DNA 합성

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배경

디옥시리보핵산(DNA) 합성은 핵산 가닥의 사본이 만들어지는 과정입니다. 자연에서 DNA 합성은 DNA 복제로 알려진 메커니즘에 의해 세포에서 발생합니다. 유전 공학과 효소 화학을 사용하여 과학자들은 DNA 합성을 위한 인공적인 방법을 개발했습니다. 이들 중 가장 중요한 것은 중합효소연쇄반응(PCR)이다. 1980년대 초에 처음 개발된 PCR은 원래 특허가 3억 달러에 판매되면서 수십억 달러 규모의 산업이 되었습니다.

연혁

DNA는 1951년 Francis Crick, James Watson, Maurice Wilkins에 의해 발견되었습니다. 로잘린드 프랭클린이 생성한 X선 결정학 데이터를 사용하여 Watson과 Crick은 DNA의 구조가 이중 나선 구조임을 확인했습니다. 이 작업으로 Watson, Crick, Wilkins는 1962년 노벨 생리의학상을 받았습니다. 수년에 걸쳐 과학자들은 "생명의 암호"를 알아내기 위해 DNA를 연구했습니다. 그들은 DNA가 단백질 서열에 대한 명령 코드 역할을 한다는 것을 발견했습니다. 그들은 또한 모든 유기체가 고유한 DNA 서열을 가지고 있으며 선별, 진단 및 식별 목적으로 사용될 수 있음을 발견했습니다. 이 연구에서 한계가 있는 것으로 판명된 한 가지는 단일 소스에서 사용할 수 있는 DNA의 양이었습니다.

DNA의 성질이 결정된 후 과학자들은 세포 유전자의 구성을 조사할 수 있었습니다. 유전자는 단백질 구성을 위한 코드를 제공하는 DNA 염기쌍의 특정 서열입니다. 이 단백질은 눈 색깔이나 혈액형과 같은 유기체의 특성을 결정합니다. 특정 유전자가 분리되면 해당 분자의 사본을 합성하는 것이 바람직해졌습니다. 대량의 특정 DNA가 합성된 최초의 방법 중 하나는 유전 공학을 통한 것입니다.

유전 공학은 관심 유전자를 박테리아 플라스미드와 결합함으로써 시작됩니다. 플라스미드는 많은 박테리아에서 발견되는 작은 DNA 스트레치입니다. 생성된 하이브리드 DNA를 재조합 DNA라고 합니다. 그런 다음 이 새로운 재조합 DNA 플라스미드를 박테리아 세포에 주입합니다. 그런 다음 세포는 배양물에서 성장하고 증식하도록 하여 복제됩니다. 세포가 증식함에 따라 삽입된 유전자의 사본도 증가합니다. 박테리아가 충분히 증식하면 삽입된 유전자의 여러 복사본을 분리할 수 있습니다. 이 DNA 합성 방법은 몇 주 안에 수십억 개의 유전자 사본을 생성할 수 있습니다.

1983년 Kary Mullis가 중합효소연쇄반응(PCR)이라고 하는 DNA 합성 과정을 개발하면서 DNA 사본을 만드는 데 필요한 시간이 크게 단축되었습니다. 이 방법은 단 몇 시간 만에 수십억 개의 DNA 가닥 사본을 생성하는 이전 알려진 방법보다 훨씬 빠릅니다. DNA 중합효소, 뉴클레오티드 및 프라이머가 포함된 용액에 이중 가닥 DNA의 작은 부분을 넣는 것으로 시작합니다. 용액을 가열하여 DNA 가닥을 분리합니다. 냉각되면 중합효소가 각 가닥의 복사본을 생성합니다. 원하는 양의 DNA가 생성될 때까지 이 과정을 5분마다 반복합니다. 1993년 Mullis는 PCR을 개발하여 노벨 화학상을 받았습니다. 오늘날 PCR은 의료 진단, 법의학 및 미생물학 분야에 혁명을 일으켰습니다. 유전 연구에서 가장 중요한 발전 중 하나라고 합니다.

배경

DNA 합성을 이해하는 열쇠는 그 구조를 이해하는 것입니다. DNA는 뉴클레오티드라고 하는 화학 단위로 구성된 긴 사슬 중합체입니다. 유전 물질이라고도 알려진 DNA는 대부분의 살아있는 유기체에서 단백질 합성을 지시하는 정보를 전달하는 분자입니다. 일반적으로 DNA는 화학적으로 연결된 두 개의 뉴클레오티드 사슬로 존재합니다. 이러한 링크는 기본 페어링 규칙에 따라 지정된 특정 패턴을 따릅니다. 각 뉴클레오티드는 데옥시리보스 당 분자, 인산염 그룹 및 4개의 질소 함유 염기 중 하나로 구성됩니다. 염기는 피리미딘인 티민(T)과 시토신(C)과 퓨린인 아데닌(A)과 구아닌(G)을 포함합니다. DNA에서 아데닌은 일반적으로 티민과 연결되고 구아닌은 시토신과 연결됩니다. 분자는 꼬인 사다리나 나선형 계단을 그리면 상상할 수 있는 이중 나선이라는 구조로 배열됩니다. 기초는 사다리의 가로대를 구성하고 설탕과 인산염 부분은 사다리 측면을 구성합니다. 염기서열이라고 하는 뉴클레오티드가 연결된 순서는 DNA 시퀀싱으로 알려진 과정에 의해 결정됩니다.

진핵 세포에서 DNA 합성은 복제라는 과정을 통해 세포 분열 직전에 발생합니다. 복제가 시작되면 두 가닥의 DNA가 다양한 효소에 의해 분리됩니다. 이렇게 열리면 각 가닥은 새로운 가닥을 생산하기 위한 템플릿 역할을 합니다. 이 전체 과정은 DNA 중합효소라는 효소에 의해 촉매됩니다. 이 분자는 각 DNA 가닥에 상응하는 또는 상보적인 뉴클레오티드를 제공합니다. 그런 다음 뉴클레오티드는 화학적으로 연결되어 원래 가닥의 정확한 사본인 새로운 DNA 가닥을 형성합니다. 딸 가닥이라고 하는 이 사본에는 부모 DNA 분자의 절반과 완전히 새로운 분자의 절반이 들어 있습니다. 이 방법에 의한 복제를 반보존적 복제라고 합니다. 복제 과정은 세포가 한 세대의 세포에서 다음 세대로 유전 물질의 정확한 복제물을 전달하는 방법을 제공하기 때문에 중요합니다.

원자재

DNA 합성에 사용되는 주요 원료는 DNA 출발물질, taq DNA 중합효소, 프라이머, 뉴클레오티드 및 완충액을 포함합니다. 이들 각각은 수백만 개의 DNA 분자를 생산하는 데 중요한 역할을 합니다.

제어된 DNA 합성은 복제할 DNA의 작은 부분을 식별하는 것으로 시작됩니다. 이것은 일반적으로 원하는 단백질에 대한 코드를 포함하는 특정 DNA 서열입니다. 주형 DNA라고 하는 이 물질은 약 0.1-1 마이크로그램의 농도로 필요합니다. DNA 정제에 사용되는 미량의 화합물이라도 PCR 과정을 억제할 수 있으므로 고도로 정제해야 합니다. DNA 가닥을 정제하는 한 가지 방법은 70% 에탄올로 처리하는 것입니다.

1980년 이전에는 DNA 복제 과정이 알려져 있었지만 열에 안정한 DNA 중합효소가 없었기 때문에 PCR은 불가능했습니다. DNA 중합효소는 DNA 합성에 관련된 반응을 촉매하는 효소입니다. 1980년대 초, 과학자들은 자연적인 증기 분출구 주변에 사는 박테리아를 발견했습니다. thermus Aquaticus 라고 불리는 이 유기체는 극도의 열에서 안정적이고 기능적인 DNA 중합효소를 가지고 있었습니다. 이 태그 DNA 중합효소는 현대 DNA 합성 기술의 초석이 되었습니다. 일반적인 PCR 과정에서 taq 2-3 마이크로그램 DNA 중합효소가 필요합니다. 그러나 너무 많이 사용하면 원치 않는 비특이적 DNA 서열이 생성될 수 있습니다.

중합효소는 각 DNA 가닥의 해당 뉴클레오티드를 결합하여 DNA 가닥을 만듭니다. 화학적으로 말하면, 뉴클레오티드는 당 구조, 인산기 및 고리 염기를 포함한 세 가지 유형의 분자 그룹으로 구성됩니다. 당 부분은 모든 뉴클레오티드의 1차 구조를 제공합니다. 일반적으로 당은 5개의 탄소 원자로 구성되며 다수의 하이드록시(-OH) 기가 부착되어 있습니다. DNA의 경우 당은 2-deoxy-D-ribose입니다. 뉴클레오타이드의 정의 부분은 당에 공유 결합된 헤테로고리 염기입니다. 이러한 염기는 피리미딘 또는 퓨린 그룹이며 핵산 코드의 기초를 형성합니다. 아데닌과 구아닌을 포함하여 두 가지 유형의 퓨린 염기가 발견됩니다. DNA에는 티민과 시토신의 두 가지 유형의 피리미딘 염기가 존재합니다. 인산기는 뉴클레오티드의 마지막 부분을 구성합니다. 이 그룹은 인산에서 파생되며 다섯 번째 탄소의 당 구조에 공유 결합됩니다.

중합효소연쇄반응(PCR)의 첫 번째 단계는 DNA의 변성입니다. DNA 분자의 이러한 "열림"은 생성될 다음 DNA 분자에 대한 주형을 제공합니다. DNA가 별도의 가닥으로 분할되면 온도가 낮아집니다(프라이머 어닐링 단계). 다음 단계에서 DNA 중합효소는 가닥과 상호작용하고 전체 길이를 따라 상보적인 뉴클레오티드를 추가합니다. 이 단계에서 필요한 시간은 염기쌍 1,000개당 약 1분입니다.

DNA 합성을 시작하려면 DNA의 짧은 프라이머 섹션을 사용해야 합니다. 올리고 조각이라고 하는 이 프라이머 섹션은 길이가 약 18-25개의 뉴클레오티드이며 주형 DNA의 섹션에 해당합니다. 이들은 일반적으로 균일한 분포로 약 60%의 C 및 G 뉴클레오티드 농도를 갖습니다. 이것은 합성 과정에서 최대 효율을 제공합니다.

완충액은 DNA 합성이 일어날 수 있는 매질을 제공합니다. 이것은 MgCl2, HCl, EDTA 및 KCI를 포함하는 수용액입니다. MgCl2 농도는 Mg2+ 이온이 DNA 및 DNA 합성에 중요한 복합체를 생성하는 프라이머와 상호작용하기 때문에 중요합니다. 권장 농도는 1-4 마이크로몰입니다. 이 시스템의 pH는 매우 중요하므로 황산암모늄으로 완충될 수도 있습니다. 반응을 활성화하기 위해 ATP, GTP 및 NTP와 같은 다양한 에너지 분자가 추가됩니다. 이 화합물은 살아있는 유기체가 대사 반응을 강화하는 데 사용하는 것과 동일한 화합물입니다.

공정에 사용될 수 있는 기타 재료에는 광유 또는 파라핀 왁스가 포함됩니다. DNA 합성이 완료된 후 DNA는 일반적으로 분리 및 정제됩니다. 이 과정에서 사용되는 몇 가지 일반적인 시약에는 페놀, EDTA 및 Proteinase K가 있습니다.

제조 공정

DNA 합성은 일반적으로 실험실에서 소규모로 수행됩니다. 여기에는 샘플 준비, DNA 합성 반응 주기 및 DNA 분리를 포함한 세 가지 별개의 프로세스가 포함됩니다. 이러한 제조 단계는 일반적으로 오염을 피하기 위해 별도의 영역에서 수행됩니다. 이러한 절차에 따라 과학자들은 몇 가닥의 DNA를 수백만 개의 정확한 사본으로 변환할 수 있습니다.

샘플 준비

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1 DNA 합성을 시작하기 위해 다양한 솔루션을 준비합니다. 이것은 일반적으로 오염을 최소화하기 위해 UV 램프가 장착된 층류 캐비닛에서 수행됩니다. 과학자들은 비슷한 이유로 각 생산 단계에서 새 장갑을 사용합니다. 일반적으로 프라이머, 중합효소 및 dNTP를 제외한 모든 시작 용액은 오염된 유기체를 죽이기 위해 오토클레이브에 넣습니다. 두 개의 별도 솔루션이 만들어집니다. 하나는 버퍼, 프라이머 및 폴리머라아제를 포함합니다. 다른 하나는 MgCl2와 주형 DNA를 포함합니다. 이 용액을 모두 작은 튜브에 넣어 반응을 시작합니다.

Kary Banks Muilis.

Kary Banks Muilis는 1944년 North Carolina의 Lenoir에서 태어났습니다. 화학에서 Muilis는 University of California, Berkeley에서 생화학 박사 과정에 입학했습니다. 박사 학위 취득 1973년 그는 캔자스시티에 있는 캔자스 대학교 의과대학에서 교수직을 수락했습니다. 1977년에 그는 샌프란시스코에 있는 캘리포니아 대학교에서 박사후 연구원이 되었습니다.

Muilis는 1979년 성장하는 생명공학 회사(캘리포니아주 에머리빌에 있는 Cetus Corporation)에서 연구 과학자의 자리를 수락했습니다. 이 회사는 다른 과학자들이 유전 복제에 사용하는 화학 물질을 합성했습니다. 그곳에 있는 동안 그는 몇 시간 안에 수십억 개의 복제물을 생성할 수 있는 특정 유전자 또는 DNA(디옥시리보핵산) 단편을 복제하는 빠르고 효과적인 기술인 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 설계했습니다. DNA를 복제하는 가장 효과적인 방법은 클로닝이었지만 문제가 있었습니다. Mullis의 동료들에게 이 발견의 중요성을 확신시키는 데 시간이 걸렸지만 곧 PCR이 집중 연구의 초점이 되었습니다. Cetus의 과학자들은 이 공정의 상용 버전과 Thermal Cycler라는 기계를 개발했습니다(DNA[뉴클레오티드]의 화학적 빌딩 블록과 생화학적 촉매[중합효소]를 추가하여 기계는 대상 조각에서 자동으로 공정을 수행합니다. DNA).

Cetus는 Muilis에게 PCR 특허 개발에 대해 10,000달러를 수여한 후 3억 달러에 매각했습니다. 1986년에 Cetus를 떠나 Muilis는 개인 생화학 연구 컨설턴트가 되었고 1993년에 노벨상을 수상했습니다.

DNA 합성 주기

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2 반응 용액이 준비되면 PCR 사이클이 시작됩니다. 첫 번째 단계는 DNA의 변성입니다. 가장 중요한 초기 단계 중 하나는 DNA 템플릿의 완전한 변성입니다. DNA의 변성은 본질적으로 이중 결합 가닥이 끊어지는 것을 의미합니다. DNA 분자의 이러한 "열림"은 생성될 다음 DNA 분자에 대한 주형을 제공합니다. 불완전한 변성은 각 후속 주기에 부정적인 영향을 미치는 첫 번째 주기에서 비효율적인 복사를 초래합니다. 초기 변성은 DNA 주형 용액을 1~3분에 걸쳐 203°F(95°C)로 가열하여 수행됩니다. 총 시간은 템플릿 구성에 따라 다릅니다. 반복 주기에서 변성 단계는 약 2분 동안 지속되며 용액을 201PF(94°C)로 가열하는 것을 포함합니다. 글리세롤, DMSO 또는 포름아미드와 같은 DNA 변성을 촉진하기 위해 용액에 추가 물질을 첨가할 수 있습니다.

3 DNA가 별도의 가닥으로 분할되면 온도가 50-65°C(122-149°F)로 낮아집니다. 이를 프라이머 어닐링 단계라고 하며 약 2분 동안 지속됩니다. 이 시점에서 왼쪽 및 오른쪽 프라이머는 주형 DNA의 상보적 염기와 일치하고 화학적으로 연결됩니다.

4 다음 단계에는 확장 단계가 포함됩니다. 반응의 이 부분은 대부분의 DNA 가닥이 복사될 때입니다. 시스템의 온도는 약 162°F(72°C)로 가열되고 복사할 DNA의 길이에 따라 유지됩니다. 이 단계에서 DNA 중합효소는 가닥과 상호작용하고 전체 길이를 따라 상보적인 뉴클레오티드를 추가합니다. 이 단계에서 필요한 시간은 염기쌍 1,000개당 약 1분입니다.

5 이 첫 번째 주기 후에 DNA 합성 주기가 반복됩니다. 사이클 수는 초기 DNA의 양과 원하는 DNA의 양에 따라 다릅니다. 템플릿 DNA의 사본이 10개 미만이면 40주기가 필요합니다. 초기 DNA가 더 많으면 25-30 주기로 충분합니다.

6 마지막 주기 동안 샘플은 약 15분 동안 162°F(72°C)에서 유지됩니다. 이를 통해 새로운 DNA 가닥의 돌출된 끝 부분을 (뉴클레오티드로) 채울 수 있습니다. 이 단계에서 중합효소는 DNA 가닥의 한쪽 끝에 추가 A 뉴클레오티드를 추가합니다.

DNA 분리

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7 반응이 완료되면 DNA 중합효소, MgCl2 및 프라이머와 같은 PCR 반응 물질로부터 DNA를 분리합니다. 이것은 페놀, EDTA 및 Proteinase K와 같은 화합물을 추가하여 수행됩니다. 이와 관련하여 원심분리도 도움이 됩니다.

미래

과학자들은 정기적으로 DNA 합성을 위해 PCR을 사용하지만 DNA 복제에 대해 아직 이해하지 못한 부분이 많습니다. 앞으로 연구는 관련된 구성 요소 및 중간체와 같은 공정의 몇 가지 중요한 단계에 대한 세부 사항을 해명해야 합니다. 또한 개선된 중합효소가 개발되어 더 작은 시작 샘플에서 더 많은 DNA를 생성할 수 있습니다. 언젠가는 DNA 합성이 살아있는 유기체의 주요 측면 중 일부를 풀고 다양한 암, 바이러스 및 박테리아 감염을 치료할 개발 의약품으로 이어지는 데 도움이 되기를 바랍니다.