친수성 폴리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르(mPEG)를 숙신산 무수물에 의해 이카린(ICA)에 그래프트하여 폴리에틸렌 글리콜-이카린(mPEG-ICA) 중합체를 형성했습니다. 중합체의 구조는 푸리에 변환 적외선 분광법(FT-IR) 및 핵 자기 공명 분광법(NMR)에 의해 특성화되었습니다. ICA가 로딩된 mPEG-ICA 나노입자는 투석에 의한 ICA의 물리적 포매에 의해 제조되었다. 입자 크기는 (220 ± 13.7) nm로 결정되었고, ζ 전위는 동적 광산란(DLS)에 의해 (2.30 ± 1.33) mV였다. 투과전자현미경(TEM)에서 나노입자는 구형이었고 형태는 규칙적이었다. pH 7.4의 배지에서 mPEG-ICA 나노입자의 약물 방출 속도는 72시간 이내에 (52.80 ± 1.70)%에 도달했습니다. pH 6.8에서 나노입자의 누적 약물 방출은 48시간 이내에 (75.66 ± 0.17)%에 도달했습니다. LPS 처리된 H9c2 세포로 나노입자를 처리하면 세포 생존력이 유지되고 LDH 방출이 감소하며 항세포자멸사 효과가 나타났습니다. 더욱이, ICA가 로딩된 mPEG-ICA 나노입자는 심근 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6M의 mRNA 발현을 유의하게 감소시켰다. 결론적으로, ICA가 로딩된 mPEG-ICA 나노입자는 LPS에 의해 유도된 H9c2 세포 손상으로부터 보호되었습니다.
염증 반응은 심실 재형성의 전체 병리학 적 과정에 참여하며 심장 손상 후 심장 질환의 합리적인 재형성의 주요 원인입니다 [1, 2]. 종양 괴사 인자(TNF)-α, IL-1β, IL-6 및 IL-18을 포함하는 이러한 전염증성 사이토카인은 심근 손상 및 장기 병리학적 리모델링을 유발합니다[3]. 심근세포가 손상되면 HMGBI와 같은 DAMP(손상 관련 분자 모델)를 방출하여 케모카인 수용체를 발현하도록 내피 세포를 활성화하고 염증 인자를 생성하며 심근 세포 괴사 또는 세포 사멸을 유도할 수 있습니다[4, 5]. 또한 HMGB는 CXCL12/CXCR4를 통해 손상된 심장에 대식세포 및 호중구와 같은 염증 세포의 축적을 촉진하여 심장 부담과 손상을 악화시킨다[5]. 따라서 염증 반응의 활성화를 차단하는 것은 심장의 병리학적 리모델링을 줄이는 효과적인 전략으로 사용될 수 있습니다.
이카린(ICA C33 H40 O15 )은 한약재인 에피메디[6]에서 추출한 리포좀 화합물이다. 광범위한 연구에 따르면 ICA는 면역 조절, 심장 보호, 항산화, 항염 및 항세포자멸제로서 고무적입니다[7, 8]. ICA의 긍정적인 특성에도 불구하고 낮은 수용해도, 짧은 반감기, 낮은 경구 생체이용률 등을 포함하여 적용을 제한하는 다양한 요인이 있습니다[9]. 나노운반체는 표적 직접 효능, 항염증 및 심장 보호를 향상시키는 새로운 전략이 되었습니다. 또한, 나노캐리어는 ICA의 단점을 극복할 수 있습니다[10, 11].
최근 연구자들은 약물 전달 시스템에 집중하고 있다[12]. 미셀[13], 리포솜[14] 및 탄소 나노튜브[15]와 같은 다양한 나노운반체가 개발되었습니다. 심혈관 질환의 사망률과 이환율을 줄이려면 충분한 ICA를 로딩하고 표적 유도 방출 특성을 갖는 새로운 나노투여 형태를 설계하는 것이 시급합니다.
ICA 적용의 한계를 극복하기 위해 우리는 폴리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르(mPEG)를 담체로 사용했습니다[16, 17]. mPEG는 폴리에틸렌글리콜의 유도체로 PEG보다 화학적 성질이 안정하고 친수성이 강하다[18]. 그러나 mPEG의 말단 수산기 활성이 매우 작기 때문에 약물이 담지된 나노물질인 mPEG는 수산기 활성화를 거쳐야 한다. 따라서 우리는 ICA를 소수성 말단으로 사용하고 mPEG와 숙신산 무수물의 에스테르화에 의해 형성된 카르복실 mPEG를 화학적 연결을 위한 친수성 말단으로 사용했습니다. 형성된 에스테르 결합은 산성 조건에서 분열을 가속화할 수 있습니다.
나노입자는 불용성 약물[19], 고분자 약물[20] 및 유전자 요법[21]의 약물 전달에서 독특한 이점을 가지고 있습니다. 종양 조직과 유사하게 심근 염증 부위는 유사한 투과성 및 체류 기능(EPR)을 갖는다[22]. 약 200nm 크기의 나노 입자는 간극을 통해 침투하여 약물 농축을 달성할 수 있습니다[23]. mPEG-ICA 나노입자는 초기 단계에서 준비되어 심근허혈에 대한 역할이 확인되었지만 loading ICA가 부족하여 최상의 효과를 얻을 수 없었습니다[24]. 따라서 화학적 합성과 물리적 포획의 조합에 의해 제조된 새로운 종류의 ICA가 로딩된 mPEG-ICA 나노입자는 ICA의 수용성 및 약물 로딩을 개선할 수 있을 뿐만 아니라 심근 염증에서 나노 제제의 지속 방출 시간을 연장하고 효과적으로 개선될 수 있다. 약물의 생체 이용률, ICA로 LPS 유도 H9c2 세포 손상의 표적 치료의 최상의 효과 달성. 우리는 pH 7.4 및 6.8 PBS 용액에서 ICA가 로드된 mPEG-ICA NP에서 ICA의 방출을 연구했습니다. 또한, mPEG-ICA 나노입자가 심근염에 미치는 영향을 연구하기 위해 지질다당류(LPS)를 사용하여 H9C2 세포를 유도하여 외부 염증 모델을 구축하고 세포 생존율, 세포 사멸 속도 및 전염증성 사이토카인의 mRNA 발현을 검출한 후 연구했습니다. 심근 염증 과정에서 ICA가 로딩된 mPEG-ICA 나노입자의 약력학적 효과
다음을 사용하였다:전자 저울 JA302(Shanghai Suzhan Metrology instrument Co., Ltd.); 회전 증발기 RE52CS-1(Shanghai Yarong 생화학 기기 공장); 디지털 디스플레이 항온 자기 교반기 78HW-1(Hangzhou instrument Motor Co., Ltd.); 전기 블라스트 건조기 101-OA(Tianjin Telester instrument Co., Ltd.); 푸리에 변환 적외선 분광기 NEXUS670(Neliko Co., Ltd.); UV-Vis 분광 광도계(Beijing Leiboteke instrument Co., Ltd.); 투과 전자 현미경(TEM Glacios); 초음파 분산 추출 기기 수조 발진기 JP-010S(중국 Jiemeng Co., Ltd.); 실시간 형광 정량적 PCR 기기; 다기능 효소 라벨링 기기; 도립현미경(Olympus company) 형광현미경(Leica, Heidelberg, Germany); 이산화탄소 세포 배양기 (Thermo company).
시약명 순도/사양/생산 배치 번호(제조사):Icariin(95%/1g/DL070208 Sahn Chemical Technology Co., Ltd.); 지질다당류(Model 055-100g/Z06J9Y52452 B5 25mg Sigma Co., Ltd.); 폴리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르(Analytical Pure/250g/MKBT7172 V, Sigma Co., Ltd.); 디클로로메탄(Analytical Pure/500mL/20171103 Sinopharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd.); 4-디메틸아미노피리딘(Analytical Pure/100g/L170741 Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.); N-히드록시숙신이미드(Biological Reagent/100g/RA328L758 Shanghai Ruiyong Biotechnology Co., Ltd.); genomic cDNA 합성 premixed kit의 첫 번째 가닥을 제거하는 FastKing one-step 방법(Tiangen Biotechnology Co., Ltd.); 세포자멸사 검출 키트(Biyuntian); SYBR 녹색 형광 정량 키트(QIAGEENGmbH 사).
mPEG(5.00g), 숙신산 무수물(SA, 0.40g) 및 4-디메틸아미노피리딘(몰비 1:1.5/1.5, 0.50g)을 칭량하고 250mL 둥근 바닥 플라스크에 넣었습니다. 디클로로메탄 50밀리리터를 첨가하고 환류하고 60°C에서 2시간 동안 교반했습니다. 35℃에서 반나절 동안 회전 증발기로 디클로로메탄을 제거하고 백색 고체를 얻었고 이를 에테르 잔류물이 나타나지 않을 때까지 상온 및 상압에서 반나절 동안 유지하였다. 분말을 50mL의 2차 증류수에 녹이고 물을 지속적으로 교체하면서 2kDa 투석 백에 48시간 동안 투석했습니다. 용해된 SA를 제거하고, 용해되지 않은 물질을 여과하였다. Carboxylated mPEG (mPEG-COOH)는 여액을 동결 건조하고 무게를 측정하여 얻었습니다.
mPEG-COOH(0.37g), N 250mL 환저플라스크에 히드록시숙신이미드(0.024g)와 4-디메틸아미노피리딘(0.026g)을 칭량한 후, 용매로 DMSO(탈수디메틸설폭사이드) 10mL를 첨가하고 상온에서 반 동안 교반하였다. 카르복실기를 활성화하는 날. 그 다음 이카린 표준물질 100mg을 작은 관에 넣고 물을 제거한 DMSO 5mL를 넣어 표준물질을 완전히 용해시켰다. 그런 다음 표준 시료를 둥근 바닥 플라스크에 넣고 질소 가스의 보호 하에 실온에서 48시간 동안 교반했습니다. 2차 증류수로 연속 투석한 결과 표준시료에는 DMSO가 포함되어 있지 않았으며 UV를 이용하여 DMSO 제거를 확인하였다. 그런 다음 투석된 물질을 진공 동결 건조기에서 48시간 동안 동결 건조하여 담황색 생성물, 즉 mPEG-ICA 폴리머를 얻었다.
mPEG-ICA(5mg)를 작은 튜브에서 칭량하고 2mL의 DMSO에 용해한 다음 37°C의 물에서 5분 동안 진탕했습니다. ICA 5mg을 DMSO 적당량에 녹여 작은 비이커에 넣고 mPEG-ICA를 천천히 DMSO에 넣어 녹이고 증류수 5mL를 가하였다. 그런 다음 용액을 자기 교반기에서 실온에서 15분 동안 교반했습니다. 그런 다음, 반응물을 3500 투석 백에 넣고 24시간 동안 물에서 투석했으며, 그 동안 물을 지속적으로 바꾸고 DMSO 용매를 깨끗하게 투석하고 여과 후 ICA가 로딩된 mPEG-ICA 나노 입자를 얻었다.
적절한 양의 표준 ICA, mPEG-COOH 및 mPEG-ICA 폴리머를 마노 모르타르에서 분말로 분쇄하고 적절한 양의 건조 KBr 분말과 혼합하고 미세 분말로 분쇄했습니다. 정제를 누른 후 혼합물을 4000–4400cm/mol -1 스캔 범위의 푸리에 적외선 분광계에서 스캔했습니다. , 그리고 적외선 스펙트럼이 기록되었습니다. ICA 및 mPEG-COOH는 재료 특성화에 사용되었으며 mPEG-ICA 폴리머는 제품 특성화에 사용되었습니다.
ICA, mPEG-COOH 및 mPEG-ICA 폴리머를 중수소화 디메틸 설폭사이드(DMSO-d6)에 용해하고 샘플 튜브에 로드하여 로터에 삽입했습니다. 그런 다음 샘플을 500MHz 핵자기 공명 분광기에 놓고 샘플링 매개변수를 설정했습니다.
이카린 표준(4.0mg)을 25mL 용량 플라스크에 첨가하고 메탄올을 스케일에 추가한 다음, 투명해질 때까지 진탕하고 용해했습니다. 그런 다음 이카린 표준용액 0.3mL, 0.5mL, 1.0mL, 1.5mL, 2.0mL 및 2.5mL 분취량을 25mL 메스플라스크에 정확하게 측정하고 메탄올을 첨가하여 부피를 조정했습니다. 그런 다음 메탄올을 블랭크 대조군으로 사용하여 파장 270nm(최대 흡수 파장)에서 자외선 분광광도계에서 용액의 흡광도 값을 측정했습니다. 데이터는 선형 회귀를 생성하기 위해 기록되었습니다.
mPEG-ICA 중합체(4.3mg)를 25mL 부피 플라스크에서 정확하게 칭량하고 메탄올을 스케일에 추가했습니다. 용액을 용해되고 투명해질 때까지 진탕하였다. 그런 다음 2.0mL 검액을 3회 정확하게 측정하여 25mL 메스플라스크에 넣고 메탄올로 부피를 조절하여 녹였다. 그런 다음 메탄올을 블랭크 대조군으로 사용하여 파장 270nm(최대 흡수 파장)에서 자외선 분광광도계에서 용액의 흡광도 값을 측정하고 평균을 취하여 데이터를 3회 기록했습니다. 그런 다음 이카린 함량을 계산했습니다.
상기 방법에 따라 제조된 ICA가 로딩된 mPEG-ICA 나노입자를 25mL 용량 플라스크에 넣고, 메탄올을 스케일에 맞게 첨가하고, 용액이 용해되고 투명해질 때까지 플라스크를 흔들었다. 그런 다음 2.0mL 검액을 3회 정확하게 측정하여 25mL 메스플라스크에 넣고 메탄올로 부피를 조절하여 녹였다. 그런 다음 메탄올을 블랭크 대조군으로 사용하여 파장 270nm(최대 흡수 파장)에서 자외선 분광광도계에서 용액의 흡광도 값을 측정하고 평균을 취하여 데이터를 3회 기록했습니다. ICA가 로딩된 mPEG-ICA 나노입자의 평균 ICA 함량을 계산하기 위해 데이터를 수집했습니다.
동적 광산란 입자 크기 측정기(DLS; The zetasizer 3000hs, Malvern instrument, Malvern, UK)를 사용하여 ICA가 장착된 mPEG-ICA NP의 입자 크기 분포 및 전위를 측정했습니다. 새로 준비된 mPEG-ICA 및 ICA가 로드된 mPEG-ICA NP를 동결건조하고 증류수에 재분산한 다음 비색 컵에 부은 다음 검출을 위해 동적 광산란 입자 크기 분석기 샘플 풀에 넣었습니다. 각 샘플은 세 번 분석되었습니다.
ICA가 로드된 mPEG-ICA NP(1.0mg/mL) 용액을 탄소 필름과 여과지가 있는 구리 메쉬에 떨어뜨려 건조했습니다. 그리드를 건조기에 넣고 2%(w/w) 인텅스텐산을 첨가하고 10분 동안 자연 건조시켰다. 그런 다음 투과 전자 현미경으로 80kV의 가속 전압에서 ICA가 장착된 mPEG-ICA 나노입자의 형태적 특성을 관찰했습니다.
제조된 ICA가 로딩된 mPEG-ICA 나노입자를 진공 동결 건조기에서 5% 만니톨로 48시간 동안 동결 건조시킨 후 동결 건조된 나노 입자를 이중 증류수에 재용해하여 입자 크기 및 PDI 값의 변화를 감지했습니다. .
1.8mL ICA가 로딩된 mPEG-ICA NP 용액을 10mL 메스플라스크에 정확하게 측정하고 0.2mL DMSO를 첨가하고 2분 동안 초음파를 수행했습니다. 용액의 흡광도는 270nm에서 측정하였고, 동일한 용매를 사용하는 mPEG-ICA 폴리머를 블랭크로 사용하였다. 결정된 시료의 흡광도를 표준곡선식에 대입하여 이카린 함량을 계산하였다. DMSO/H2에서 O =1/9 용매계, 270nm에서 Icariin의 준곡선 방정식을 측정하고, 나노입자의 약물 로딩(EE%) 및 포획 효율(LC%)을 계산했습니다.
약물 로딩(EE%) =나노입자의 약물 질량/약물 로딩 나노입자의 총 질량 × 100%
<리>캡슐화율(LC%) =나노입자의 약물 질량/투여량 × 100%.
유리 ICA, mPEG-ICA 폴리머 및 ICA가 로딩된 mPEG-ICA NP 5밀리리터를 투석 백(3500kDa)에 넣고 양쪽 끝을 고정하고 37°C에서 PBS(방출 배지) 25mL로 투석했습니다. 100rpm 초음파 진동(pH =7.4). 미리 정해진 시간(Tn, n =0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72h) 같은 부피의 새 용액으로 교체합니다. UV-Vis 분광광도법을 수행하여 서로 다른 시간에 270nm에서 투석액의 흡광도를 측정했습니다. 설명된 대로 ICA 방출의 백분율 비율을 계산하고 3개의 샘플을 측정하여 평균 약물 방출을 계산했습니다. 투석액의 함량은 표준곡선법으로 측정하였고, 방출시험은 체외에서 3회 반복하였다.
약물 방출 공식은 Q입니다. % =(C n × V + V n Σ n 그 =0 C 나 )/(WNP × LC%), 여기서 W는 NP의 중량, LC%는 나노입자의 약물 로딩, C n Tn에서의 샘플 농도, V는 방출 매질(25mL)의 총 제품, Vn은 샘플 중량(2mL), C 나 T입니다 나 (나 =0, 0.5, 1, …., n 어 ,V 0 =C 0 =0).
ICA가 로딩된 mPEG-ICA NP 용액 2밀리리터를 투석 백(4–88kDa, 분자량 컷오프 값)에 넣고 pH 7.4 및 pH 6.8 인산염 완충 식염수(PBS 방출 배지, 37°C, 25)에 넣었습니다. ML). 그런 다음 샘플링을 위해 2mL의 방출 배지를 수집하고 미리 결정된 간격(Tn, n =0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48시간). 서로 다른 시간에 270nm에서 투석액의 흡광도를 UV-Vis 분광광도법으로 측정했습니다. ICA 방출의 백분율 비율을 계산하고 3개의 샘플을 측정하여 평균 약물 방출을 계산했습니다.
쥐의 심실 근모세포주인 H9c2(쥐 H9c2)는 중국 상하이 생화학 및 세포 생물학 연구소에서 구입했습니다. 세포를 10% 소태아혈청(Gibco, USA)을 함유한 DMEM에서 37°C, CO2에서 배양했습니다. - 포함하는 분위기. H9c2 세포는 일반적으로 10cm 배양 접시에 접종되었습니다[25]. 세포가 약 80%까지 성장했을 때, 0.25% 트립신(Gibco)으로 계대배양하였다. 그런 다음 다음 연구를 위해 해당 배양 접시 또는 96웰 플레이트에 세포를 접종했습니다.
H9c2 세포를 다음과 같이 5개 그룹으로 나누었습니다:(1) 대조군:정상 배양 배지를 사용, (2) LPS 그룹:세포를 10 mg/L LPS로 24시간 동안 처리했습니다. (3) ICA군:20μmol/L ICA(1:1000, DMSO) 및 10mg/L LPS를 동일한 기간 동안 세포에 처리, (4) mPEG-ICA 고분자 군:20μmol 처리 /L mPEG-ICA 중합체 및 동일한 기간 동안 동일한 최종 농도의 LPS; (5) ICA-loaded mPEG-ICA NPS 그룹:세포에 20μmol/L ICA-loaded mPEG-ICA NP와 10mg/L LPS를 처리했으며 다른 조건은 위의 그룹과 동일합니다.
LPS로 유발된 심근세포 손상에 대한 ICA 나노입자의 세포 생존력은 MTT에 의해 결정되었습니다. 간단히 말해서, H9c2 세포를 LPS와 다른 ICA 나노입자로 24시간 동안 처리했습니다. 그 후, 세포를 37°C에서 4시간 동안 0.5mg/mL의 최종 농도로 MTT로 염색한 다음 150μL의 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 첨가하여 갑상선 결정을 용해시켰다. 광학 밀도는 마이크로플레이트 리더(*/SpectraMax i3 Molecular Devices, 아프가니스탄)에서 570nm에서 측정되었습니다.
LPS로 유도된 H9c2 손상에 대한 나노-ICA의 효과를 조사하기 위해 배양 배지에서 LDH 방출을 평가했습니다. 간단히 말해서, 24시간 동안 해당 처리에 따라 배양 배지를 수집하고 LDH 검출 키트(Beyotime Biotechnology)의 프로토콜에 따라 LDH를 검출하였다. 마지막으로 분광계로 490nm에서 OD 값을 측정했습니다.
Hoechst 33,258 염색을 사용하여 형광 현미경으로 핵 형태를 관찰했습니다. 처리 후 H9c2 세포를 PBS로 두 번 세척하고 4% 파라포름알데히드 완충액(Fisher Scientific, Pittsburgh, Pa)에 고정하고 PBS로 세척하고 Hoechst 33,258로 37°C에서 15분 동안 염색했습니다[26]. 염색 후 즉시 형광현미경(Leica, Heidelberg, Germany)으로 핵의 형태적 측면을 관찰하였다. Apoptosis index =apoptotic nuclei/total nuclei × 100%.
H9c2 세포 DNA 무결성의 검출을 위해 TUNEL 기술을 채택했습니다. H9c2 세포를 24웰 배양 플레이트에서 배양하였다. 처리 후 PBS로 3회 세척하고 4% 폴리포름알데히드로 30분간 고정하였다[27]. 그런 다음 세포막 투과성을 증가시키기 위해 1% Triton X-100을 5분 동안 추가했습니다. 이후 TUNEL 원스텝 검출 키트(Beyotime Biotechnology)를 사용하여 설명서에 따라 세포를 염색하고 형광현미경으로 세포의 세포사멸을 관찰하였다. 각 그룹의 세포 사멸 비율은 전체 핵(파란색)에 대한 녹색 형광 핵(TUNEL 양성)의 백분율로 표시됩니다(핵은 DAPI로 염색됨)[28].
LPS로 유도된 세포 사멸에 대한 다양한 ICA 나노 입자의 영향을 추가로 조사하기 위해 Annexin V-FITC/PI 이중 염색 방법을 사용하여 세포 사멸 속도를 분석했습니다. 위에서 설명한 대로 H9c2 처리 후 세포를 수확하고 10µL의 Annexin V-FITC와 5µL의 PI를 포함하는 195µL의 결합 완충액에 재현탁한 다음 어두운 곳에서 실온에서 15분 동안 배양했습니다. 4°C에서 10분 동안 1500rpm으로 원심분리한 후 염색 완충액을 흡인하고 세포를 PBS로 두 번 세척하고 100μL PBS에 재현탁했습니다. 마지막으로 유세포 분석기로 샘플을 측정했습니다.
RT-qPCR은 TNF-α, IL-1β 및 IL-6을 포함한 염증 마커의 mRNA 발현 수준을 검출하는 데 사용되었습니다. H9c2 세포를 24시간 동안 처리한 후 이전에 설명한 대로 TRIzol을 사용하여 총 RNA를 추출하고 NanoDrop™ One/OneC 마이크로 자외선 가시 분광 광도계(Thermo, ND-ONEC-W, USA)를 사용하여 측정했습니다. ExScript RT 키트를 사용하여 cDNA를 합성하고 다음 조건에서 SYBR Green 시약을 사용하여 형광 정량 PCR 기계(BIO-RAD CFX96 Touch*)에서 증폭을 수행했습니다. 95°C에서 5분, 95°C에서 30초, 58°C에서 30초, 총 28주기 이 연구에 사용된 프라이머는 다음과 같습니다.
앞으로 5' GCTGTCCCTGTATGCCTCT-3';
역 5'-TTGATGTCACGCACGATTT-3';
앞으로 5'TCTATACCACTTCACAAGTCGGA-3';
역 5'-GAATTGCCATTGCACAACTCTTT-3';
앞으로 5'GGATGATGACGACCTGCTA 3';
리버스 5'-CACTTGTTGGCTTATGTTCTG3'
앞으로 5'TGCCTTCTTGGGACTGAT-3';
역 5'-CTGGCTTTGTCTTTCTTGTTAT-3'.
각 표적 유전자의 양은 액틴 유전자의 양으로 정규화하였다. 실험은 세 번 반복되었습니다.
mPEG-ICA 스펙트럼에서 2개의 에스테르 결합(-C=O-)의 신축 진동 흡수 피크는 1700 -1 이었습니다. 및 1740 −1 센티미터. mPEG-COOH 스펙트럼과 비교하여 1650cm −1 에서 과도한 C=C 신축 진동 피크가 있었습니다. , ICA와 mPEG-COOH의 에스테르화 합성이 mPEG-ICA를 성공적으로 형성했음을 나타냅니다(그림 1).
<그림>
mPEG-ICA의 FTIR 스펙트럼(A ), ICA(B ) 및 mPEG-COOH(C ). H 1 mPEG-COOH 및 mPEG-ICA에 대한 NMR 수소 스펙트럼
mPEG-ICA 수소 스펙트럼에서 12.6ppm은 낮은 필드로 이동하는 -C=O 강한 흡수 전자 그룹의 존재로 인해 ICA 페놀성 수산기 그룹을 나타냅니다. 약 7.5ppm의 벤젠고리 수소 피크와 3.5ppm의 피크 면적이 매우 커서 –CH2로 판단됨 -O- mPEG 폴리머의 수소 피크. 많은 분석에서 알킬 수소 신호가 0~2ppm임을 보여줍니다. 따라서 ICA의 이중 결합 수소 피크는 1.7ppm이라고 결론지을 수 있습니다. mPEG-COOH 및 ICA의 특징적인 피크는 mPEG-ICA 폴리머에 나타나 ICA와 mPEG-COOH의 성공적인 합성을 보여줍니다(그림 1).
mPEG-ICA 나노입자의 평균 입자 크기는 대략 (145.0 ± 15.2) nm이고, 고분자의 분산 지수(PDI) 값은 (0.277 ± 0.00)이다. ICA가 로딩된 mPEG-ICA 나노입자의 입자 크기는 약 (220.0 ± 13.7) nm로 약간 증가하였고, PDI는 (0.119 ± 0.00)이었다. PDI가 작을수록 ICA 로드 mPEG-ICA NP의 분포가 더 균일합니다. mPEG-ICA 나노입자의 제타 전위는 (0.439 ± 0.258) mV였고, ICA가 로딩된 mPEG-ICA 나노입자의 제타 전위는 (2.30 ± 1.33) mV였다. 투과 전자 현미경은 ICA가 로딩된 mPEG-ICA 나노 입자가 구형이고 형태가 규칙적이며 크기가 비교적 균일하다는 것을 보여주었습니다(그림 2).
<그림>
ICA 로딩 mPEG-ICA NP의 입자 크기, 제타 전위 및 TEM
ICA 로딩 mPEG-ICA NP의 ICA 함량은 자외선 분광 광도계로 계산할 수 있습니다. ICA 농도의 표준곡선을 설정하고, 이를 기준으로 약물 농도를 계산하여 고분자 내 ICA 함량을 구하였다. 계산에 따르면, mPEG-ICA 고분자 흡광도(1.2397 ± 0.1024)를 기준으로 ICA의 함량은 (0.4132 ± 0.0359) mg/mL였으며, ICA가 로딩된 mPEG-ICA 나노입자 흡광도(1.62830) ±2 ICA의 함량은 (0.5496 ± 0.3234) mg/mL였다. 방법의 공식에 따라 계산하면 mPEG-ICA 폴리머의 약물 로딩은 (16.5 ± 0.014)%, 캡슐화율은 (41.3 ± 0.036)%; ICA가 로딩된 mPEG-ICA 나노입자의 약물 로딩 함량은 (21.9 ± 0.013)%였고, 캡슐화율은 (54.9 ± 0.032)%였다(표 1).
투석법으로 제조된 ICA가 담지된 mPEG-ICA 나노입자의 입자크기는 (220.0 ± 13.7) nm이었고, PDI는 (0.119 ± 0.00)이었다. 48시간 동안 5% 만니톨에서 동결건조한 후 나노입자는 물에 재용해되어 안정한 나노입자를 형성할 수 있습니다. 입자 크기는 255nm이고 PDI는 (0.326 ± 0.00)으로 투석 나노입자보다 약간 컸습니다(그림 3).
<그림>
ICA 탑재 mPEG-ICA NP의 안정성
그림 4에서 ICA 방출은 방출 매질의 pH에 크게 의존합니다. pH 7.4의 PBS(phosphate-buffered saline) 방출 배지 내에서 유리 이카린은 12시간 이내에 방출(77.21 ± 0.15)%로 완전히 방출되었습니다. 이카린 약물이 로딩된 mPEG-ICA 나노입자는 나노입자의 방출을 증가시킬 수 있기 때문에, mPE-ICA 나노입자의 약물 방출은 72시간 이내에 (44.08 ± 0.12)%로 방출되고, ICA 로딩된 mPEG-ICA 나노입자는 (52.80 ±) 1.70에 도달했습니다. %. ICA가 로딩된 mPEG-ICA 나노입자를 pH 6.8의 완충액에 넣었고, 나노입자 매개 약물 방출이 48시간 이내에 (75.66 ± 0.17)%에 도달했음을 발견했습니다. 이는 일부 ICA가 로드된 mPEG-ICA NP가 해중합된 NP 또는 mPEG-ICA 분자가 NP에서 파손되었기 때문일 수 있습니다. 이러한 관찰은 ICA의 방출이 pH 6.8의 산성 조건에서 더 유리함을 나타내었다. 또한 ICA가 로딩된 mPEG-ICA 나노입자의 방출 특성은 국소 병변이 약산성 환경으로 초점을 유도하기 때문에 심근 염증 손상의 국소 치료에 유리하다는 것을 나타냈습니다.
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A pH 7.4에서 PBS의 ICA 로딩 mPEG-ICA NP로부터의 ICA 방출. 나 시험관 내 pH 7.4 및 pH 6.8, pH 7.4 및 pH 6.8, 37°C에서 ICA 로딩 mPEG-ICA NP에서 ICA 방출
먼저, ICA가 로딩된 mPEG-ICA 나노입자의 세포독성을 관찰하기 위해 H9c2 세포에 유리 약물(20μM ICA), mPEG-ICA NP 및 ICA가 로딩된 mPEG-ICA NP를 추가했으며 MTT 결과는 의 현저한 세포독성을 나타내지 않았습니다. 나노 입자(그림 5). 그런 다음 LPS로 인한 손상으로부터 H9c2 세포를 보호할 수 있는지 여부를 추가로 조사했습니다(그림 6). 24시간 동안 LPS를 처리한 후 세포 생존율은 (50.0 ± 3.22)%(대조군 100%)로 감소했으며, 여기서 ICA, mPEG-ICA NP 및 ICA가 로드된 mPEG-ICA NP로 처리하면 다음과 같이 H9c2 세포의 생존력이 크게 증가했습니다. (55.94 ± 1.06)%, (60.97 ± 2.615)%, (65.36 ± 1.214)% (P <0.05).
Evaluation of the cytotoxicity of ICA nanoparticles on H9c2 cells. Data are expressed as the mean ± SEM of three separate experiments
Evaluation of the effects of ICA nanoparticles on LPS-induced H9c2 cell injury. Cell viability in different groups was measured by MTT assay. Data are the mean ± SME. (**P < 0.01 vs. con; # P < 0.05 and, ## P < 0.01 vs. LPS; &피 < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA)
In addition, LDH levels are a marker of cell damage; therefore, we measured the release level of LDH in the culture medium (Fig. 7). LDH levels were increased in the LPS group compared with the normal culture group. Treatment with ICA, mPEG-ICA NPs or ICA-loaded mPEG-ICA NPs reduced the LDH level increase induced by LPS, especially in the ICA-loaded mPEG-ICA NP group. These results showed that ICA nanoparticles could protect cells from LPS.
The effect of ICA nanoparticles on the LDH level induced by LPS in H9c2 cells. Data are the mean ± SD. ***P < 0.01 versus con; ##P < 0.01 versus LPS treatment group; *&P < 0.05 versus LPS + mPEG-ICA group
First, nuclear morphology was detected by Hoechst 33,258 staining (Fig. 8). Nuclear chromatin exhibited condensation, breakage and fragmentation after LPS damage in the LPS group. However, for ICA-loaded mPEG-ICA NP group, the number of apoptotic cells obviously decreased. Moreover, we used TUNEL staining to observe cellular DNA breaks or DNA damage (Fig. 9). The number of apoptotic nuclei in the LPS-induced group was (47.57 ± 3.41)% (P ˂ 0.0001) compared to (6.47 ± 1.87)% in the normal culture group. After treatment with ICA-loaded mPEG-ICA NPs, mPEG-ICA NPs and ICA, the apoptosis rates decreased to (17.92 ± 3.12)% and (26.54 ± 3.68)% and (35.49 ± 4.25)%, respectively, and ICA-loaded mPEG-ICA NPs significantly reduced the apoptosis rate compared with mPEG-ICA NPs. In addition, flow cytometric analysis in LPS-induced H9c2 cells showed that (35.93 ± 2.23)% of the cells were in the early and late apoptotic stages (Fig. 10). After treatment with ICA-loaded mPEG-ICA NPs or mPEG-ICA NPs, the total apoptotic rates were reduced to (16.70 ± 2.77)% and (19.15 ± 3.67)%, respectively. These results were in line with the Hoechst 33,258 staining and TUNEL staining findings and indicated that ICA-loaded mPEG-ICA NPs largely prevented the cells from undergoing apoptosis.
Detection of apoptosis by Hoechst 33,258 staining. A Nuclear morphology in cells stained with Hoechst 33,258. 나 Quantitative analysis of the apoptosis rate by Hoechst 33,258 staining. Data are the mean ± SEM (***P < 0.005 vs. con; #P < 0.05 vs. LPS; &P < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA)
Detection of apoptosis by TUNEL. A Cells with TUNEL and DAPI staining; 나 apoptosis rate. Data are the mean ± SEM (****P < 0.0001 vs. con; ###P < 0.005 vs. LPS; &&P < 0.01 vs. LPS + mPEG-ICA)
A . Apoptotic rate detected by flow cytometry. H9c2 cells were stained by Annexin V/PI double staining. Q1-LL cells were Annexin V/PI double-negative stained, indicating viable cells; Q1-LR cells were Annexin V-positive and PI-negative stained, indicating early apoptosis; Q1-UR cells were Annexin V/PI double-positive stained, indicating late apoptosis. 나 . Apoptotic rate (%). Data are the mean ± SME. (***P < 0.005 vs. con; #P < 0.05 and ##P < 0.01 vs. LPS; &P < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA)
Next, we evaluated the effect of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on the mRNA expression of TNF-α, IL-1β and IL-6 in LPS-induced H9c2 cells. After LPS treatment for 24 h in H9c2 cells, the mRNA levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 were increased. These increases were attenuated by ICA-loaded mPEG-ICA NPs, mPEG-ICA NPs and ICA treatment, and ICA-loaded mPEG-ICA NPs treatment markedly lowed TNF-α, IL-1β and IL-6 mRNA expression (Fig. 11).
Effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on the mRNA expression levels of IL-1β, TNF-α and IL-6 in LPS-induced H9c2 cells. Effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on the mRNA IL-1β in the LPS induced H9c2 cells. (**P < 0.01 compared with con; #P < 0.05 compared with LPS; &피 < 0.05 compared with LPS + mPEG-ICA.) (2) Effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on the mRNA TNF-α. (***P < 0.005 vs. con; #P < 0.05 vs. LPS group; &P < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA) (3) Effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on mRNA IL-6. Data are the mean ± SEM (* P < 0.05 vs. con; #P < 0.05 vs. LPS; &피 < 0.05 vs. LPS + mPEG-ICA)
In this study, we analyzed the suitability of polymer nanoparticles to load ICA for the treatment of LPS-induced H9c2 cell damage. The synthesis method is highly feasible and has many advantages. First, mPEG is nontoxic and has good biocompatibility [29]. In this study, a chemical bonding method was used to assemble mPEG and ICA into an mPEG-ICA polymer, and then dialysis was used to physically wrap the ICA and form stable nanoparticles [30]. Nanoparticles can significantly improve the water solubility of ICA and can realize the long circulation of nanoparticles in the body [31, 32]. Compared with mPEG-ICA nanoparticles, ICA-loaded mPEG-ICA nanoparticles have many significant advantages. First, their PDI value is smaller, which proves that the particle size distribution is more uniform [33]. Second, the drug loading and encapsulation efficiencies of ICA-loaded mPEG-ICA NPs are both higher than those of mPEG-ICA NPs, making it easier to reach the effective drug concentration of ICA [34]. In a pH 6.8 solution, nanoparticles release more drugs, and an acidic environment may destroy the self-assembly force of nanoparticles and accelerate the cleavage of ester bonds, resulting in faster release of the drug into the medium and effective enrichment of the drug in the inflammation site [35, 36]. Huang et al. used LPS-induced osteoblasts to validate the model to explore the anti-inflammatory mechanism of Icariin. They found that Icariin can significantly upregulate the expression of BMP-2 and Runx2 in LPS-induced osteoblasts, thereby achieving effective therapeutic effects [37]. A study has shown that ICA can inhibit the inflammatory response of chondrocytes induced by LPS and reduce collagen formation [38]. In addition, ICA can also inhibit the caspase-1 signaling pathway mediated by the NLRP3 inflammasome and reduce LPS-induced sagging [39]. However, LPS-induced cells cannot effectively absorb ICA. Making ICA nanoparticles can solve this problem well. It may be that ICA is loaded by nanocarriers, greatly increasing its water solubility and allowing it to enter cells through free diffusion. At the same time, studies have shown that nanoparticles can promote cell endocytosis and tissue cell efflux and significantly improve the bioavailability of ICA [40, 41].
The results of the MTT assay and lactate dehydrogenase release experiments showed that ICA-loaded mPEG-ICA NPs could effectively alleviate the cell damage induced by LPS, and ICA-loaded mPEG-ICA NPs could release ICA from the particles. Furthermore, compared with the mPEG-ICA NPs, ICA-loaded mPEG-ICA NPs could load more ICA and release more easily. We also found that these nanoparticles markedly decreased apoptosis induced by LPS to alleviate the inflammatory response in H9c2 cells. Moreover, the antiapoptotic effect of ICA-loaded mPEG-ICA NPs was better than that of mPEG-ICA NPs and ICA. These results indicated that ICA nanoparticles could protect cardiomyocytes from inflammatory injury.
Inflammatory cytokines are the key factors involved in the development and progression of cardiovascular disease and are markers of the inflammatory response [42, 43]. Some researchers have found that TNF-α, IL-1β and IL-6 were closely related to cardiac function. The addition of these inflammatory cytokines to isolated cardiomyocytes resulted in abnormalities in cardiac function and promoted cardiomyocyte loss [44]. Our RT–qPCR results showed that ICA-loaded mPEG-ICA NPs could significantly inhibit the mRNA expression of TNF-α, IL-1β and IL-6. Therefore, these results implied that the protective effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs may occur through controlling inflammatory cytokines.
ICA-loaded mPEG-ICA NPs are a new type of nanomedicine successfully synthesized through nanotechnology (a combination of chemical synthesis and physical embedding). This process not only converts the hydrophobic drug ICA into water-soluble nanomedicine but also successfully improves the load capacity of ICA. In the weakly acidic solution, the ICA release from ICA-loaded mPEG-ICA NPs was greater than that of the neutral solution, indicating that nanoparticles are meaningful for the treatment of inflammatory cardiovascular diseases. Treatment with ICA nanoparticles effectively protected against LPS-induced H9c2 damage, promoted cell viability and inhibited cell apoptosis. Further experiments demonstrated that the new ICA-loaded mPEG-ICA NPs could release inflammatory cytokine production.
Not applicable.
Polyethylene glycol monomethyl ether
Icariin
Fourier transform infrared spectroscopy
Nuclear magnetic resonance spectroscopy
Dynamic light scattering
Transmission electron microscope
Tumor necrosis factor
Permeability and retention functions
Succinic anhydride
Dehydrated dimethyl sulfoxide
나노물질
초록 나노기술은 과학의 모든 분야에서 중요한 응용으로 가장 유망한 연구 분야가 되었습니다. 최근 몇 년 동안, 산화주석은 나노미터 범위에서 이 물질의 합성으로 개선된 매혹적인 특성으로 인해 엄청난 주목을 받았습니다. 오늘날 주석 산화물 나노 입자를 생산하기 위해 수많은 물리적 및 화학적 방법이 사용됩니다. 그러나 이러한 방법은 고가이고 높은 에너지를 필요로 하며 합성 과정에서 다양한 유독성 화학물질을 사용한다. 인간의 건강 및 환경적 영향과 관련된 증가된 우려는 생산을 위한 비용 효율적이고 환경 친화적인 공정의 개발로 이어졌습니다
초록 기존의 암 치료제는 다양한 부작용과 표적 종양에 대한 불충분한 손상으로 인해 비판을 받아왔다. 나노 입자의 돌파구는 전통적인 치료법과 진단을 업그레이드하기 위한 새로운 접근 방식을 제공합니다. 실제로 나노 입자는 기존의 암 진단 및 치료의 단점을 해결할 뿐만 아니라 종양 진단 및 치료를 위한 새로운 관점과 첨단 장치를 만들 수 있습니다. 그러나 나노입자에 대한 연구는 대부분 in vivo 및 in vitro 단계에 머물고 있으며, 나노입자에 대한 임상 연구는 극히 소수에 불과하다. 이 리뷰에서 우리는 먼저 암 진단 및 치료에
