기능화된 금 나노입자(AuNPs)는 생체적합성이 좋고 약물 반감기가 길며 생체 활성이 크기 및 표면의 변형된 리간드와 관련되어 있어 많은 분야에서 널리 적용되고 있습니다. 여기에서 우리는 카르복실 그룹(AuNP@MPA-PEG-LCA)으로 연결된 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 리토콜산(LCA)을 소유한 리간드로 덮인 AuNP를 합성했습니다. 우리의 세포 독성 결과는 AuNP@MPA-PEG-LCA가 더 나은 세포 선택성을 가지고 있음을 나타냅니다. 즉, 다발성 간암 세포의 성장을 다른 암세포 및 정상 세포보다 효과적으로 억제할 수 있습니다. Apoptosis는 AuNP@MPA-PEG-LCA 억제 세포 증식에 역할을 하며, 이는 핵 염색, annexin V-FITC, 미토콘드리아 막 전위(MMP) 분석 및 AO/EB 염색 실험과 같은 일부 세포자멸 지수 실험에 의해 설득력 있게 입증되었습니다. . 가장 강력한 AuNP@MPA-PEG-LCA는 미토콘드리아 기능 장애를 매개하는 활성산소종(ROS)을 통해 세포자멸사를 효율적으로 유도하는 것으로 확인되었습니다. 그리고 AuNP@MPA-PEG-LCA는 간암 세포의 예정된 세포 사멸을 촉진하는 데 더 효과적일 수 있습니다.
<섹션 데이터-제목="배경">금 나노입자(AuNPs)는 나노물질의 독특한 광학적 특성, 우수한 화학적 안정성, 생체적합성 때문에 많은 분야에서 널리 응용되고 있다[1,2,3,4,5]. 따라서 나노 전자 공학, 나노 포토닉스, 촉매 작용, 센서, 바이오 마커 및 기타 많은 영역에서 광범위한 응용 가능성이 있습니다 [6,7,8]. AuNPs는 표면적이 크고 구형이기 때문에 항종양 약물의 담체로 사용될 수 있다[9,10,11,12]. 또한, 많은 AuNP 복합체가 암 치료를 위한 새로운 유형의 항종양 약물에 주로 사용되어 왔다[13, 14]. 항종양 약물 운반체로서 AuNP 복합체는 세포 기능을 제어하고 유전자 발현을 조절하며 세포 내 분석 물질을 검출할 수 있습니다[15, 16]. 따라서 기능화된 AuNPs의 개선은 암 치료 연구에서 중요한 경향 중 하나가 된다[17,18,19].
리토콜산(LCA)은 담즙의 고등 척추동물 2차 담즙산에 널리 존재합니다. 담즙산 종 다양성은 담즙산 결핍, 담석 및 담석의 치료에 사용될 수 있는 것과 같이 의학 및 일부 기타 분야에서 다양한 종류의 담즙산 및 그 유도체의 적용에서 보고되었습니다[20,21,22]. 간 질환 [23,24,25]. 그리고 일부 담즙산 및 그 유도체는 약물 운반체로 간 질환 치료, 흡수 촉진제 및 콜레스테롤 저하제를 표적으로 할 수 있습니다. [26,27,28]. 이전 보고서에서는 LCA가 간암 세포에서 매우 강력한 항종양 효과를 가지고 있으며 세포 사멸 메커니즘이 세포자멸사임을 입증했습니다[29, 30]. 아폽토시스는 생물학적 세포의 활성 사멸 과정으로 다세포 유기체가 신체 발달을 조절하고 세포 노화를 조절하며 내부 환경을 안정적으로 유지하는 중요한 기전이다[31, 32]. 특히 종양치료의 목적은 증식억제, 분화억제, 악성도 감소, 종양세포의 세포자멸사 촉진이다[33,34,35,36,37].
이 연구에서 우리는 금 NP와 LCA 유도체를 결합하여 생물학적 표적 특성을 가진 AuNP를 합성했습니다. 우리는 48시간 동안 HepG2, SMMC-7721, QSG-7701, MCF-7 세포에 MTT 방법을 사용하여 세포 독성을 연구했습니다. 우리의 세포 독성 결과는 AuNP@MPA-PEG-LCA가 다른 암세포 및 정상 세포보다 다발성 간암 세포의 성장을 더 효과적으로 억제할 수 있음을 보여주었습니다. Apoptosis는 Hoechst 33342 염색, annexin V-FITC 염색, MMP(mitochondrial membrane potential) 분석, AO/EB 염색 실험을 통해 확인된 세포 증식 억제 역할을 합니다. 그리고 간암 세포에서 ROS 수준이 증가하여 AuNP@MPA-PEG-LCA가 ROS 생성 매개 미토콘드리아 기능 장애를 통해 세포 사멸을 유도할 수 있음을 시사합니다.
지정하지 않는 한 화학 물질은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)에서 구입하여 추가 정제 없이 사용했습니다. RPMI-1640 배지 및 태아 소 혈청(FBS)은 Invitrogen Corporation에서 구입했습니다. HepG2(인간 간세포 간암 세포), SMMC-7721(인간 간세포 간암 세포), QSG-7701(인간 정상 간세포) 및 MCF-7(인간 유방암 세포)은 Shanghai Institute for Biological Science( 중국 상하이).
평균 크기가 4.0nm인 구연산염으로 덮인 금 나노입자(AuNP@MPA)는 J. Turkevich et al.에 의해 개척된 방법에 따라 준비되었습니다. [38]. 간단히 말해서, 773μl의 38.8mM 시트르산나트륨 용액과 2mL의 15mM HAuCl4 용액을 30mL의 Milli-Q H2에 용해했습니다. O, 용액을 25°C에서 교반했습니다. 그런 다음 0.1M의 NaBH4 3mL (갓 준비한) 추가되었습니다. 25°C에서 2시간 동안 반응한 후 용액은 무색에서 밝은 주황색으로 변했습니다. 그런 다음 pH 11에서 무수 에탄올에 0.01M의 3-메르캅토프로피온산(MPA) 3mL를 첨가하고 25°C에서 2시간 동안 반응을 유지했습니다. 반응 혼합물을 원심분리하여 화합물 AuNP@MPA를 얻었다.
10.5mg(0.0875mmol) 1-히드록시피롤리딘-2,5-디온(NHS) 및 7mg(0.035mmol) 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염(EDC)을 50mM AuNP@MPA 용액에 첨가했습니다. 4-모르폴린에탄설폰산(MES) 및 용액을 25°C에서 30분 동안 교반했습니다. 그런 다음 0.045mmol NH2 -PEG1000-NH2 를 첨가하고 혼합물을 25℃에서 24시간 동안 교반하였다. 반응이 완료되면 혼합물을 원심분리하여 화합물 AuNP@MPA-PEG를 얻었다.
초순수에 녹인 화합물 AuNP@MPA-PEG를 17mg(0.045mmol) LCA가 포함된 200μL 무수 디메틸포름아미드(DMF) 용액에 첨가하고, 반응 용액을 25℃에서 24시간 동안 교반하였다. 반응이 완료되면 반응 혼합물을 원심분리하여 화합물 AuNP@MPA-PEG-LCA를 얻었다.
AuNP의 형태와 크기는 최대 200kV에서 작동하는 JEOL JEM-200CX TEM에서 감지되었습니다. AuNP 솔루션을 구리 그리드(300메쉬)에 떨어뜨렸습니다.
우리는 변형된 3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5 -디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 방법. 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/mL의 AuNP와 원래의 금 나노입자(AuNP@MPA)가 분석에 사용되었습니다. 각 웰의 OD570은 Tecan Infinite M200 다중 모드 플레이트 리더에서 측정되었습니다.
AuNP@MPA-PEG-LCA(0.5mg/mL)로 24시간 및 48시간 후, HepG2 세포를 세포 배양기에서 30분 동안 Hoechst 33342 10μg/mL로 염색했습니다. 세포핵의 형태는 Leica-SP8 공초점 현미경으로 검출되었습니다.
AuNP@MPA-PEG-LCA(0.5mg/mL)로 6시간 후, HepG2 세포를 세포 배양기에서 10분 동안 annexin V-FITC로 염색한 다음 Leica-SP8 공초점 현미경으로 관찰했습니다.
AuNPs의 유세포 분석기 검출을 위해 AuNP@MPA-PEG-LCA(0.5mg/mL) 처리 6시간 후 HepG2 세포를 세포 배양기에서 10분 동안 annexin V-FITC로 염색하고 FACSCalibur 유세포 분석기로 검출했습니다. (Becton Dickinson &Co., Franklin Lakes, NJ).
37°C에서 6시간 동안 AuNP@MPA-PEG-LCA(0.5mg/mL)로 처리된 HepG2 세포를 10μg/mL JC-1(5,5',6,6'-테트라클로로-1,1 ',3,3'-테트라에틸벤즈이미다졸릴카르보시아닌 요오드화물, 분자 프로브) 37°C에서 10분 동안 이후에 FACSCalibur 유세포 분석기로 세포를 검출했습니다.
형광현미경 관찰을 위해 HepG2 세포를 AuNP@MPA-PEG-LCA로 10분 동안 10μg/mL JC-1 처리하고 Leica-SP8 공초점 현미경으로 관찰했습니다.
세포내 ROS의 축적은 2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트(H2 DCF-DA). AuNP@MPA-PEG-LCA 샘플(0.5mg/mL)을 6시간 동안 처리한 HepG2 세포는 10μM의 H2와 함께 인큐베이션되었습니다. 37°C에서 30분 동안 DCF-DA 그리고 FACSCalibur 유세포분석기와 공초점현미경을 이용하여 세포의 형광강도를 관찰하였다.
먼저 수용성 AuNP@MPA를 준비하였다(Scheme 1). 그림 1a는 AuNP@MPA의 TEM 결과를 보여줍니다. AuNP@MPA의 모양과 크기는 4.0 ± 0.5 nm의 컴팩트한 크기로 매우 유사한 구형으로 나타남을 알 수 있다. 그런 다음 AuNP@MPA-PEG-LCA를 준비했습니다(도식 1). 그리고 입자의 형태도 TEM으로 분석하였다(Fig. 1c). TEM 이미지는 AuNP@MPA-PEG-LCA의 형태가 AuNP@MPA의 형태와 유사함을 묘사했습니다. 그리고 AuNP@MPA-PEG-LCA의 직경은 통계 분석을 통해 ~ 16nm였습니다.
<그림>
AuNP@MPA-PEG-LCA 합성의 개략도
<그림>
a의 TEM 이미지 AuNP@MPA, b AuNP@MPA-PEG 및 c AuNP@MPA-PEG-LCA
AuNP의 세포 독성을 조사하기 위해 HepG2, SMMC-7721, QSG-7701 및 MCF-7 세포를 선택하고 AuNP와 AuNP@MPA로 48시간 동안 처리했습니다. 그리고 시료의 세포독성을 검출하기 위해 MTT assay를 사용하였다. 서로 다른 세포에서 AuNPs와 AuNP@MPA의 세포 생존율이 그림 2에 나와 있습니다. 결과는 AuNP@MPA의 세포 독성이 모든 세포에서 매우 낮음을 시사했습니다. 그러나 AuNP@MPA-PEG-LCA는 나노입자 농도를 증가시키면 다발성 간암 세포의 성장을 보다 효과적으로 억제할 수 있지만 정상 세포 및 기타 암세포에 대한 손상은 적습니다. 즉, AuNP@MPA-PEG-LCA의 HepG2 및 SMMC-7721 세포에 대한 항증식 활성은 QSG-7701 및 MCF-7 세포에 비해 매우 높았다.
<그림>
HepG2, SMMC-7721, QSG-7701 및 MCF-7 세포와 48시간 배양된 AuNP@MPA 및 AuNP@MPA-PEG-LCA(AuNP)의 세포 생존율
Apoptotic nuclei는 apoptosis의 일반적인 지표입니다. AuNP@MPA-PEG-LCA로 표시된 시간 동안 처리한 후 Hoechst 33342로 세포를 배양했습니다. 그런 다음 공초점 현미경을 사용하여 세포 핵의 형태적 특성을 관찰했습니다. 그림 3에서 볼 수 있듯이 대조군 세포와 AuNP@MPA로 배양된 세포는 온전하고 균일한 세포 핵 염색을 나타냅니다. 그러나 AuNP@MPA-PEG-LCA를 처리한 HepG2 세포의 세포 사멸 세포의 수는 배양 시간이 증가함에 따라 점진적으로 증가하고 세포 핵은 핵 분열, 염색질 응축, 세포 부피 감소와 같은 전형적인 세포 사멸 특성을 나타냅니다.
<그림>
Hoechst 33342로 염색한 HepG2 세포의 세포 핵의 형태적 특성. HepG2 세포를 a 동안 AuNP@MPA-PEG-LCA(0.5mg/ml)와 함께 배양 0시, b 24시간, c 48시간, d AuNP@MPA(0.5mg/ml)를 48시간 동안 배양했습니다. 아폽토시스 세포는 핵이 응축되고 단편화되어 있으며 세포 부피가 축소되었습니다. 스케일 바 20μm
우리 모두 알고 있듯이, annexin V 염색은 괴사 세포와 세포 사멸의 초기 단계를 구별할 수 있습니다. 세포 사멸의 초기 단계에서 annexin V는 원형질막의 내부에서 외부 표면으로 외부화되는 막 인지질 포스파티딜세린(PS)에 결합할 수 있습니다[39]. 따라서 우리는 annexin V-FITC 염색 분석을 통해 AuNP@MPA-PEG-LCA의 세포 사멸을 유도할 가능성을 조사했습니다. 도 4a에 나타난 바와 같이 대조군의 세포막에는 뚜렷한 녹색 형광이 없었으나 AuNP@MPA-PEG-LCA를 처리한 HepG2 세포의 세포막에는 명백한 녹색 형광이 있었다. 이 현상은 초기 단계의 세포사멸의 강력한 지표입니다. 우리 모두 알다시피, 공초점 현미경의 이미지는 세포 사멸의 발생을 증명했을 뿐입니다. 그러나 유세포 분석은 세포 사멸의 발생을 빠르고 민감하게 측정하고 세포 사멸 속도를 정확하게 결정할 수 있습니다. 따라서 우리는 유세포 분석을 사용하여 세포 사멸 단계를 추가로 조사했습니다. 그림 4b는 유세포 분석에 의한 세포자멸사 비율의 결과를 보여줍니다. AuNP@MPA-PEG-LCA를 처리한 HepG2 세포의 세포 사멸 비율은 약 38.45%였으나 대조군 세포의 세포 사멸 비율은 약 8.16%였다. apoptosis의 상당한 비율은 AuNP@MPA-PEG-LCA와 함께 배양된 세포가 apoptosis를 지속했음을 시사합니다.
<그림>
a의 아폽토시스 결과 공초점 이미지 및 b AuNP@MPA-PEG-LCA(0.5 mg/ml)로 처리된 HepG2 세포의 유세포 분석 데이터. 세포는 annexin V-FITC(488 nm에서 여기 및 500–560 nm에서 방출)로 염색되었습니다. 스케일 바 20μm
미토콘드리아는 시토크롬 C 및 세포사멸 유도 인자와 같은 세포사멸 촉진 인자를 방출할 수 있기 때문에 세포사멸에서 중요한 역할을 합니다[40,41,42]. 그래서 공초점현미경과 유세포분석기를 이용하여 MMP의 변화를 알아보았다. 그림 5a는 공초점 현미경으로 AuNP@MPA-PEG-LCA로 처리한 JC-1 표지된 HepG2 세포의 형광 이미지를 보여줍니다. 우리는 JC-1 응집의 현재를 나타내는 대조군 HepG2 세포에 명백한 적색 JC-1 형광과 건강한 미토콘드리아가 있음을 관찰할 수 있습니다. 그러나 AuNP@MPA-PEG-LCA로 처리된 HepG2 세포에서 더 많은 녹색 형광이 있어 막의 붕괴가 발생했음을 나타냅니다. 세포 사멸 세포에서 미토콘드리아 파괴는 JC-1이 미토콘드리아 내부에 축적되지 않고 세포 전체에 분포한다는 것을 나타냅니다. 그리고 단량체 형태로 존재하는 흩어진 JC-1은 녹색을 띤다. MMP의 변화를 더 정량화하기 위해 우리는 유세포 분석법으로 JC-1로 염색된 HepG2 세포를 평가했습니다. AuNP@MPA-PEG-LCA로 처리된 HepG2 세포 및 유세포 분석에 의한 대조군 세포에 기록된 대표적인 JC-1 적색/녹색 비율 신호는 그림 5b에 나와 있습니다. JC-1 염색 세포의 정량 분석에서 red/green의 비율이 AuNP@MPA-PEG-LCA로 처리된 세포에서 유의하게 감소한 반면 대조군 세포에서는 유의하게 증가했음을 관찰할 수 있어 AuNP@ MPA-PEG-LCA는 HepG2 세포에서 세포자멸사를 유도할 수 있습니다.
<그림>
아 공초점 현미경 및 b로 본 JC-1 표지된 세포의 형광 이미지 유세포 분석으로 분석한 MMP에 대한 AuNP@MPA-PEG-LCA의 효과
우리 모두 알다시피, 세포 사멸은 세포 내 ROS 수준의 증가로 유발될 수 있으며, 이는 또한 세포 사멸 유도와 관련된 강력한 증거입니다[43]. 미토콘드리아 기능 장애가 ROS 생성과 관련이 있는지 추가로 조사하기 위해 H2로 염색된 HepG2 세포에서 ROS 수준을 결정했습니다. 공초점 현미경과 유세포 분석을 사용하여 DCF-DA. 그림 6a와 같이 H2의 녹색 형광 강도는 DCF-DA는 대조군 세포와 비교하여 AuNP@MPA-PEG-LCA로 처리된 HepG2 세포에서 상당한 증가를 보여줍니다. 즉, AuNP@MPA-PEG-LCA를 처리한 HepG2 세포에서 ROS의 함량이 유의하게 증가하였다. 그런 다음 세포 내 ROS 함량의 정량적 분석을 유세포 분석으로 조사했습니다. 도 6b에 나타난 바와 같이, AuNP@MPA-PEG-LCA로 배양한 세포에서 대조군 세포에 비해 더 높은 형광 강도가 검출되었으며, 이는 AuNP@MPA-PEG-LCA를 처리한 세포에서 ROS 함량이 더 높음을 나타냅니다. . 데이터는 미토콘드리아 기능 장애가 아마도 ROS 생성과 관련이 있음을 시사했습니다. 이러한 결과는 AuNP@MPA-PEG-LCA가 apoptosis를 유도하는 데 ROS의 생성이 중요한 역할을 함을 예비적으로 나타냅니다.
<사진>
HepG2 세포를 AuNP@MPA-PEG-LCA로 6시간 동안 처리한 후 ROS 생성 분석. HepG2 세포의 ROS 함량은 a에 의해 조사되었습니다. 공초점 현미경(488 nm에서 여기 및 530 nm에서 방출) 및 b 유세포 분석(488 nm에서 여기 및 525 nm에서 방출)
요약하면, 우리는 다중 간암 세포의 성장을 억제할 수 있는 평균 직경 16.0nm의 AuNP@MPA-PEG-LCA를 합성했습니다. AuNP@MPA-PEG-LCA는 세포자살로 인한 세포의 증식을 효과적으로 억제하였으며, 이는 핵염색, JC-1 염색, MMP 분석 및 annexin V-FITC 염색 실험을 통해 입증되었습니다. 유세포 분석 연구에서 간암 세포에서 AuNP@MPA-PEG-LCA 정지는 세포 사멸 행동을 추가로 증명합니다. 따라서 AuNP는 ROS 매개 미토콘드리아 기능 장애를 통해 세포 사멸을 효율적으로 유도할 수 있으며 예비 기계 연구에서 간암 세포에서 프로그램된 세포 사멸을 촉진하는 데 더 효과적입니다.
금 나노 입자
디메틸포름아미드
1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염
태아 소 혈청
2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트
인간 간세포 간암 세포
5,5',6,6'-테트라클로로-1,1',3,3'-테트라에틸벤즈이미다졸릴카르보시아닌 요오드화물
리토콜산
인간 유방암 세포
4-모르폴린에탄설폰산
미토콘드리아 막 전위
3-메르캅토프로피온산
3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드
1-히드록시피롤리딘-2,5-디온
폴리에틸렌 글리콜
포스파티딜세린
인간의 정상 간세포
활성 산소 종
인간 간세포 간암 세포
투과전자현미경
나노물질
초록 파킨슨병(PD)은 중뇌에서 도파민성 뉴런의 점진적인 소실을 특징으로 하며, 줄기 세포 이식 방법은 치료를 위한 유망한 전략을 제공합니다. 이러한 연구에서 생체 내 이식된 세포의 생물학적 행동을 추적하는 것은 줄기 세포 기능에 대한 기본 이해와 임상 효과 평가에 필수적입니다. 본 연구에서 우리는 열분해 방법과 2단계 개질을 통해 폴리아크릴산(PAA)과 메톡시폴리에틸렌글리콜아민(PEG)으로 코팅된 새로운 초소형 초상자성 산화철 나노입자를 개발했습니다. USPIO-PAA/PEG NP는 TEM 및 FTIR에서 볼 수 있듯이 10.0
용접 셀 로봇이 널리 보급됨에 따라 로봇 회사는 고객의 눈을 사로잡기 위해 다음 대단한 것을 제시하기 위해 떠들고 있습니다. KUKA가 제공하는 제품은 새로운 KUKA flexible CUBE입니다. KUKA flexibleCUBE 용접 셀은 치열해지는 경쟁과 제조 생산에 대한 수요 증가에 대한 KUKA의 해답이었습니다. 회사는 수요에 부응하기 위해 모듈식 로봇 용접 셀을 생산하기로 결정했습니다. 이 로봇 용접 셀은 자동화가 간단해졌습니다. KUKA는 이 시스템이 간단하고 매끄럽게 제조 공정에 통합되도록 설계했습니다. 시스템은
