삼지구엽초 유래 플라보놀 배당체인 이카리인(ICA)은 심장보호, 항산화, 항염증 특성을 나타내지만, 낮은 수용성, 빠른 청소율, 낮은 경구 생체이용률로 고통받습니다. 우리는 숙신산 무수물 매개 에스테르화를 통해 친수성 폴리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르(mPEG) 접합체(mPEG-ICA)를 합성하고, 투석을 통해 자유 ICA를 폴리머에 캡슐화하여 ICA 탑재 mPEG-ICA 나노입자(NP)를 제조했습니다. 푸리에 변환 적외선 분광법(FT-IR)과 양성자 핵자기 공명(¹H-NMR)이 성공적인 접합을 확인했습니다. 동적 광산란(DLS)은 평균 수동적 직경 220 ± 13.7 nm, 제타 전위 +2.30 ± 1.33 mV를 나타냈으며, 투과 전자 현미경(TEM)은 균일한 구형 형태를 보여주었습니다. pH 7.4 인산염 완충 염수(PBS)에서 나노입자는 72시간 동안 52.8 ± 1.7% ICA를 방출했으며, pH 6.8에서는 48시간 내 75.7 ± 0.2%로 방출이 가속화되었습니다. 체외에서 NPs는 H9c2 세포 생존율을 보존하고, 젖산 탈수소효소(LDH) 누출을 감소시키며, 리포폴리사카라이드(LPS) 유도 세포자멸사를 억제했습니다. 또한, 친염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 mRNA 수준이 현저히 억제되었습니다. 이러한 결과는 ICA 탑재 mPEG-ICA NPs가 LPS 매개 심근 손상 완화를 위한 유망한 나노의약 플랫폼임을 입증합니다.
심근 손상 후 심장 리모델링은 주로 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-18을 통한 지속적인 염증 신호 전달에 의해 주도됩니다. 이들 사이토카인은 산화 스트레스, 섬유아세포 활성화, 심근세포 세포자멸사를 유발하여 궁극적으로 심장 기능을 손상시킵니다. 이카리인(C₃₃H₄₀O₁₅)은 전임상 모델에서 면역조절, 항산화, 항세포자멸사 효과가 광범위하게 보고되었으나, 소수성, 빠른 전신 청소, 낮은 경구 흡수로 치료 잠재력이 제한됩니다. 미셀, 리포좀, 폴리머 나노입자 등 나노캐리어 시스템은 약물 용해도 향상, 순환 시간 연장, 향상된 투과성 및 보유(EPR) 효과를 활용한 염증 심장 조직으로의 표적 전달을 위한 효과적인 전략으로 부상했습니다.
폴리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르(mPEG)는 선형 PEG에 비해 우수한 친수성, 생체적합성, 최소 면역원성을 제공합니다. 에스테르 결합을 통해 ICA를 mPEG-COOH에 공유 결합시킴으로써, 우리는 나노입자로 자기조립 가능한 친수성-소수성 양친매질을 생성합니다. 에스테르 결합은 산에 불안정하여, 염증 심근의 특징인 약산성 미세환경(pH ≈ 6.8)에서 ICA의 pH 반응성 방출을 가능하게 합니다. 본 연구는 mPEG-ICA 합성, 나노입자 내 ICA 캡슐화, 물리화학적 특성 분석, 체외 방출 프로파일링, LPS 유도 손상에 대한 H9c2 세포에서의 심장보호 효능 평가를 상세히 다룹니다.
주요 분석 기기로는 JA302 전자저울, RE52CS-1 회전증발기, 78HW-1 자기교반기, 101-OA 열풍건조기, NEXUS670 FT-IR 분광계, UV-Vis 분광광도계, TEM Glacios, JP-010S 초음파분산기, 실시간 qPCR 시스템, 효소연결형 형광분석기, 올림푸스 도립현미경, 라이카 형광현미경, 써모 CO₂ 인큐베이터 등이 사용되었습니다.
분석급 시약은 상업적 공급업체로부터 조달했습니다: 이카리인(95%, 1 g, DL070208), LPS(55 mg, Sigma, Z06J9Y52452), mPEG-Me(250 g, Sigma, MKBT7172), 디클로로메탄(500 mL, 시노팜), 4-디메틸아미노피리딘(100 g, 알라딘), N-하이드록시석시니미드(100 g, 루이용), FastKing cDNA 합성 키트(티안젠), 비윤천 세포자멸사 키트, SYBR Green qPCR 키트(QIAGEN) 등.
mPEG(5 g), 숙신산 무수물(0.40 g), DMAP(0.50 g)을 50 mL 디클로로메탄에서 60°C, 2시간 환류 반응시켰습니다. 혼합물을 증발시키고, 생성된 백색 고체를 물에 대해 48시간 투석(2 kDa MWCO)하여 정제했습니다. 동결건조 생성물로 mPEG-COOH를 얻었습니다.
mPEG-COOH(0.37 g)를 NHS(0.024 g)와 DMAP(0.026 g)로 10 mL 무수 DMSO에서 활성화한 후, 5 mL 무수 DMSO에 녹인 100 mg ICA와 질소 분위기 하 실온에서 48시간 반응시켰습니다. 물에 대한 광범위한 투석과 동결건조 후 mPEG-ICA 폴리머를 얻었습니다.
mPEG-ICA(5 mg)를 2 mL DMSO에 녹이고 5 mg ICA를 DMSO에 녹인 것과 혼합한 후, 5 mL 증류수를 첨가했습니다. 실온에서 15분 교반 후, 혼합물을 투석(3500 Da MWCO)하여 24시간 동안 빈번한 물 교체로 처리한 후 여과하여 ICA 탑재 mPEG-ICA NP를 얻었습니다.
시료를 KBr과 혼합하여 펠릿으로 압착하고, 4000-4400 cm⁻¹ 범위에서 스캔하여 작용기 변환을 확인했습니다.
시료를 DMSO-d₆에 녹여 500 MHz NMR 분광계로 분석하여 에스테르화와 일치하는 화학적 이동을 확인했습니다.
270 nm에서 ICA 검정 곡선을 생성하고, 이 곡선을 사용하여 폴리머와 나노입자의 농도를 정량화했습니다.
동결건조 후 물에 재분산시킨 시료의 입자 크기 분포와 제타 전위를 Zetasizer 3000hs로 측정했으며, 각 시료를 3회 반복 분석했습니다.
1.0 mg/mL NP 현탁액을 탄소 코팅 구리 그리드에 올리고 2% 인산텅스텐산으로 염색한 후 80 kV에서 이미징했습니다.
NP를 5% 만니톨과 동결건조 후 물에 재분산시키고 크기/PDI를 모니터링하여 보관 안정성을 평가했습니다.
UV-Vis 흡광도를 사용하여 약물 적재량(EE%)과 포장 효율(LC%)을 계산했습니다: EE = NP 내 약물 질량 / NP 총 질량 × 100%; LC = NP 내 약물 질량 / 초기 약물 질량 × 100%.
NP를 37°C, 100 rpm 교반 하에서 pH 7.4 또는 6.8의 25 mL PBS에 넣었습니다. 정해진 간격으로 시료(2 mL)를 채취하고 신선한 배지로 대체한 후, 270 nm에서 UV-Vis로 분석했습니다. 누적 방출(%)을 표준 방정식으로 계산했습니다.
H9c2 쥐 심근아세포를 37°C/5% CO₂에서 DMEM + 10% FBS로 배양했습니다. 세포를 96웰 플레이트(웰당 10⁴ 세포)에 접종하여 생존율, LDH, 세포자멸사, qPCR 분석에 사용했습니다.
세포를 다섯 그룹으로 나누었습니다: (1) 대조군(무처리), (2) LPS(10 µg/mL) 24시간, (3) ICA(20 µM) + LPS, (4) mPEG-ICA 폴리머(20 µM) + LPS, (5) ICA 탑재 mPEG-ICA NP(20 µM) + LPS.
24시간 처리 후 0.5 mg/mL MTT를 4시간 첨가했습니다. 포르마잔을 DMSO에 녹여 570 nm에서 흡광도를 측정했습니다.
배양 상청액의 LDH 활성을 상업용 키트로 정량화했으며, 490 nm에서 흡광도를 읽었습니다.
Hoechst 33342(1 µg/mL)로 15분 염색 후 형광현미경으로 핵 형태를 관찰했습니다. 세포자멸사 지수 = 세포자멸사 핵/총 핵 × 100%.
TUNEL 키트로 DNA 단편화를 검출했습니다; 녹색 형광의 세포자멸사 핵을 총 DAPI 염색 핵에 상대적으로 계수했습니다.
Annexin V-FITC/PI 이중 염색을 수행하고, 유세포 분석으로 초기 및 후기 세포자멸사 집단을 정량화했습니다.
TRIzol로 RNA를 추출하고, 역전사한 후 Bio-Rad CFX96 시스템에서 SYBR Green으로 증폭했습니다. TNF-α, IL-1β, IL-6, 액틴(내부참조)의 유전자 발현을 액틴으로 정규화했습니다. 프라이머 서열은 원본 원고에 나열되어 있습니다.
FT-IR 스펙트럼은 1700 및 1740 cm⁻¹에서 특징적인 에스테르 카르보닐 흡수를 보여 성공적인 접합을 확인했습니다. ¹H-NMR은 12.6 ppm에서 페놀성 하이드록실 신호, 7.5 ppm에서 방향족 양성자, 3.5 ppm에서 PEG 사슬의 메틸렌 양성자를 보여 ICA와 mPEG 모이티의 존재를 확인했습니다.
핵심 폴리머 NP는 평균 145 ± 15.2 nm(PDI = 0.277)였으나, ICA 탑재 NP는 220 ± 13.7 nm(PDI = 0.119)로 확장되었습니다. 제타 전위는 탑재 후 +0.44 ± 0.26 mV에서 +2.30 ± 1.33 mV로 이동하여 콜로이드 안정성 향상을 나타냈습니다. TEM 이미지는 구형의 균일한 형태를 확인했습니다(Fig. 2).
UV-Vis 분석 결과, ICA 탑재 NP의 약물 적재량 21.9 ± 0.013%, 포장 효율 54.9 ± 0.032%로, 폴리머 단독 NP(적재량 16.5%, EE 41.3%)보다 우수했습니다. 이 값들은 원하는 치료 탑재량과 일치합니다.
5% 만니톨로 동결건조 후 재분산된 NP는 255 nm(PDI = 0.326)로 크기가 약간 증가했으나 허용 가능한 균일성을 유지하여 보관 안정성을 확인했습니다(Fig. 3).
pH 7.4 PBS에서 자유 ICA가 12시간 내 77.2% 방출된 반면, mPEG-ICA NP는 72시간 동안 44.1% 방출되었습니다. ICA 탑재 NP는 중성 pH에서 72시간 동안 52.8%, pH 6.8에서 48시간 내 75.7% 방출되어 pH 반응성 가속 방출을 반영했습니다(Fig. 4).
MTT 분석 결과, 20 µM에서 ICA, mPEG-ICA, ICA 탑재 NP의 세포독성은 없었습니다. LPS 노출 후 생존율이 50.0%(대조군 = 100%)로 떨어졌습니다. ICA, mPEG-ICA, ICA 탑재 NP 처리로 생존율이 각각 55.9%, 61.0%, 65.4%로 회복되었습니다(p < 0.05)(Fig. 5, 6).
LDH 분석에서는 LPS 처리 후 효소 누출이 유의하게 증가했으며, ICA, mPEG-ICA, ICA 탑재 NP가 LDH 방출을 현저히 감소시켰고, ICA 탑재 NP에서 가장 두드러진 효과를 보였습니다(Fig. 7).
Hoechst 33342 염색에서 LPS 처리 세포는 크로마틴 응축과 단편화를 보였으며, ICA 탑재 NP가 세포자멸사 형태를 유의하게 완화했습니다(Fig. 8). TUNEL 분석으로 세포자멸사율을 정량화: LPS가 47.6% 세포자멸사를 유도했으며, 이는 ICA 35.5%, mPEG-ICA 26.5%, ICA 탑재 NP 17.9%로 감소했습니다. 유세포 분석이 이러한 결과를 뒷받침했으며, LPS에서 총 세포자멸사 35.9% 대 ICA 탑재 NP 16.7%, mPEG-ICA 19.2%를 보였습니다(Fig. 9-10).
RT-qPCR 결과, LPS가 TNF-α, IL-1β, IL-6 전사체를 현저히 증가시켰습니다. ICA, mPEG-ICA, ICA 탑재 NP 처리로 이들 사이토카인이 억제되었으며, ICA 탑재 NP가 가장 실질적인 하향 조절을 달성했습니다(Fig. 11).
이러한 발견은 ICA 탑재 mPEG-ICA NP가 염증 심근에 ICA를 직접 전달함으로써 산화 스트레스, 세포자멸사, 염증성 사이토카인 생성을 감소시켜 향상된 심장보호를 제공함을 확인합니다.
우리는 하이브리드 화학-물리적 접근법으로 ICA 탑재 mPEG-ICA 나노입자를 성공적으로 제조했으며, 이는 ICA 용해도, 적재 용량, 지속적 pH 반응성 방출을 현저히 개선했습니다. LPS 자극 H9c2 세포에서 이들 NP는 세포 생존율을 회복시키고, LDH 누출을 완화하며, 세포자멸사를 억제하고, 친염증성 사이토카인 발현을 자유 ICA나 폴리머 단독보다 더 효과적으로 억제했습니다. 데이터는 ICA 탑재 mPEG-ICA NP가 염증성 심장 손상 치료를 위한 표적 나노의약으로서의 잠재력을 지지합니다.
나노물질
초록 나노기술은 모든 과학 분야에 중요한 응용을 가진 가장 유망한 연구 분야가 되었습니다. 최근 몇 년간 주석 산화물은 나노미터 범위에서 이 물질의 합성으로 향상된 매혹적인 특성들로 인해 엄청난 주목을 받아왔습니다. 오늘날 주석 산화물 나노입자를 생산하기 위해 수많은 물리적, 화학적 방법이 사용되고 있습니다. 그러나 이러한 방법들은 비용이 많이 들고, 높은 에너지를 필요로 하며, 합성 과정에서 다양한 독성 화학물질을 사용합니다. 인간 건강과 환경 영향에 대한 우려가 증가함에 따라 비용 효율적이고 환경 친화적인 생산 공정의 개발이 이
초록 전통적인 암 치료제는 다양한 부작용과 표적 종양에 대한 불충분한 손상으로 비판받아 왔습니다. 나노입자의 돌파구는 전통적 치료와 진단을 업그레이드하는 새로운 접근법을 제공합니다. 실제로 나노입자는 전통적 암 진단과 치료의 단점을 해결할 뿐만 아니라 종양 진단과 치료를 위한 완전히 새로운 관점과 최첨단 장치를 창출합니다. 그러나 대부분의 나노입자 연구는 생체 내외 실험 단계에 머물러 있으며, 나노입자에 대한 임상 연구는 극소수만 보고되었습니다. 본 리뷰에서는 먼저 나노입자의 암 진단 및 치료 분야 현재 응용을 요약합니다. 이후 나
