DNA 사면체 전달은 HT-29 결장암 세포의 독소루비신 유도 세포자멸사를 강화합니다

방법

리젠트 및 장비

DNA 올리고뉴클레오티드 사슬은 중국 다롄에 있는 TAKARA에서 구입했습니다. Dulbecco의 변형 이글 배지(DMEM)와 태아 소 혈청은 미국 NY의 Gibco에서 구입했습니다. 페니실린과 스트렙토마이신은 중국 상하이의 Beyotime biotechnology에서 구입했습니다. 엽산, 독소루비신, 3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2-H -테트라졸륨 브로마이드(MTT) 및 아가로즈는 미국 미주리주에 있는 Sigma-Aldrich에서 구입했습니다. 모든 항체는 중국 상하이의 Abcam Company에서 구입했습니다. 다른 시약은 중국 상하이에 있는 Sinopharm Chemical Regent Co., Ltd.에서 구입했습니다.

UV-Vis 분광광도계(Thermo Evolution 201) 및 항온 인큐베이터는 미국 Thermo Fisher에서 구입했습니다. 원심 분리기(GT10-1)는 Beijing Era Beili Centrifuge Co., Ltd.에서 구입했습니다. 형광 분광 광도계(UV-1800)는 Shimadzu Corporation에서 구입했습니다. 공초점 레이저 스캐닝 현미경(Visitech)은 Leica 회사에서 구입했습니다. 중합효소 연쇄 반응 장치(PCR, T100), 단백질 전기영동 및 핵산 전기영동 장치는 Bio-Rad Company에서 구입했습니다. 동적 광 입자 크기 분석기는 Beckman Company에서 구입했습니다. 96-웰 또는 24-웰이 있는 세포 배양 플레이트는 Dow Corning Corporation에서 구입했습니다. C18 컬럼이 있는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, Agilent 1200)는 Agilent Technologies에서 구입했습니다.

인간 결장암 세포주 HT-29는 37°C에서 95% 공기와 5% 이산화탄소를 포함하는 습한 분위기에서 10% 소 태아 혈청, 100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 유지되었습니다. .

DNA 사면체의 합성 및 정제

이 조사에서 합성은 그림 1의 도식적인 절차를 따랐고 DNA 사면체의 단일 가닥 DNA(ssDNA) 서열도 그림 1에 제공되었습니다. 구체적으로, 각각의 ssDNA를 0.5x TE 완충액에 용해시키고, DNA의 상응하는 광학 밀도(OD) 값을 260nm에서 UV 분광 광도계로 측정하였다. 동일한 농도에서 4개의 사슬을 만들기 위해 추가 TE 버퍼를 보충했습니다. 4개의 ssDNA의 혼합 비율은 100μL 중 1μM에서 1:1:1:1이었습니다. 반응은 95°C, 10분, 4°C로 자연 냉각된 순환 조건으로 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기계에서 수행되었습니다. 모든 단일 가닥 DNA는 특징적인 흡수 피크로 260nm를 사용하여 HPLC로 정제되었습니다. HPLC 스펙트럼에서 DNA tetra의 피크 시간은 단일 가닥의 피크 시간보다 빠르며 해당 시점에 생성물이 수집되었습니다.

엽산-DNA 테트라-독스, DNA 테트라-독스 및 엽산-DNA 테트라의 개략도. DNA 사면체의 단일 가닥 DNA 서열이 제공되었습니다. 종양 세포를 표적으로 삼아 세포막을 관통하여 DNA를 삽입하는 과정을 묘사했습니다.

엽산-DNA 테트라-독스의 합성 및 특성화

Dox 및 엽산의 유리 수소 그룹은 azide 그룹으로 변형된 다음 클릭 화학 반응을 통해 ssDNA의 3'-OH와 결합됩니다[21]. 상이한 양의 작용기 태깅된 ssDNA를 첨가할 때, 작용기의 비율은 측쇄의 특이적 혼성화를 통해 화학량론적으로 제어될 수 있다. 엽산-DNA 테트라 합성을 위해 엽산과 DNA 사면체의 몰비는 1:1로 설정하였다. DNA tetra-Dox의 합성을 위해 Dox와 DNA tetrahedron의 몰비는 4:1로 설정하였다. folic acid-DNA tetra-Dox의 합성을 위해 folic acid, DNA tetrahedron 및 Dox의 몰비는 각각 1:1:3으로 설정하였다. 모든 합성은 37°C에서 마이크로몰 수준에서 수행된 다음 4°C에서 보관되었습니다[22].

이 연구에서 일련의 DNA 테트라 복합체는 순도와 상대적 분자 크기를 확인하기 위해 8% 분리 겔(39% Acr-Bis)을 사용한 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)으로 특성화되었습니다. 샘플은 2:1의 혼합 비율로 서로 다른 DNA 테트라 구조와 6x 로딩 버퍼로 구성되었습니다. 샘플은 110V에서 90분 동안 겔 전기영동 후 염색 및 분석되었습니다. 입자 크기의 차이를 파악하기 위해 DNA tetra 샘플도 동적 광이 있는 동적 광산란(DLS) 기기로 스캔했습니다.

DNA 테트라 촉진 세포 흡수

본 연구에서 설계된 다양한 결합 구조에 대해 HT-29 세포의 흡수율을 비교하여 약물 전달 효율을 파악하였다. 세포 흡수 효율은 Dox의 특징적인 형광 스펙트럼, 즉 470nm의 여기광 및 590nm의 방출광을 활용하여 평가 및 정량화되었습니다. 2×10 ⁵ 의 HT-29 셀 /mL를 24웰 플레이트에 접종하고 24시간 동안 배양했습니다. 세포를 다른 24시간 동안 10μM에서 다양한 DNA 테트라 구조와 함께 인큐베이션했습니다. 그 다음 배지를 버리고 세포를 PBS로 3회 헹구었다. 세포 고정을 위해 즉시 상온에서 4% 파라포름알데히드를 첨가하여 30분 동안 동시 배양하고, 세포를 PBS로 다시 3회 세척하였다. 마지막으로 24-well plate를 레이저 공초점 현미경으로 관찰하여 방출광의 광도에 따른 세포 흡수 효율을 비교했습니다.

세포독성 및 항암 효율성

세포 독성 및 항암 효율은 DMSO의 MTT와 세포 내 석시네이트 탈수소 효소 사이에 산화 환원 반응이 일어나는 MTT 분석을 사용하여 평가되었습니다. HT-29 세포를 96웰 배양 플레이트에 파종하고 24시간 동안 배양했습니다.

약물 운반체로서의 DNA tetra의 세포 독성을 위해 0-100μM 농도의 DNA tetra 구조를 포함하는 배지를 추가하여 24시간 또는 48시간 배양했습니다. 그런 다음 100μL의 MTT 용액(5mg/mL)을 각 웰에 첨가하고 혼합물을 37°C에서 4시간 동안 인큐베이션했습니다. 그런 다음 액체를 제거하고 세포를 용해하고 200μL DMSO로 용해했습니다. 상층액의 흡광도는 Microreader로 570nm에서 측정되었습니다. 처리되지 않은 HT-29 샘플을 대조군으로 간주하였다.

엽산 또는 Dox와 결합된 DNA 사면체의 경우 한쪽에서는 안정성, 생물학적 안전성 및 억제 효율에 중점을 두고 연구했습니다. 한편, Dox of DNA tetra-Dox가 이전과 유사한 항종양 특성을 갖는지 여부도 조사되었습니다. 따라서, DNA 테트라 복합체의 세포독성 및 항종양 효율을 평가하였다. 각각 100μM의 복합체를 HT-29 세포와 함께 배양했습니다. 세포 샘플을 6시간마다 수집한 다음 MTT 분석으로 검출하여 배양 기간의 영향을 평가했습니다. 특히 구조의 변화에 ​​따른 항암효과의 차이에 주목했다. 또한, 엽산-DNA tetra-Dox 처리 후 HT-29 억제에 대한 농도 효과는 MTT 분석을 통해 0–200μM에서 평가되었습니다.

서부 오점 및 유세포 분석

DNA tetra 전달에 의해 촉진되는 Dox에 의해 유도된 세포 사멸을 특성화하기 위해 처리된 세포의 단백질 샘플을 열분해 액체를 사용하여 가열 및 균열하고, 샘플을 분리하기 위해 100V, 정전류 조건에서 12% SDS-PAGE로 분석한 다음, 블롯팅했습니다. 1시간 동안 0.22μm 직경의 PVDF 멤브레인으로 샘플을 탈지유로 1시간 동안 차단했습니다. PBST로 3회 세척한 후, 샘플을 토끼 항-카스파제-3과 함께 밤새 인큐베이션하였다. 그런 다음 샘플을 염소-항-토끼 IgG 2차 항체로 1시간 동안 프로브한 다음 PBST로 세척하고 Bio-Rad 단백질 이미징 시스템을 통해 이미지화했습니다. 또한 GAPDH는 세포에서 안정적으로 발현되기 때문에 내부 참조 단백질로 선택되었습니다.

MTT 분석을 통해 선택된 농도 및 시점에서 세포자멸사 수준을 정량화하기 위해 유세포 분석이 추가로 활용되었습니다. HT-29 세포를 일정 기간 동안 억제제와 함께 배양한 다음 Annexin V-PI 이중 염색 방법을 사용하여 정량적 유세포 분석을 통해 측정했습니다.

세포 증식 정량화

세포 계수 방법은 시간에 따른 세포 증식을 정량화하는 데 사용되었습니다. 구체적으로 엽산-DNA tetra-Dox를 100μM에서 일정 시간 처리한 후 0.25% 트립신으로 30초 동안 세포를 소화시킨 후 동량의 완전배지를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 1000rpm에서 3분 동안 원심분리한 후 상층액을 버리고 세포를 완전 배지로 재현탁했습니다. 세포 증식 곡선을 그리기 위해 각 검출 지점의 세포 수를 세포 계수판을 사용하여 광학 현미경으로 기록했습니다.

통계 분석

이 연구에서 차이의 유의성은 Student's t를 사용하여 결정되었습니다. 검정(양측, 2-표본 등분산). 피 <0.05는 다른 그룹 간의 상당한 차이를 의미합니다.

결과

엽산-DNA 테트라-독스의 제조

특정 합성 과정에서 Dox는 Dox의 로딩 및 조립을 완료하기 위해 다른 비율로 DNA 사면체와 혼합됩니다(w _m =543.52) 및 엽산(w) _m =441.4). 도 2a에서 보는 바와 같이 Dox와 엽산은 분자량이 상대적으로 낮고 유사한 단량체이기 때문에 사면체의 DNA와 1개의 기능성 분자를 갖는 접합체는 거의 동등한 분자량을 갖는다. 그러나 4면체의 DNA 꼭짓점 4개 모두와 Dox 또는 folic acid가 결합하여 DNA tetra의 분자 크기가 분명히 증가했습니다. 그림 2b에서 볼 수 있듯이 대부분의 DNA 사면체 단량체 크기는 15nm 미만이었습니다. 커플링 그룹이 증가함에 따라 DNA tetra의 대칭 구조가 파괴되고 화합물의 입자 크기 매질이 크게 증가했습니다. 특히, folic acid-DNA tetra-Dox의 크기 확장으로 배지 직경이 20nm로 확장되었습니다.

다른 구성 요소를 가진 DNA tetra의 특성화. 아 왼쪽에서 오른쪽으로:8% SDS-PAGE에서 이미지화한 DNA 사다리, DNA 테트라, 엽산-DNA 테트라, 엽산-DNA 테트라-독스 및 DNA 테트라-독스. ㄴ 동적 광산란을 통해 검출된 DNA tetra, folic acid-DNA tetra, folic acid-DNA tetra-Dox 및 DNA tetra-Dox의 크기 분포

약물 전달 효율성

24시간 동안 다양한 DNA 테트라 구조와 함께 배양한 후 Dox의 세포내 효율성을 형광 이미징으로 평가했습니다. 여기서 세포내 적색 형광은 Dox의 특징적인 형광입니다. 따라서 DNA tetra와 함께 배양된 세포는 그림 3a와 같이 형광 신호를 나타내지 않았으며 folic acid-DNA tetra-Dox 및 DNA tetra-Dox 복합체로 배양된 세포의 빨간색 신호는 Dox보다 분명히 높았습니다. DNA tetra로 인한 Dox의 현저하게 향상된 세포 흡수 효율은 막을 통한 침투를 촉진할 뿐만 아니라 Dox와 DNA tetra 간의 접합체의 세포내 안정성을 촉진합니다.

24시간 동안 다른 복합체와 함께 배양한 후 HT-29 세포의 흡수 효율. 아 공초점 현미경 검사(빨간색은 Dox의 형광 여기광, 눈금 막대 =10μm). ㄴ 세포 형광의 강도. **피 <0.05 DNA 테트라 그룹과 비교할 때

형광 강도의 추가 정량 분석(그림 3b)은 시각적 발견을 입증했으며 엽산-DNA 테트라-독스와 DNA 테트라-독스 복합체(P <0.05). 약물과 세포의 동시 배양 방법론은 엽산의 표적화 능력의 완전한 전시를 방해합니다. 상대적으로 높은 농도는 엽산 수용체의 특이적 인식을 확인했으며, 이는 이론적으로 복잡한 순환 시스템이 있는 생체 내 적용에서 더 분명합니다. 간단히 말해서 DNA tetra 전달은 Dox의 항암 효과를 보장합니다.

세포독성 및 항암 효율성

먼저, 다양한 농도의 DNA 테트라와 함께 배양된 HT-29 세포의 생존력을 MTT 분석을 사용하여 조사했습니다. 24시간 및 48시간 동안 0-100μM에서 HT-29 세포에서 DNA 테트라 처리의 명백한 세포독성은 없었습니다(그림 4a). 따라서 나노 크기의 DNA 사면체는 생체에 안전한 약물 운반체 플랫폼을 제공했습니다.

HT-29 세포에 대한 Dox 복합체 및 DNA 테트라의 세포독성 및 항종양 효율. 아 24시간 또는 48시간 동안 다양한 농도의 DNA 테트라와 함께 배양된 HT-29 세포의 생존력. ㄴ 100μM에서 Dox 복합체의 항종양 효율. ㄷ 24시간 또는 48시간 동안 다양한 농도의 엽산-DNA 테트라-독스와 함께 배양한 HT-29 세포의 생존력

둘째, Dox 전달 효율의 차이로 인해 folic acid-DNA tetra-Dox와 DNA tetra-Dox가 48시간 이내에 더 큰 억제 효율을 나타냈습니다(그림 4b). 효과적인 항암 성분의 부족으로 인해, DNA 테트라-엽산은 48시간 공동 배양 동안 생존력의 무시할 수 있는 감소(<10%)를 초래합니다. Dox가 막을 객관적으로 투과할 수 없기 때문에 Dox에 의한 세포 생존율 감소는 다른 그룹보다 적습니다. 특히, The folic acid-DNA tetra-Dox는 배양 후 6시간에서 더 빠르고 유의한 감소를 보여 엽산 표적화가 약물이 막에 위치하도록 돕고 Dox가 더 적시에 효과를 나타내도록 합니다. 대조적으로, DNA tetra-Dox는 배양 후 12시간에 분명히 효과를 나타내기 시작하여 표적 그룹의 중요성을 보여주었습니다.

또한 HT-29 세포를 0-200μM의 folic acid-DNA tetra-Dox로 처리하여 유효 농도를 검출했습니다(그림 4c). HT-29 세포의 세포 생존율은 복합체의 농도(0-100μM)가 증가함에 따라 급격히 감소했지만 100과 200μM 농도 사이에는 유의한 차이가 없었으며, 이는 엽산-DNA 테트라-아미노산의 용량 의존적 방식을 나타냅니다. Dox, 여기서 100μM은 항종양 효과를 위한 효과적인 농도로 간주될 수 있습니다. 또한 10, 20, 50μM 그룹에서 세포 생존율이 24시간에서 48시간으로 크게 변화하여 배양 기간도 엽산-DNA 테트라-독스 기반 항암 효율에 영향을 미치는 요인임을 나타냅니다.

엽산-DNA 테트라독스에 의해 유도된 세포자멸사

따라서 Western blot assay(Fig. 5a)를 통해 folic acid-DNA tetra-Dox와 DNA tetra-Dox에 의해 유도된 caspase-3의 발현이 유의하게 증가하였고, 이는 apoptosis가 Dox의 주된 방법임을 증명하였다. 유도된 세포 사멸.

다른 복합체(a ) 및 DNA tetra, Dox, DNA tetra-Dox 및 folic acid-DNA tetra-Dox(b –이 )

유세포 분석(그림 5b-e)은 100μM에서 엽산-DNA 테트라-독스와 함께 6시간 배양하면 68.7%의 세포자멸사를 유도한다는 것을 추가로 입증했습니다. 한편, Dox와 DNA tetra-Dox에 의해 유도된 apoptosis 수준은 동일한 배양 조건에서 32.8%와 60.5%에 불과했습니다.

세포 증식 억제

MTT 분석에 따르면 100μM이 세포자멸사 유도에 효과적인 농도였으며 세포 증식 실험에서 선택되었습니다. 세포 증식 곡선(Fig. 6)에서 볼 수 있는 바와 같이, 시간이 많이 걸리는 세포 흡수 과정으로 인해 세포 증식 억제는 동시 배양 초기 단계에서 완전히 나타나지 않았습니다. folic acid-DNA tetra-Dox와 함께 6시간 이상 배양한 후 상당한 억제 효과가 나타났으며, 이는 DNA tetra-enhanced endocytosis의 존재를 입증했습니다. 한편, 6h는 Fig. 4b에서 검출된 유효기간과의 비교기간이다.

다양한 기간 동안 100μM의 엽산-DNA 테트라-독스 배양으로 유도된 세포 증식 억제