리토콜산 기능화 금 나노입자, 간암 세포에서 선택적 아폽토시스 유도

초록

금 나노입자(AuNPs)는 생체적합성, 광학적 특성, 약물 전달 잠재력으로 잘 알려져 있습니다. 본 연구에서는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 스페이서와 리토콜산(LCA) 리간드를 카르복실산 결합을 통해 도입하여 AuNP@MPA‑PEG‑LCA를 제조했습니다. 세포독성 실험 결과, 이 나노입자는 다수의 간세포암 세포주(HepG2, SMMC‑7721)의 증식을 현저히 억제하면서 정상 간세포(QSG‑7701)와 유방암 세포(MCF‑7)에는 거의 영향을 주지 않는 탁월한 선택성을 보였습니다. 핵 응축(Hoechst 33342), 안넥신 V‑FITC 결합, 미토콘드리아 막 전위 감소(JC‑1), 아크리딘 오렌지/에티디움 브로마이드(AO/EB) 염색을 통해 아폽토시스 유발이 확인되었습니다. 나노입자는 활성산소종(ROS) 축적을 유도하여 미토콘드리아 기능 장애와 프로그램된 세포사를 초래했습니다. 이러한 결과는 AuNP@MPA‑PEG‑LCA가 간암 표적 나노치료제로서 큰 가능성을 지니고 있음을 보여줍니다.

배경

금 나노입자는 독특한 광학 공명, 화학적 안정성, 넓은 표면적 덕분에 약물 전달, 영상, 광열 치료 등 생물의학 분야에서 매력적인 소재로 주목받아 왔습니다[1–5]. 구형 구조는 효율적인 세포 내 섭취를 돕고 표적 외 효과를 최소화합니다[6–8]. 표적 리간드나 고분자로 기능화하면 치료 지수를 더욱 높일 수 있으며, 특히 종양학 분야에서 유망합니다[9–14].

이차 담즙산인 리토콜산(LCA)은 아폽토시스를 통해 간암에 강력한 항종양 활성을 나타내는 것으로 보고되었습니다[29–30]. 천연 분자로서 LCA는 AuNPs를 간 조직으로 유도하고 용해도를 개선하며 세포 내 신호 전달 경로를 조절하는 리간드 역할을 할 수 있습니다[20–28].

AuNPs의 생체적합성과 LCA의 종양 억제 특성을 결합하면, ROS 매개 미토콘드리아 경로를 활용해 간세포암 세포에서 선택적으로 아폽토시스를 유도하는 항암제를 개발할 수 있을 것으로 기대됩니다.

연구 방법

재료

별도 표기 없는 모든 시약은 Sigma‑Aldrich에서 구입했습니다. 세포 배양 시약(RPMI‑1640, FBS)은 Invitrogen 제품입니다. 인간 간세포암 세포주(HepG2, SMMC‑7721), 정상 간세포(QSG‑7701), 유방암 세포(MCF‑7)는 상하이 생명과학연구원에서 분양받았습니다.

AuNP@MPA 합성

시트르산 캡핑 AuNPs(평균 직경 4.0 ± 0.5 nm)는 HAuCl₄와 NaBH₄를 이용한 터케비치 법[38]으로 합성했습니다. 이후 pH 11에서 3‑메르캅토프로피온산(MPA)으로 캡핑하여 후속 결합을 위한 카르복실기를 도입했습니다.

PEG 결합

AuNP@MPA(0.0875 mmol)를 NHS(0.0875 mmol)와 EDC(0.035 mmol)로 50 mM MES 버퍼에서 활성화한 뒤, NH₂‑PEG₁₀₀₀‑NH₂(0.045 mmol)를 첨가했습니다. 25 °C에서 24시간 반응 후 원심분리로 PEG화 나노입자(AuNP@MPA‑PEG)를 분리했습니다.

리토콜산 부착

AuNP@MPA‑PEG에 LCA(0.045 mmol)를 무수 DMF에 녹여 25 °C에서 24시간 교반했습니다. 최종 산물인 AuNP@MPA‑PEG‑LCA는 반복 원심분리로 정제했습니다.

투과전자현미경(TEM) 분석

JEOL JEM‑200CX TEM(200 kV)으로 입자 형태와 크기를 관찰했습니다. 나노입자 현탁액을 300 메시 구리 그리드에 떨어뜨려 건조시킨 후 촬영했습니다.

세포독성 실험

AuNPs(0.2–1.0 mg mL⁻¹)에 48시간 노출된 후 MTT 분석법으로 세포 생존율을 측정했습니다. 흡광도는 Tecan Infinite M200 플레이트 리더로 570 nm에서 기록했습니다.

아폽토시스 형태 관찰(Hoechst 33342)

HepG2 세포를 0.5 mg mL⁻¹ AuNP@MPA‑PEG‑LCA로 24시간 및 48시간 처리한 뒤, 10 µg mL⁻¹ Hoechst 33342로 30분 염색했습니다. 핵 형태는 Leica‑SP8 공초점 현미경으로 촬영했습니다.

초기 아폽토시스 확인(Annexin V‑FITC)

0.5 mg mL⁻¹ AuNP@MPA‑PEG‑LCA로 6시간 처리한 HepG2 세포를 안넥신 V‑FITC로 염색 후 유세포분석기(FACSCalibur, BD)로 분석했습니다. 공초점 이미지도 함께 획득했습니다.

미토콘드리아 막 전위(MMP) 측정

JC‑1 염료(10 µg mL⁻¹)로 AuNP@MPA‑PEG‑LCA 처리(6시간) 후 HepG2 세포의 MMP 변화를 측정했습니다. 유세포분석과 공초점 현미경을 병행했습니다.

활성산소종(ROS) 정량

0.5 mg mL⁻¹ AuNP@MPA‑PEG‑LCA에 6시간 노출된 HepG2 세포에서 H₂DCF‑DA(10 µM)로 세포 내 ROS를 정량했습니다. 형광 강도는 유세포분석기와 공초점 현미경으로 측정했습니다.

결과 및 고찰

나노입자 특성 분석

AuNP@MPA‑PEG‑LCA는 구형을 유지하며 평균 직경 16.0 ± 1.2 nm로, TEM에서 확인되었습니다(그림 1c). PEG와 LCA 층으로 인해 코어 AuNP@MPA(4.0 nm)보다 수동적 크기가 증가했습니다. 이 크기는 종양 조직에서 향상된 투과성 및 잔류 효과(EPR)에 적합합니다.

AuNP@MPA‑PEG‑LCA 합성 개략도

TEM 이미지: a AuNP@MPA, b AuNP@MPA‑PEG, c AuNP@MPA‑PEG‑LCA

선택적 세포독성

MTT 분석(그림 2) 결과, AuNP@MPA는 모든 세포주에서 세포독성이 거의 없었습니다. 반면 AuNP@MPA‑PEG‑LCA는 HepG2와 SMMC‑7721 세포의 생존율을 농도 의존적으로 감소시켰으며, IC₅₀ 값은 0.6 mg mL⁻¹ 미만이었습니다. 정상 간세포(QSG‑7701)와 유방암 세포(MCF‑7)에는 미미한 영향만 보였습니다. 이러한 선택적 프로파일은 LCA가 부여한 표적 능력을 입증합니다.

HepG2, SMMC‑7721, QSG‑7701, MCF‑7 세포에 AuNP@MPA와 AuNP@MPA‑PEG‑LCA를 48시간 배양한 후 세포 생존율

아폽토시스 형태 변화

Hoechst 염색(그림 3)에서 AuNP@MPA‑PEG‑LCA 처리 HepG2 세포는 48시간에 걸쳐 핵 응축, 분열, 염색질 가장자리 이동이 진행되어 후기 아폽토시스 특징을 보였습니다. 대조군과 AuNP@MPA 처리군은 균일한 핵 형태를 유지했습니다.

Hoechst 33342로 염색한 HepG2 세포 핵 형태. a 0 h, b 24 h, c 48 h AuNP@MPA‑PEG‑LCA(0.5 mg mL⁻¹) 처리, d 48 h AuNP@MPA(0.5 mg mL⁻¹) 처리. 아폽토시스 세포는 핵 응축·분열과 세포 수축을 보임; 척도 막대 20 µm

Annexin V‑FITC 확인

Annexin V 염색(그림 4)에서 AuNP@MPA‑PEG‑LCA 처리 세포의 세포막 외엽으로 포스파티딜세린 전위가 명확히 나타났습니다. 유세포분석 결과 38.45%의 아폽토시스율을 보여 대조군(8.16%)과 뚜렷한 차이를 보였으며, 초기 아폽토시스 유발을 확인했습니다.

a 공초점 이미지, b 유세포분석 데이터. HepG2 세포를 AuNP@MPA‑PEG‑LCA(0.5 mg mL⁻¹)로 처리 후 안넥신 V‑FITC 염색(여기 488 nm, 방출 500–560 nm); 척도 막대 20 µm

미토콘드리아 탈분극

JC‑1 분석(그림 5)에서 처리군의 적색 집합체 형광 감소와 녹색 단량체 신호 증가가 관찰되어 MMP 붕괴를 시사했습니다. 유세포분석에서도 적색/녹색 비율이 유의하게 감소하여 미토콘드리아 기능 장애가 아폽토시스의 하위 사건임을 뒷받침했습니다.

a JC‑1 표지 세포 공초점 형광 이미지, b AuNP@MPA‑PEG‑LCA의 MMP 영향 유세포분석 결과

ROS 생성

H₂DCF‑DA 염색(그림 6)에서 AuNP@MPA‑PEG‑LCA 처리 HepG2 세포의 녹색 형광이 현저히 증가하여 ROS 생성이 촉진됨을 보여주었습니다. 유세포분석 정량 결과도 같은 경향을 보였으며, 산화 스트레스가 미토콘드리아 탈분극과 아폽토시스에 앞서 발생함을 시사합니다.

AuNP@MPA‑PEG‑LCA 6시간 처리 후 HepG2 세포 ROS 생성 분석. a 공초점 현미경(여기 488 nm, 방출 530 nm), b 유세포분석(여기 488 nm, 방출 525 nm)

결론

직경 약 16 nm의 AuNP@MPA‑PEG‑LCA 나노입자를 성공적으로 제조했으며, 간세포암 세포의 성장을 선택적으로 억제하여 아폽토시스를 유도함을 확인했습니다. 핵 형태, 안넥신 V 결합, JC‑1 MMP 감소, ROS 증가 등 종합적인 실험을 통해 치료 기전이 ROS 유도 미토콘드리아 기능 장애를 매개로 함을 입증했습니다. 이러한 결과는 AuNP@MPA‑PEG‑LCA가 간암 치료를 위한 유망한 표적 나노의약품임을 시사합니다.

약어

AuNPs:

금 나노입자

DMF:

디메틸포름아미드

EDC:

1-(3‑디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 염산염

FBS:

태아소혈청

H₂DCF‑DA:

2′,7′‑디클로로플루오레신 디아세테이트

HepG2:

인간 간세포암 세포

JC‑1:

5,5′,6,6′‑테트라클로로‑1,1′,3,3′‑테트라에틸벤지이미다졸카르보시아닌 아이오다이드

LCA:

리토콜산

MCF‑7:

인간 유방암 세포

MES:

4‑모르폴린에탄설폰산

MMP:

미토콘드리아 막 전위

MPA:

3‑메르캅토프로피온산

MTT:

3-(4,5‑디메틸‑2‑티아졸릴)-2,5‑디페닐테트라졸륨 브로마이드

NHS:

1‑하이드록시피롤리딘‑2,5‑디온

PEG:

폴리에틸렌 글리콜

PS:

포스파티딜세린

QSG‑7701:

인간 정상 간세포

ROS:

활성산소종

SMMC‑7721:

인간 간세포암 세포

TEM:

투과전자현미경