티타늄과 티타늄 합금은 정형외과 임플란트로 널리 사용됩니다. 나노위상 구조 수정은 티타늄 기판의 골융합을 개선하기 위한 새로운 전략을 제공합니다. 필라멘터스 액틴(F-액틴) 중합은 기계적 하중 구조로서 일반적으로 세포 이동, 내포작용, 세포 분열, 세포 모양 유지에 관여하는 것으로 알려져 있습니다. F-액틴이 나노튜브 유도 중간엽 줄기세포(MSC) 골분화에 관여하는지, 만약 그렇다면 어떻게 기능하는지는 아직 규명되어야 합니다. 본 연구에서는 양극 산화로 티타늄 기판 표면에 TiO₂ 나노튜브를 제조하고 주사 전자 현미경(SEM), X선 에너지 분산 분석(EDS), 원자 힘 현미경(AFM)으로 특성을 분석했습니다. 알칼리 인산분해효소(ALP) 염색, 웨스턴 블로팅, qRT-PCR, 면역형광 염색을 수행하여 골분화 잠재력, F-액틴 수준, MKL1과 YAP/TAZ 발현을 탐구했습니다. 연구 결과 양극 산화 전압이 30V에서 70V로 증가함에 따라 TiO₂ 나노튜브 내경과 조도가 증가했으며, 높이는 일관되게 2 μm였습니다. 또한 튜브 직경이 클수록 TiO₂ 나노튜브의 MSC 골분화 촉진 능력이 강해졌습니다. 사이토칼라신 D(Cyto D)로 F-액틴 중합을 억제하면 MSC 골분화뿐만 아니라 빈큘린(VCL)과 초점 접착 키나아제(FAK) 등 초점 접착 복합체 단백질 발현도 억제되었습니다. 반면 야스플라키놀라이드(Jasp) 처리 후 F-액틴 중합이 강화되면 RhoA와 전사 인자 YAP/TAZ 발현이 증가했습니다. 이러한 데이터를 바탕으로 TiO₂ 나노튜브가 MSC 골분화를 촉진하며, 이 능력은 나노튜브 직경 증가에 따라 일정 범위(30-70V) 내에서 강화됨을 결론지었습니다. F-액틴이 MKL1과 YAP/TAZ를 통해 이 과정을 매개합니다.
티타늄과 티타늄 합금은 우수한 생체적합성, 내식성, 기계적 특성으로 인해 전체 관절 치환술과 치과 임플란트 등 임상 응용에 널리 사용됩니다[1-3]. 그러나 무균성 이완과 감염 등 해결해야 할 과제들이 여전히 남아 있습니다[4,5]. 최근 골융합과 항균 특성 향상을 목표로 한 수많은 연구가 수행되었습니다. 예를 들어 티타늄 임플란트 상 MoS₂/PDA-RGD 코팅은 티타늄 임플란트와 숙주 골 통합을 촉진할 뿐만 아니라 높은 효율로 세균 증식을 억제합니다[6]. 또한 표면 위상 구조가 점점 더 주목받고 있으며, 위상 수정은 미세 및 나노스케일 구조만 변경하여 화학적 수정과 다릅니다. 세포에 대한 화학적 신호 자극은 불안정하고 세포독성이 있습니다. 비교하면 안전하고 제어 가능한 물리적 신호는 화학 분자로 인한 일부 부작용을 피할 수 있습니다. 따라서 임플란트 표면 위상 수정과 위상 구조를 통한 골융합 조절은 보철물 이식 후 골융합 불량이라는 임상 문제를 해결하는 새로운 방법을 제공할 수 있습니다.
골 조직 공학과 골 재생 분야에서 세포-형태 상호작용은 종자 세포 기능과 분화의 정밀 제어를 위한 유망한 관리 전략으로 간주됩니다. 동시에 뼈 자체는 나노미터와 미크론 범위 내 우아한 위계를 가집니다[7]. 따라서 표면 형태는 자연 골 구조를 모방하는 유사한 틈새를 제공하여 숙주 골과 임플란트 표면에서 MSC 골분화를 촉진할 수 있습니다. 표면 형태는 나노튜브, 나노와이어, 나노기공 등 다양한 구조로 구성될 수 있습니다. 특히 나노튜브 어레이는 높은 표면적-부피 비율, 생물학적 가소성, 높은 흡착 용량 등 독특한 표면 특성으로 최근 많은 분야에서 광범위한 관심을 끌고 있습니다. 예를 들어 새로운 연구는 질화 붕소 나노튜브(BNNT)가 기체 감지 물질로 구성되어 변압기 오일 내 용존 기체 조성과 함량 검출로 변압기 작동 모니터링용 기체 센서로 사용될 수 있음을 보여줍니다[8]. 생물의학 분야에서도 표면 위상 구조는 세포 이동, 부착, 증식, 분화 등 세포 거동을 유도할 수 있습니다. 최신 연구들은 나노스케일 위상이 MSC를 골아세포로 분화시켜 초기 골융합을 강화할 수 있음을 밝혀냈습니다[9-12]. 심지어 미세 및 나노스케일 복합 표면 수정이 MSC를 수축성 평활근 세포로 분화시킬 수 있다는 보고도 있습니다[13]. 그러나 표면 위상이 세포 운명을 유도하는 분자 메커니즘은 아직 규명되어야 하며, 이는 물질 안전성 평가와 물질 설계에 중요합니다.
필라멘터스(F)-액틴은 마이크로필라멘트라고도 하며 진핵세포 골격 세 주요 구성요소 중 하나입니다. 구형(G)-액틴 중합체로 구성되며 수많은 다른 단백질에 의해 수정됩니다. F-액틴은 모든 마이크로필라멘트 소단위가 같은 끝을 향하기 때문에 구조적 극성을 가집니다. 빗살 끝은 다른 인접 단량체를 향하는 반면 뾰족한 끝은 ATP 결합 부위가 노출된 액틴 소단위를 가집니다. 즉, ATP가 G-액틴과 F-액틴 간 전환 과정에 관여합니다. 이 과정은 중합과 탈중합이 동시에 발생하는 동적 평형 상태에 있으며, 트레드밀링이라고도 하며 람엘리포디아와 필로포디아에서 자주 관찰됩니다[14]. 따라서 액틴 역학이 세포 이동, 세포 분열, 세포 모양 유지 등 세포 기능에 중요한 역할을 함이 명백합니다. 그러나 F-액틴은 기계적 하중을 지지하는 물리적 구조일 뿐만 아니라 신호 전달과 유전자 발현 등 다른 생물학적 거동에도 참여합니다. 축적된 증거는 F-액틴이 다른 단백질과 상호작용하여 물리적 신호를 화학적 신호로 변환할 수 있음을 보여줍니다[15-18]. 예를 들어 생체역학적 및 기하학적 재구성이 액틴 단량체 중합을 F-액틴으로 방지하여 종양 세포 아폽토시스를 촉진합니다[15]. 초음파 펄스는 F-액틴 탈중합 억제로 인간 중간엽 줄기세포 골생성을 강화합니다[16]. 이전 연구에서도 기계적 변형이 F-액틴 안정성을 증가시킴을 보였습니다[17]. 나노튜브 중공 구조가 세포 부착 부위를 적게 제공하므로 생체역학적 균형 유지를 위해 골격 재배열이 불가피합니다. 따라서 F-액틴이 나노위상 유도 세포 분화를 매개할 가능성이 충분합니다.
본 연구에서는 양극 산화로 TiO₂ 나노튜브를 제조하고 위상을 수정하여 MSC 골분화 촉진 능력을 탐구했습니다. 다음으로 F-액틴이 기계전달에서 중요한 역할을 하는지 조사했습니다. F-액틴 빗살 끝에 경쟁적으로 결합하여 G-액틴 필라멘트 편입을 방지하는 사이토칼라신 D(Cyto D)로 F-액틴 중합을 억제하고, 야스플라키놀라이드(Jasp)로 액틴 조립 안정화를 강화했습니다. 또한 F-액틴이 물리적 신호를 생화학적 신호로 변경하는 메커니즘을 규명하고자 했습니다. 이전 연구 결과를 바탕으로 MAPK 경로가 이 과정에 관여할 수 있다고 가설했습니다[17]. 예스 연관 단백질(YAP)/PDZ 결합 모티프 전사 공동활성화인자(TAZ)와 MKL1 같은 전사 인자들은 기계수용체와 기계전달자로 간주되어 F-액틴이 줄기세포 운명에 미치는 영향을 선별하는 연구 대상이었습니다. 다른 분야 연구들에서 이들이 F-액틴과 관련됨이 시사되었기 때문입니다[19-21]. 일반적으로 나노튜브 유도 줄기세포 분화에서 F-액틴 역할을 명확히 하여 나노튜브로 수정된 임플란트 물질 설계와 생물안전성 평가에 지침을 제공하고자 합니다.
순수 티타늄 슬라이스(99.9% 순도, 2 mm 두께; 성시다, 허베이, 중국)를 기판으로 사용했으며, 400번과 1500번 실리콘 카바이드 사포로 연마했습니다. 시료를 아세톤, 무수 알코올, 탈염수로 초음파 세척기에서 순차 세척한 후 실온에서 3시간 건조했습니다. 나노위상 제조를 위해 전처리된 시료를 양극으로 고정하고, 백금 조각을 대극 음극으로 하여 0.15 M NH₄F와 90% 글리콜 수용액 전해질에서 1시간 양극 산화했습니다. 양극 산화 전압은 30, 40, 50, 60, 70 V 정전압이었습니다. 양극 산화 후 모든 시료를 탈염수로 30분, 무수 알코올로 초음파 세척기에서 15분 세척했습니다. 마지막으로 모든 시료를 120 °C 고압멸균기에서 1시간 멸균한 후 배양액으로 적셔 사용했습니다.
나노튜브 제조 반응 메커니즘은 명확하지 않으며, 현재 주류 이론은 전기장 증진 용해 이론입니다. 나노튜브 어레이 형성은 전기장 산화, 전기장 용해, 화학적 용해 작용 하 동적 평형 결과입니다(그림 1b). 양극 산화 과정은 다음과 같이 기술됩니다: 첫 단계에서 전해질-금속 계면에 산화 차단층 형성:
$$ \mathrm{Ti}^{4+} + 2\mathrm{H}_2\mathrm{O} \to \mathrm{TiO}_2 + 4\mathrm{H}^+ $$ (1)a 양극 산화 및 세포 분화 유도 흐름도. b 전처리된 티타늄 기판을 0.15 M NH₄F와 90% 글리콜 수용액 전해질에서 정전압 1시간 양극으로 고정. 자기조립 나노튜브가 균일하게 형성될 것으로 예측. 반응 메커니즘은 재료 및 방법에 기술. c 나노튜브 유도 줄기세포 골분화 메커니즘 개략도
그 후 전기장 증진 산화층 용해로 표면에 균열과 좁은 틈이 나타납니다. F⁻ 이온이 이 균열과 틈으로 확산되어 용해 속도 증가. 균열 확대 및 인접 균열과 연결. 결국 산화 티타늄층 형성 속도와 용해 속도 동적 평형 도달로 나노튜브 성장 정지:
$$ \mathrm{TiO}_2 + 6\mathrm{F}^- + 4\mathrm{H}^+ \to [\mathrm{TiF}_6]^{2-} + 2\mathrm{H}_2\mathrm{O} $$ (2)다른 전압(30, 40, 50, 60, 70 V)으로 제조된 시료를 에탄올과 탈염수로 15분 세척 후 실온 건조. 주사 전자 현미경(SEM450, FEI Nova Nano SEM; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)으로 표면 구조 특성화하고 금 박막 코팅 후 나노튜브 내경과 높이 측정. 동시에 X선 에너지 분산 분석(EDS)으로 나노튜브 원소 조성 분석. 원자 힘 현미경(AFM, NanoManVS, Bruker Nano Surfaces, Bruker MicroCT, Kontich, Belgium)으로 표면 형태와 조도 조사. 각 시료에서 세 영역 선택해 측정 3회 반복.
4주령 수컷 Sprague-Dawley(SD) 쥐를 상하이 제9인민병원 실험동물센터(상하이, 중국)에서 구입. 쥐 대퇴골과 경골에서 쥐 골수 유래 중간엽 줄기세포(BMSC) 무균 분리. BMSC를 α-최소 필수 배지(α-MEM; Hyclone, Logan, UT, USA)에 10%(v/v) 태아 소 혈청(FBS)(Gibco/Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), 100 mg/mL 스트렙토마이신(Gibco), 100 U/mL 페니실린(Gibco) 첨가하여 37°C, 95% 공기 5% CO₂ 가습 분위기에서 배양. 배양액 2일마다 교체, 80% 융합 시 트립신 처리 후 계대 배양. 본 연구 사용 세포 모두 3-5세대. 골유도 배지는 성장 배지에 100 nM 덱사메타손, 10 mM β-글리세로인산, 50 mM 아스코르브산(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 보충으로 구성.
TiO₂ 나노튜브 수정 티타늄 슬라이스를 원형으로 잘라 24웰 세포 배양판 웰에 배치. 3-5세대 BMSC를 3×10⁴ cells/disc 밀도로 성장 배지 또는 골유도 배지에서 TiO₂ 나노튜브 상 배양. 2일 배양 후 사이토칼라신 D(Cyto D, Sigma-Aldrich)와 야스플라키놀라이드(Jasp, Sigma-Aldrich)를 매일 3일간 배지에 첨가하여 F-액틴 중합 교란. Cyto D와 Jasp 최종 농도와 작용 시간은 각각 5 μM, 1시간과 2 μM, 3시간. 시약 배양 후 배양액 교체. 세포 생존율과 증식은 Cell Counting Kit-8(CCK8) 분석(Dojindo, Kumamoto, 일본)으로 Cyto D 또는 Jasp 처리 12시간 후 평가. 세포를 10%(v/v) CCK8 용액으로 37°C, 5% CO₂ 세포 배양기에서 2시간 배양. 반응 혼합물 100 μL를 96웰 플레이트 웰로 이송하여 450 nm에서 포르마잔 염료 흡광도(OD) 측정(Multiscan UV-가시분광광도계, Safire2; TECAN, Mannedorf, 스위스). 또한 트립신으로 TiO₂ 나노튜브에서 BMSC 효소적 분리 후 트립판 블루(Sigma-Aldrich) 염색하여 자동 세포 계수기(AMQAX1000, Life Technologies)로 대략적 세포 수 계수.
BMSC를 5가지 다른 TiO₂ 나노튜브 수정 티타늄 슬라이스(30, 40, 50, 60, 70 V)에 웰당 3×10⁴ 밀도로 파종하고 골유도 배지에서 배양. 시약 첨가는 위와 동일. 7일 배양 후 TiO₂ 나노튜브 상 BMSC를 PBS로 3회 세척, 4% 파라포름알데히드 고정, 알칼리 인산분해효소(ALP) 키트 제조사 지침에 따른 ALP 작동 용액 배양(홍교, 상하이, 중국). PBS 세척 후 입체 현미경 관찰.
ALP 활성 분석을 위해 세포를 단백질분해효소와 인산분해효소 억제제 없는 RIPA 버퍼로 용해한 후 원심 분리 상등액을 ALP 분석 키트(Beyotime Biotechnology Institute, 장쑤, 중국) 프로토콜에 따라 분석. 활성은 해당 용해액 단백질 농도로 정규화.
Cyto D와 Jasp 처리 3일 후 BMSC를 4% 파라포름알데히드 실온 20분 고정 후 PBS 3회 세척. 0.3% Triton-X 100으로 30분 투과 후 PBS 3회 세척, 로다민-결합 팔로이딘으로 실온 1시간 암실 염색. PBS 세척 후 DAPI(Beyotime Biotechnology Institute) 10분 실온 대조 염색. 추가 PBS 3회 세척 후 유리 슬라이드 고정, 공초점 현미경 관찰.
단백질 발현 평가를 위해 TiO₂ 나노튜브 상 배양 BMSC를 트립신(Gibco) 수확. PBS 3회 세척 후 단백질분해효소와 인산분해효소 억제제 칵테일 보충 RIPA 버퍼로 얼음 위 30분 용해. 12,000×g, 4°C, 15분 원심분리 후 상등액 수거. BCA 단백질 분석 키트(Beyotime)로 제조사 지침 따라 상등액 총 단백질 농도 측정. 로딩 버퍼 첨가 후 95°C 15분 끓임. 웨스턴 블로팅 분석 위해 10 μL 단백질 시료를 12.5% SDS-PAGE 겔(EpiZyme Inc., Cambridge, MA, USA) 로딩, 120V 1시간 전기영동, 250mA 2시간 폴리비닐리덴디플루오라이드(PVDF) 막 전기전달. 막을 5-10% 무지방 탈지유 TBST로 실온 1시간 쉐이커 차단. 1차 항체 희석 버퍼(Beyotime) 희석 4°C 오버나이트 배양. TBST 3회 5분 세척 후 2차 항체(형광 결합) 희석 버퍼 희석 첨가, 실온 1시간 암실 배양. 단백질 밴드 이색 적외선 형광 이미징 시스템(Odyssey, LiCor Biosciences, Lincoln, NE, USA)으로 검출. 내부 참고 단백질 밴드 통일 시 막 스트리핑 후 다른 1차 항체로 재탐침, 동일 과정 반복. GAPDH 항체 내부 참고 단백질로 단백질 발현 정규화. 본 연구 사용 다른 1차 항체: 항-빈큘린(1:1000, Abcam, Cambridge, MA, USA), 항-FAK(1:1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), 항-Runx2(1:1000, Cell Signaling Technology), 항-RhoA(1:1000, Cell Signaling Technology), 항-F-액틴(1:500, Abcam), 항-Osx(1:500, Abcam), 항-pYAP(1:1000, Cell Signaling Technology). 2차 항체: 염소 항-마우스 IgG H&L(IRDye® 680RD, 1:5000, Abcam), 염소 항-토끼 IgG H&L(IRDye® 680RD, 1:5000, Abcam).
7일째 TiO₂ 나노튜브 상 골유도 배양 세포에서 런트 관련 전사 인자 2(Runx2), 오스테릭스(Osx), Alp, 오스테오칼신(OCN), RhoA, YAP, TAZ, 빈큘린(VCL), 초점 접착 키나아제(FAK), 거대핵구성 백혈병 1(MKL1) 유전자 발현 평가 위해 정량적 실시간 PCR 수행. Total RNA Kit(R6812-01HP, Omega Bio-Tek Inc., Norcross, GA, USA)로 세포 총 RNA 추출. RNA 시료 농도와 순도 260 nm 광학 밀도로 결정, A260/280 비율과 A260/230 비율 모두 1.8 초과 시료만 분석. qScript cDNA 합성 키트(Takara, 시가, 일본) 제조사 지침 따라 RNA 시료 cDNA 역전사. SYBR® Premix Ex Taq™(Takara) 사용 QuantStudio 6 Flex 실시간 PCR 시스템(Life Technologies)으로 정량적 실시간 PCR 수행. 하우스키핑 유전자 GAPDH 내부 참고로 사용. 비교 Ct(2^-ΔΔCt) 방법으로 데이터 분석, 대조군 대비 배수 변화로 표현. 사용 프라이머 서열 표 1에 나열.
별도 표시 없는 한 모든 데이터는 삼중 시료 사용 최소 3회 독립 실험 대표값. 데이터 평균 ± 표준편차(SD) 표현. 그룹 간 차이 일원분산분석 후 Student-Newman-Keuls 사후검정 또는 Student t-검정 평가. P<0.05 통계적 유의성.
나노위상 제조를 위해 30, 40, 50, 60, 70 V 5가지 다른 정전압에서 1시간 양극 산화 장비로 순수 티타늄 기판 상 TiO₂ 나노튜브 형성(그림 1). 주사 전자 현미경(SEM)으로 균일 분포 자기조립 나노튜브 어레이 관찰. 나노튜브 측면도와 상단도가 그림 2a,b에 표시. 본 연구 모든 시료 나노튜브 높이는 약 2 μm로 일관된 반면, 내경은 30V 74 nm, 40V 92 nm, 50V 112 nm, 60V 128 nm, 70V 148 nm 약(그림 2c). 이는 나노튜브 높이가 양극 산화 시간 관련, 내경이 양극 산화 전압 관련됨을 시사. X선 에너지 분산 분석(EDS)으로 나노튜브 원소 조성 분석 결과 O와 Ti 두 원소만 구성(그림 2d,e). 원자 힘 현미경(AFM)으로 나노튜브 구조 검출, 프로파일 산술 평균 편차로 표면 조도(Ra) 측정(그림 2f). 데이터에서 나노튜브 표면 조도(Ra)가 직경 증가(즉 양극 산화 전압 증가)에 따라 증가함(그림 2g).
나노튜브 표면 특성 분석. a 측면도, 척도막대 1 μm. b 상단도, 척도막대 500 nm. c 5가지 정전압(30,40,50,60,70V) 나노튜브 내경. d 나노튜브 구조 EDS 화학 원소 조성. e Ti와 O 원소 비율. f 나노튜브 구조 AFM 이미지. g 나노튜브 평균 표면 조도(Ra)
7일 골유도 후 ALP 염색으로 MSC 골분화 평가. 염색 결과 TiO₂ 나노튜브 상 배양 MSC가 매끄러운 티타늄 기판(대조군) 세포보다 높은 ALP 활성 보임(그림 3a). 염색 면적 통계 분석 결과 나노튜브 골분화 유도 능력이 대조군 대비 유의하게 향상됨. 동시에 본 실험 직경 범위 내에서 TiO₂ 나노튜브 직경이 클수록 골분화 유도 능력이 강해지는 경향 관찰(그림 3b). 따라서 후속 실험에서 결과를 더 잘 나타내기 위해 70V 그룹 사용. 다음으로 3일째와 7일째 골유전자 발현 분석. TiO₂ 나노튜브 상 3일과 7일 배양 MSC 모두 대조군 대비 골유전자(RUNX2, ALP, OCN, OSX) 발현 유의적 촉진(그림 3d-g). 웨스턴 블로팅 결과 7일 골유도 후 RUNX2와 OSX 단백질 발현도 증가 확인(그림 3c). 흥미롭게도 TiO₂ 나노튜브 그룹에서 F-액틴 상향 조절 발견. 따라서 TiO₂ 나노튜브가 MSC를 골아세포 방향으로 유도하며, 이는 나노튜브 직경과 관련됨. 결과는 F-액틴이 이 과정에 관여함도 시사.
TiO₂ 나노튜브 BMSC 골유전자 발현 강화. a 매끄러운 티타늄 기판과 5가지 나노튜브 기판 ALP 염색. 세포 7일 골유도 배지 유도. b ImageJ로 염색 면적 통계 분석. c 7일째 웨스턴 블로팅으로 MSC 골생성 관련 단백질(RUNX2, OSX)과 F-액틴 분석. d-g qRT-PCR로 3일과 7일 RUNX2, ALP, OCN, OSX mRNA 발현. NT 나노튜브 그룹. 데이터 평균 ± SD(3개 시료). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001
F-액틴이 나노위상 유도 세포 분화 관여 여부 추가 탐구 위해 자스플라키놀라이드(Jasp)와 사이토칼라신 D(Cyto D) 두 시약으로 F-액틴 중합을 각각 양/음 방향으로 조절. 로다민-팔로이딘 염색 공초점 현미경 사진에서 Cyto D 처리 그룹 F-액틴 거의 탈중합되어 섬유 구조 거의 안 보임. 반면 Jasp는 F-액틴 안정화 및 중합, 대조군보다 더 뚜렷하고 밝은 번들형 구조로 검증(그림 5a). 웨스턴 블로팅 분석도 F-액틴 단백질 발현 영향 확인, Cyto D와 Jasp 모두 예상대로 작용함 입증(그림 5b). 세포 증식 분석에서 Cyto D가 세포 증식 유의 억제, Jasp가 세포 성장 촉진(그림 4a). 세포 계수 결과도 이와 일치(그림 4b).
F-액틴 조립 BMSC 골유전자 발현 조절. a,b CCK-8 분석 또는 자동 세포 계수기 1,2,3일째 Cyto D와 Jasp 처리 후 세포 증식. c,d 약물 처리 3일 후 MSC ALP 발현 평가 위해 ALP 염색과 ALP 활성 분석. ImageJ로 염색 면적 분석. c,e-h 웨스턴 블로팅과 qRT-PCR로 NT+Cyto D 그룹과 NT+Jasp 그룹 골생성 관련 마커 변화 대조군(무약물 처리)과 비교. NT 나노튜브 그룹. 데이터 평균 ± SD(3개 시료). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001
다음으로 MSC 골아세포 분화 능력 평가로 F-액틴 매개 여부 조사. 먼저 골생성 초기 마커 ALP 검출. 대조군 대비 Cyto D 처리 시 ALP 발현과 활성 감소, Jasp 처리 그룹에서 상향 조절(그림 4c,d). 이 결과와 일치하게 Jasp 처리 시 RUNX2와 OSX 단백질 수준 증가, Cyto D는 반대 효과(그림 4c). 이에 부합하게 골특이 유전자 RUNX2, ALP, OCN, OSX mRNA 발현 수준도 약물 처리 후 같은 경향(그림 4e-h). 종합하면 F-액틴이 TiO₂ 나노튜브 유도 MSC 골분화 과정에서 중요한 역할 함. F-액틴 탈중합 촉진은 나노위상 유도 골아세포 분화 억제, F-액틴 안정화와 중합 강화는 골아세포 분화 촉진.
MSC 운명 조절에 F-액틴 관여 기저 메커니즘 해명 위해 F-액틴과 직접 상호작용하거나 F-액틴 중합 영향 주는 단백질/분자 조사. 먼저 나노위상이 F-액틴과 G-액틴 균형 영향 어떻게 미치는지 파악 시도. TiO₂ 나노튜브는 물리적 신호로 막 투과성 화학 신호와 달라 세포막 구성요소 통해 자극 세포 내 전달해야. 축적 증거는 초점 접착 복합체(인테그린, 탈린, 초점 접착 키나아제(FAK), 빈큘린(VCL), 텐신 등)가 신호 전달체로 기능하여 세포에 세포외 기질(ECM) 상태 알리고 생물학적 거동 영향 줌[22,23]. 더 중요하게 F-액틴이 초점 접착 복합체 통해 인테그린과 결합하여 세포내 액틴 번들과 ECM 간 기계적 연결 형성[24]. 따라서 초점 접착 복합체 구성요소 발현 분석. 결과 VCL과 FAK 단백질과 mRNA 발현이 F-액틴 변화와 일치, 초점 접착 복합체가 TiO₂ 나노튜브 유도 MSC 골분화 과정 관여함 시사(그림 5b, 6a,b). 또한 RhoA, Ras 슈퍼패밀리 Rho GTPases 소형 GTPase 단백질, Jasp 처리 그룹에서 상향 조절, Cyto D로 억제됨(그림 5b, 6a,b). RhoA는 MAPK 경로 중요 상류 신호전달 분자로 FAK 조절 가능[25,26]. RhoA 주기능은 스트레스 파이버(F-액틴) 중합과 안정성 촉진, 초점 접착 복합체 조립 촉진[27]. 종합하면 TiO₂ 나노튜브가 초점 접착 복합체와 RhoA 통해 F-액틴 중합 영향 미칠 수 있음 시사.
로다민-결합 팔로이딘 염색으로 F-액틴 수준 면역형광 염색(a). 초점 접착 복합체 포함 FAK, VCL, RhoA, 인산화 YAP 단백질 발현 웨스턴 블로팅(b). NT 나노튜브 그룹
F-액틴 조립 MSC FAK(a), 빈큘린(VCL)(b), RhoA(c), MKL1(d), YAP(e), TAZ(f) 유전자 발현 영향. NT 나노튜브 그룹. 데이터 평균 ± SD(3개 시료). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001
하지만 F-액틴이 어떻게 세포 운명 조절? 대부분 연구 F-액틴이 세포 이동, 분열, 내포작용, 특히 종양 세포 침윤 관여 입증[28-30]. F-액틴이 세포 분화 조절 가능성, 더구나 구체적 분자 메커니즘 제시 연구 적음[31,32]. 따라서 F-액틴 변화 언급 논문 검색 결과 YAP/TAZ, 힙포 신호전달 경로 두 밀접 관련 전사 공동활성화인자, 세포질과 핵 사이 왕복하며 MSC 분화 조절 기계전달자 역할 가능성[33-35]. 또한 MKL1, 평활근 세포 분화 핵심 조절자, 전사 인자 혈청 반응 인자(SRF)와 상호작용, G-액틴 결합 가능, 세포질과 핵 순환[21,36]. 우리 결과 최종적으로 F-액틴 매개 나노튜브 유도 골아세포 분화에 YAP/TAZ와 MKL1 관여 확인(그림 5b, 6d-f). 흥미롭게도 인산화 YAP 단백질 발현 반대 경향 보임, YAP 발현 변화뿐만 아니라 Cyto D와 Jasp로 YAP 인산화도 변화됨(그림 5b). 이 결과 YAP/TAZ 인산화가 세포질 격리될 수 있다는 보고와 일치[35].
요약하면 우리 결과 예비적으로 F-액틴이 MKL1과 YAP/TAZ 통해 TiO₂ 나노튜브 상 MSC 골아세포 분화 조절함 입증(그림 7).
나노튜브 유도 F-액틴 조립 및 MKL1과 YAP/TAZ가 F-액틴 신호 하류 매개체로 유전자 발현 조절하는 가설적 역할 개략도
티타늄과 티타늄 합금은 티타늄 우수 특성으로 정형외과 임상 임플란트 가장 널리 사용 금속 물질[3]. 그러나 무균성 이완 여전히 시급 해결 과제, 핵심은 임플란트와 숙주 골 통합 개선에 있을 가능성. 이전 연구들 표면 코팅 수정 또는 생체기능 분자 고정화가 골융합에 유익함 보임[37]. 최근 세포 물리적 신호 반응 연구들로 임플란트 표면 위상 구조 많은 연구자 관심 끌기[9-11,13,38]. 본 연구 나노튜브 MSC 골분화 촉진 능력 입증, 이 능력 나노튜브 내경 증가(30-70V)와 함께 강화됨. 이는 임플란트 표면 나노튜브 직경 설계 지침 제공.
위상 구조로서 나노튜브 먼저 물질 물리적 특성 변화, 흡착 용량, 전기/열 전도도 등. 이 물리적 특성들 산업 분야 응용 결정. 예를 들어 고전압 전력 변압기 대부분 절연 물질 충전 필요, 보통 변압기 오일 또는 절연 기체. 변압기 절연 과열과 부분 방전으로 실패 시 심각한 방전 사고 발생. 따라서 변압기 내 용존 기체 또는 절연 기체 분해 성분 종류와 농도 정확히 검출하는 효과적 방법 찾기 필요하여 변압기 작동 상태 모니터링[8,39-41]. 전통적 접근법 d 전자 풍부한 전이 원소 중 기체 흡착 좋은 물질 찾기, 예 Pd(111)[39]. 요즘 나노튜브 좋은 기체 흡착 특성으로 널리 연구. He 등 CuO-BNNT가 C₂H₂ 흡착에 적합함 발견, C₂H₂ 더 강한 흡착 때문[8]. 한편 TiO₂ 자체도 기체 감지 물질 가능. Gui 등 Co-도핑 TiO₂가 기체 흡착 용량 추가 향상, C₂H₄ 분자 향한 우수한 흡착 능력과 전도도 변화 나타냄[40]. 본 연구와 일치하게 Mn-도핑 그래핀도 원시 그래핀보다 전도도 향상, C₂H₂와 CO 검출 우수 능력 보임[41]. 위 연구들 본 실험 제조 TiO₂ 나노튜브 변압기 작동 상태 모니터링 분야 잠재적 응용 가능성 시사. 그러나 기체 흡착 용량과 전기 전도도 추가 연구 필요, 특히 전이 원소(예 Mn) 도핑 후 향상 여부.
표면 물리적 특성 변경 외 나노스케일 형태도 부착 세포 생물학적 거동 영향. 세포 먼저 물질 표면 부착 후 이동, 증식, 분화. 평평한 표면 대비 나노튜브 중공 구조 세포 부착 부위 적게 제공. 따라서 세포가 나노튜브 표면 안정 부착하고 세포 내 생체역학적 균형 유지 위해 초점 접착 복합체 조립과 성숙 시작, F-액틴 강하고 안정해짐.
F-액틴, G-액틴 단량체 구성 선형 중합체 마이크로필라멘트, 골격 세 주요 구성요소 하나. 기계적 하중 구조로서 F-액틴 일반적으로 세포 분열, 이동, 내포작용, 종양 세포 침윤 관여 믿어짐[28-30], 일부 최근 연구 세포 분화 영향도 보임[31-33,36]. 예 스타틴 유도 액틴 골격 탈중합 연골세포 분화 유도[31], 액틴 탈중합 인간 기질 줄기세포 지방생성 분화 강화[32]. 우리 결과도 대조군 대비 나노튜브 배양 MSC 더 높은 F-액틴 수준과 뚜렷한 섬유 구조 가짐 밝혀냄. 한편 Jasp로 F-액틴 중합 촉진 시 골생성 분화 강화, F-액틴 탈중합 시 골생성 분화 억제, F-액틴이 TiO₂ 나노튜브 유도 MSC 골아세포 분화 매개함 시사.
F-액틴 Ras 슈퍼패밀리 Rho GTPases 조절 가능[23,42], Rho 최소 ROCK와 Dia 두 이펙터 통해 액틴 재구성 유도. ROCK Rho-GTP 결합 활성화 후 미오신 경쇄(MLC), ROCK 기질, F-액틴 조립 중요 역할. ROCK MLC 인산화효소 활성 억제, MLC 인산화 증가, 미오신 II ATPase 활성 자극, F-액틴 조립 촉진. 또한 ROCK LIM 키나아제(LIMK) 표적. 인산화 LIMK 코필린 인산화로 비활성화, 활성 상태 코필린 F-액틴 해체 가능. 다른 이펙터 Dia, 포민 동질성(FH) 단백질 패밀리 멤버, 두 FH 도메인 포함. 이 도메인들 다수 프롤린 풍부 모티프로 G-액틴 결합 단백질 프로필린 결합. 이 상호작용 액틴 중합과 F-액틴 조직화 기여[42]. 우리 Rho GTPases 중 하나 RhoA 검출, 발현 F-액틴 수준과 일치. 그러나 나노튜브가 RhoA 발현 조절 메커니즘 명확히 기술 못함, 인테그린 신호, 다른 부착 수용체, G 단백질 결합 수용체(GPCR), LPA 같은 가용성 인자, 수용체 티로신 키나아제 신호 등 많은 다른 조절자 존재[43].
F-액틴이 RhoA 조절됨 알면 이 과정 초점 접착 역할 무엇인지 물음. 세포 나노튜브 표면 부착 시 초점 접착 복합체(인테그린, 탈린, 빈큘린, 팍실린, 초점 접착 키나아제(FAK)) 형성 성숙. 인테그린 막관통 이량체로 ECM 타 초점 접착 단백질과 결합 세포 부착 촉진. 단순 후크 역할뿐만 아니라 주변 환경 본질 중요 신호 세포 전달, EGFR 등 다른 신호들과 함께 세포 생물학적 거동 결정 촉진. 이 신호들 초점 접착 복합체 직접 연결된 F-액틴 추가 전달. 한편 나노스케일 형태 초점 접착 복합체 조립 성숙 유도. 다른 한편 FAK와 Src 키나아제 패밀리 멤버들 CRK 같은 분자 리크루트해 초점 접착 복합체 조립 성숙 자기조절[44-46]. 우리 결과 F-액틴 탈중합으로 초점 접착 복합체 형성 성숙 손상됨 입증, 문헌 보고와 일치하는 초점 접착 복합체에서 액틴 조립 피드백 존재 시사.
그러나 초점 접착 복합체 포함 단백질들 신호전달 기능도 무시 못해[47]. 즉 나노튜브 신호 캐스케이드 통해 유전자 발현 직접 조절 가능, F-액틴 이 과정 참여하거나 영향 받을 뿐. 예 FAK와 Src 이중 키나아제 복합체 Rho GTPases(RhoA 등) 조절 가능. 나노튜브 인테그린과 FAK/Src 복합체 통해 RhoA 조절 가능함 시사. 또한 Src, 비수용체 티로신 키나아제 단백질, FAK 티로신 잔기 925 인산화로 Ras(소형 GTPase) 활성화[47,48]. Ras 수많은 생화학 경로 활성화, 잘 연구된 MAPK 경로와 PI3K/AKT/mTOR 경로 포함. MAPK 경로에서 Ras c-Raf 활성화, 미토겐 활성화 단백질 키나아제 키나아제(MAP2K) 거쳐 MAPK1/2, 즉 세포외 신호 조절 키나아제(ERK) 활성화. ERK 다시 혈청 반응 인자(SRF), c-Myc 등 성장 분화 관여 전사 인자 활성화[49]. 더구나 골생성 분화 핵심 전사 인자 Runx2도 ERK 조절 가능[50], 이전 연구 기계적 변형이 FAK-Erk1/2-Runx2 경로 통해 BMSC 골생성 분화 촉진 확인[17]. 따라서 ERK 나노튜브 유도 골생성 분화 역할 배제 못함, 추가 연구 필요.
나노튜브 유도 분화에서 F-액틴 정확한 역할 무엇인가, 변화가 세포 분화 영향 미치므로? 한 가능성 F-액틴 조립 변화가 역으로 FAK 수준 조절해 위 기술한 FAK-Erk1/2-Runx2 경로 통해 골생성 분화 유도. 우리 결과 초점 접착 복합체와 액틴 중합 같은 변화 경향 보임, 세포외 환경 반응 단일체로 작용함 시사. 그러나 다른 가능성도 존재, 다수 논문 MKL1과 YAP/TAZ가 액틴 동적 균형 하류 작용함 보여줌[20,51-54]. 둘 다 세포질과 핵 왕복, 골격 신호 핵 전달 도움 가능.
MKL1, 심근 관련 전사 인자 A라 불림, G-액틴 수준 변화 민감. 세포질 G-액틴 수준 증가 시 단량체 G-액틴 MKL1 결합해 SRF 결합과 전사 활성화 방지. SRF 표적 유전자 평활근 액틴(SMA) 등 액틴들, c-fos, egr1 등 즉시 조기 유전자 포함 액틴 결합 단백질들. 최근 연구 SRF 활성 변화가 지방생성 전사 인자 과산화물 증식체 활성화 수용체 γ(PPARγ) 활성화로 지방생성 조절, IGF-1과 Runx2 신호로 골형성 조절 가능성 입증[55,56].
YAP와 TAZ는 힙포 신호전달 경로 두 전사 공동활성화인자, 세포 증식 제한으로 장기 크기와 형태 형성 조절 중요 조절 경로로 확인[20]. LATS1/2 인산화로 14-3-3 단백질 결합 부위 생성, 결합으로 핵 수입 방지[53,54]. 결과 인산화 YAP/TAZ 세포질 격리, Ctgf, Areg 등 유전자 발현 방지. 또한 YAP/TAZ가 T-box 5(TBX5), RUNX2, p73과 상호작용 유전자 발현 조절 연구들[57-59]. 더구나 세포-세포 기질 단백질 부착이 인테그린/FAK/Src 축 통해 YAP 핵 국소화 유발함 입증[57]. 우리 연구 결과 이 경로 나노튜브 유도 분화 관여 가능성 시사. 인테그린/FAK/Src 축 하류 매개체 추가 연구로 구체적 메커니즘 규명 필요.
다른 한편 점점 더 많은 연구들 F-액틴이 힙포 신호전달과 상호작용, 어떤 방식으로 YAP 인산화 억제함 보여줌[54,60], F-액틴 중합 촉진 시 인산화 YAP 발현 감소 우리 실험 결과와 일치. G-액틴과 F-액틴 전환 과정 관여 ATP가 YAP 인산화에도 중요 역할 할 가능성 가설, 추가 연구 필요.
위 가능한 분자 메커니즘 이해 후 본 연구 발견 실험 현상들 설명 시도. 우리 결과 나노튜브 직경 클수록 골생성 분화 촉진 능력 강함 밝혀냄. 이전 연구들과 일치[61,62]. 이유 나노튜브 직경 클수록 세포 제공 부착 부위 적음, 초점 접착 복합체 조립 성숙 더 큼. 이와 함께 F-액틴 구성 스트레스 파이버 강도와 안정성 더 큼. 이 구조들 골생성 분화 촉진 신호 강화. 예상되지만 나노튜브 직경 너무 커지면 세포 표면 부착 어려워 이 효과 현저히 감소[12]. 마찬가지로 나노튜브 높이 불일치 시 높이 차이 부착 부위 변화, 골격 재배열 유발, 세포 분화 추가 영향. 흥미롭게도 나노튜브 수정 없는 평평한 표면 물질도 세포 분화 변화 유도 가능. 다수 연구 기판 강성이 초점 접착 형성과 스트레스 파이버 조직 조절함 입증[63-65], YAP/TAZ도 이 과정 중요 역할. 따라서 인테그린-초점 접착(FAs)-F-액틴 축이 물리적 신호 세포내 화학적 신호 전달 역할 함 명백.
요약하면 우리 결과 F-액틴이 MKL1과 YAP/TAZ 통해 TiO₂ 나노튜브 상 중간엽 줄기세포 골아세포 분화 조절함 입증, 표적 유전자 일부 MSC 증식 분화 설명. 단일 신호 네트워크 변화 없음, 모든 변화 수많은 분자와 단백질 조절. 한 생물학적 거동 일련 신호전달 경로 조절 결과. 나노튜브 인테그린, 초점 접착 복합체 단백질들, FAK, Src, Rho GTPase, MAPK 경로, 힙포 경로, 다른 보고된 신호전달 경로 포함 복잡 신호 네트워크 유발 세포 분화 유도. 최소 중요하게 신호 네트워크 많은 신호 순환 존재, 하류 신호 피드백으로 상류 신호 조절 가능. 본 연구 빈큘린과 FAK가 F-액틴 조립으로 역조절 가능함 발견, 분자 기능 불확실성 증가. 따라서 분자 메커니즘 더 자세한 내용 추가 연구 대기.
우리 결과 TiO₂ 나노튜브가 MSC 골생성 분화 촉진, 이 능력 나노튜브 직경 증가에 따라 일정 범위(30-70V) 내 강화됨 보임. F-액틴이 MKL1과 YAP/TAZ 통해 나노튜브 유도 세포 분화 매개, 세포 분화 연구에 새로운 통찰 제공.
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나노물질
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