에서 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 수준이 TNPs+Nec-1 처리 세포에서 현저히 낮았습니다. 이 결과는 Nec-1이 세포사멸과 염증 과정에서 세포를 보호할 수 있음을 재검증했습니다.

마지막으로 RIP1이 Nec-1 표적이므로 RIP1이 TNPs 신경독성을 조절할 수 있는지 평가했습니다. RIP1 발현 침묵으로 돌연변이 세포를 구축했습니다(그림 5). 그림 6, 7 데이터에서 TNPs 노출 후 si-RIP1군에서 세포 생존율이 높고, LDH, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 수준이 si-NC군보다 낮았으며, 이는 TNPs가 RIP1을 통해 세포독성을 촉진함을 시사합니다. 마찬가지로 여러 연구에서 RIP1이 세포사멸과 염증 과정 모두 조절할 수 있음을 밝혔습니다.

본 연구는 Nec-1이 네크롭토시스 신호 경로 억제로 TNPs 신경독성을 완화할 수 있음을 최초로 보고했으나 몇 가지 한계가 있습니다. 첫째, 나노크기 물질 세포독성은 벌크 물질과 다를 수 있으며 표면 특성에 크게 영향을 받을 수 있습니다. 이는 Sebastián 등에서 발견된 세포 생존율 증가라는 상반된 결과를 설명할 수 있습니다. 따라서 세포 증식, 막 완전성, 산화 스트레스, 염증, 미토콘드리아 기능, 세포 주기, 세포골격, 후성유전학 등 다각도에서 나노독성을 포괄적으로 평가하는 것이 필수적입니다. 둘째, RIP1이 RIP3을 모집하여 기능적 네크로소좀을 형성하고, MLKL 활성화로 네크롭토시스를 개시합니다. RIP3/MLKL이 TNPs 신경독성에 관여할 수 있다고 가정하며, 이는 향후 연구에서 탐구되어야 합니다. 또한 RIP3/MLKL과 TNPs 신경독성 연관성도 평가되어야 합니다. 셋째, 반응성 산소종(ROS)은 TNPs 신경독성 주요 기전으로 보고되었으며 RIP1 상위 신호로 보고되었습니다. 따라서 TNPs 신경독성에서 ROS가 RIP1 상위인지 추가 논의가 필요합니다. 넷째, 비독성 농도(TNPs<5μg/mL)에서 장기간(72시간 이상) 노출하여 만성 세포독성 평가 필요. 다섯째, 더 많은 신경세포주와 인간/동물 일차 신경세포에서 네크롭토시스 역할 평가 필요.

결론

본 연구는 TNPs 유발 신경독성에 관여하는 또 다른 프로그램된 세포사멸 메커니즘으로 네크롭토시스를 밝혔습니다. TNPs가 SH-SY5Y 세포에서 용량 의존적으로 염증 손상을 유도하며, 네크롭토시스 강력한 억제제인 Nec-1 병용 처리가 이러한 유해 효과를 완화할 수 있음을 발견했습니다. Nec-1 표적인 RIP1을 siRNA로 침묵시켰으며, 이는 TNPs 노출 유도 염증 손상을 효과적으로 완화했습니다. 결론적으로 Nec-1은 RIP1 경로 표적화로 TNPs 노출 유도 SH-SY5Y 세포 염증 손상을 억제합니다. TNPs 신경독성에 관여하는 RIP1 상위 및 하위 신호 경로는 추가 평가되어야 합니다.

재료 및 방법

TNPs 제조 및 세포 배양

이전에 발표된 절차에 따라 TNPs를 특성화하고 제조했습니다. 간단히, TNPs를 RPMI 1640에 5, 10, 20, 40, 80, 160μg/mL 다양한 농도로 녹였습니다. TNP 용액을 멸균하고 실온에서 초음파 처리(300W, 10분)하여 처리 전 입자 응집을 방지했습니다. TNPs 미노출 배양 배지 세포를 대조군으로 했습니다. SH-SY5Y 세포는 중국과학원 상하이생명과학연구소 세포은행에서 구입했으며, 10% 태아우혈청, 100U/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신 함유 RPMI 1640 배지(HyClone)에서 37°C, 5% CO₂, 가습 인큐베이터 조건으로 배양했습니다.

세포 생존율 및 LDH 누출 분석

세포 생존율은 세포 계수 키트-8(CCK8, Dojindo)로 측정했습니다. 간단히, 1×10⁴ SH-SY5Y 세포를 96웰 플레이트에 놓고 37°C(5% CO₂) 인큐베이터에서 24시간 배양 후 TNPs 노출했습니다. 세포를 다양한 농도(0, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80μg/mL) TNPs로 추가 24시간 배양했습니다. 처리 후 CCK-8로 추가 2시간 배양했습니다. 96웰 플레이트를 마이크로플레이트 리더(BioTek)에 넣어 450nm에서 광학 밀도(OD) 측정했습니다. 각 군 세포 생존율 백분율은 (OD처리-OD블랭크)/(OD대조-OD블랭크)×100%로 계산했습니다.

막 완전성은 상용 키트(남경건성생물공정연구소)로 측정했습니다. SH-SY5Y 세포를 다양한 TNPs 농도 72시간 노출 후 제조사 지침에 따라 LDH 분비 분석했습니다.

염증 반응

ELISA로 SH-SY5Y 세포 생성 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 수준 측정했습니다. 간단히, SH-SY5Y 세포를 TNPs 72시간 노출 후 상청액 수집하여 제조사 지침(Elabscience Biotechnology)에 따라 분석했습니다.

siRNA 형질주입

제조사 프로토콜에 따라 100nM 농도 si-RIP1 또는 음성 대조 siRNA(si-NC)를 Lipofectamine 2000으로 세포에 형질주입했습니다. siRNA 유전자 침묵 효율은 실시간 PCR로 추정했습니다.

실시간 PCR

다양한 TNPs 농도 노출 세포 RNA를 RNAqueous 키트(Ambion Inc.)로 제조사 지침에 따라 분리했습니다. RIP1 상대 발현을 실시간 PCR로 측정했습니다. RIP1 상대 mRNA 수준을 β-actin 발현으로 정규화했습니다.

통계 분석

SPSS 11.0 소프트웨어(SPSS Inc.)로 데이터 분석했습니다. 일원분산분석으로 군 평균 비교했습니다. p<0.05 통계적 유의성으로 간주했습니다.